作为骨肉瘤诊治靶标的miRNA的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物医药领域，涉及miR-4714-3p在诊治骨肉瘤中的用途。
【背景技术】
[0002] 骨肉瘤是来源于间叶组织的恶性肿瘤，其主要致病特征为体内增殖的肿瘤细胞直 接形成未成熟骨或骨样组织。是一种人类骨骼系统最常见的原发性恶性肿瘤。典型的骨肉 瘤是一种罕见的（占全部恶性肿瘤的0.2%)高致癌恶性肿瘤，其发病率约每年每一百万人 里有三例。骨肉瘤主要出现在较长的骨骼以及少部分的软组织。其主要发病人群集中在10 ~20岁青少年，具有发病率高，早期转移率高，治愈生存率低等特点。X-射线，断层摄影技 术，核磁共振，血管造影技术以及动态骨闪烁摄影技术等广泛应用于该病的诊断、肿瘤发生 的程度及手术类型判断等等。但是利用上述临床手段进行骨肉瘤的诊断，常常导致患者的 病情延误，错过最佳治疗时期。因此寻找一种骨肉瘤早期诊断标志物是亟待解决的问题。
[0003] miRNA是天然存在于体内的21-22nt的非编码RNA分子，是一类通过转录后基因沉 默对靶基因表达进行调节的RNA。据估计，生物体内约有1 /3的基因受mi RNA的调控。mi RNA与 RISC的复合体通过碱基配对可与靶基因 mRNA5 ' -UTR或者3 ' -UTR中的互补序列相结合，抑制 蛋白质翻译，或是引发mRNA降解，从而负调控靶基因的表达。
[0004] 检测miRNA的表达水平可以为疾病的临床诊断提供参考。而miRNA的异常表达直接 导致一些与疾病发生相关基因的表达异常，诱发疾病的发生。已有报道证明miRNA可以通过 调控靶基因 mRNA的表达，在疾病发生、发展及转移中发挥重要作用。在未来临床治疗中， miRNA不仅可以成为新的疾病早期诊断和疾病进程相关的标记物，而且也有望通过改变 miRNA的表达或者其靶基因的表达治疗疾病。寻找和鉴定与疾病发生相关的miRNA及其靶基 因为miRNA的临床治疗提供基础。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的之一在于提供一种可用于早期诊断骨肉瘤的微小RNA标记物。
[0006] 本发明的目的之二在于提供上述微小RNA的用途。
[0007] 为了实现上述目的，本发明采用了如下技术方案：
[0008] 本发明提供了一种微小RNA在制备骨肉瘤诊断工具中的应用，所述微小RNA选自以 下组：初始miRNA、前体miRNA、成熟miRNA;初始miRNA能在人细胞内被剪切并表达成成熟 miRNA;前体miRNA能在人细胞内被剪切并表达成成熟miRNA;所述微小RNA是miR-4714_3p。
[0009] 应当知道，本发明的微小RNA包括组成型核酸分子的功能等同物，即变体，其显示 完整微小RNA核酸分子相同的功能，尽管它们通过核苷酸残基的缺失、置换或者插入而突 变。
[0010]本领域人员应该了解，为了保证微小RNA的稳定性，可以在微小RNA的一端或者两 端增加保护性碱基，如TT，也可对微小RNA碱基进行修饰，但是上述修饰不影响微小RNA的功 能。因此，本领域技术人员熟知，在不影响miR-4714-3p功能的条件下，对miR-4714-3p进行 碱基修饰或者在两端增加碱基获得的序列同样包含在本发明的保护范围之内。
[0011] 在本发明的一些具体的实施方式中，所述miR-4714-3p是成熟miR-4714-3p。
[0012] 虽然在某些【具体实施方式】中所使用的是成熟miRNA，但是本领域技术人员可以预 期，初始miRNA、前体miRNA将可以获得与成熟miRNA同样的技术效果，因为细胞有能力进一 步将初始miRNA、前体miRNA加工为成熟miRNA。
[0013] 本发明的微小RNA核酸分子可以以单链或双链的形式存在。成熟miRNA主要呈单链 形式，而前体miRNA是部分自互补的，以形成双链结构。本发明的核酸分子可以是RNA、DNA、 PNA、LNA的形式。
[0014] 进一步，上述诊断工具包括但不限于，芯片、试剂盒、试纸、高通量测序平台。所述 诊断工具包括用于检测样本中miR-4714-3p的表达水平的试剂。
[0015] 进一步，所述样本的来源包括但不限于血液、尿液、泪液、唾液、组织液、脑脊液、汗 液。在本发明的具体实施方案中，所述样本的来源是血液。
[0016] 进一步，所述试剂盒包括针对miR-4714-3p的引物和/或探针;所述芯片包括固相 载体；以及固定在所述固相载体上的寡核苷酸探针，所述寡核苷酸探针包括特异性地对应 于miR-4714-3p的部分或全部序列;所述试纸包括针对miR-4714-3p的引物和/或探针;所述 高通量测序平台包括针对miR-4714-3p的引物和/或探针。
[0017] 本发明提供了一种骨肉瘤的诊断工具，所述诊断工具包括检测样本中miR-4714-3p表达水平的试剂。
[0018] 进一步，所述样本的来源包括但不限于血液、尿液、泪液、唾液、组织液、脑脊液、汗 液。在本发明的具体实施方案中，所述样本的来源是血液。
[0019] 进一步，所述诊断工具包括试剂盒、芯片、试纸、高通量测序平台。
[0020] 进一步，所述试剂盒包括针对miR-4714-3p的引物和/或探针;所述芯片包括固相 载体；以及固定在所述固相载体上的寡核苷酸探针，所述寡核苷酸探针包括特异性地对应 于miR-4714-3p的部分或全部序列;所述试纸包括针对miR-4714-3p的引物和/或探针;所述 高通量测序平台包括针对miR-4714-3p的引物和/或探针。
[0021] 进一步，所述试剂盒中的针对miR-4714-3p的引物和/或探针还可包括针对现有技 术中已经报道的可用于检测前面所述的微小RNA表达水平的引物和/或探针。将多种微小 RNA的检测引物和/或探针放置在同一试剂盒中通过检测多种微小RNA指标联合诊断骨肉瘤 的情况也包含在本发明的保护范围之内。
[0022]进一步，所述芯片上固定的所述寡核苷酸探针还可包括针对现有技术中已经报道 的可用于检测miR-4714-3p的表达水平的寡核苷酸探针。将多种miRNA的检测探针放置在同 一芯片上通过检测多种miRNA指标联合诊断骨肉瘤也包含在本发明的保护范围之内。
[0023]进一步，所述固相载体包括所述固相载体可采用基因芯片领域的各种常用材料， 例如但不限于尼龙膜，经活性基团（如醛基、氨基等)修饰的玻片或硅片、未修饰的玻片、塑 料片等。
[0024]所述的mi RNA芯片的制备可采用本领域已知的生物芯片的常规制造方法，例如，如 果固相载体采用的是修饰玻片或硅片，探针的5'端含有氨基修饰的聚dT串，可将寡核苷酸 探针配制成溶液，然后采用点样仪将其点在修饰玻片或硅片上，排列成预定的序列或阵列， 然后通过放置过夜来固定，就可得到本发明的miRNA芯片。如果核酸不含氨基修饰，则其制 备方法也可参照：王申五主编的《基因诊断技术-非放射性操作手册》；J.L.erisi， V.R.Iyer,P.O.BROWN.Exploring the metabolic and genetic control of gene expression on a genomic scale.Science，1997;278:680和马立人，蒋中华主编·生物芯 片.北京:化学工业出版社，2000，1-130。
[0025] 本发明的miR-4714-3p可以是天然的或是人工合成的，或者使用可以表达miR-4714-3p的DNA片段的载体转染细胞获得。所述载体包括病毒载体、真核载体。
[0026] 病毒载体可以是任何适当的载体，包括但不限于逆转录病毒载体、腺病毒载体、腺 病毒相关病毒载体、疱疹病毒(例如单纯疱疹病毒、痘苗病毒及EB病毒)载体、甲病毒载体。
[0027] 真核表达载体可以是任何适当的表达载体，包括但不限于pCMV-Myc表达载体、 pcDNA3.0表达载体、pcDNA3.1表达载体、pEGFP表达载体、pEF Bos表达载体、pTet表达载体、 pTRE表达载体、或者在公知表达载体的基础上经改造的载体，比如pBin438、pCAMBIA1301 等。
[0028] 可以表达微小RNA的DNA片段可以通过如下方式获取:从miRNA数据库中（http:// microrna. sanger .ac .uk/sequences/)寻找微小RNA在基因组上的位置及具体序列信息，根 据基因组序列确定初始miRNA的位置，在初始miRNA位置的上下游500-800bp区间内设计特 异性引物，扩增引物中间的序列即可获得表达微小RNA的DNA片段。
[0029] 本发明中使用的"微小RNA"与"miRNA"、"miR"通用。
[0030] 本发明中使用的"诊断骨肉瘤"包括对骨肉瘤的预判，即判断受试者是否存在患有 骨肉瘤的风险，也包括对骨肉瘤的诊断，即判断受试者是否已经患有骨肉瘤，也包括对骨肉 瘤预后的判断，即判断受试者是否存在复发的可能性或者判断受试者已经复发。
[0031] 本发明的优点和有益效果：
[0032] 本发明首次发现了 miR-4714-3p与骨肉瘤相关，通过检测受试者miR-4714-3p的表 达，可以判断受试者是否患有骨肉瘤、或者判断受试者是否存在患有骨肉瘤的风险，从而指 导临床医师给受试者提供预防方案或者治疗方案。
[0033]本发明发现了一种新的分子标记物-miR-4714-3p，相比传统的检测手段，微小诊 断更及时、更特异、更灵敏，能够实现骨肉瘤的早期诊断，从而降低骨肉瘤的死亡率。
【附图说明】
[0034]图1显示利用高通量测序方法检测miR-4714-3p在正常人和骨肉瘤患者血液中的 含量；
[0035] 图2显示利用QPCR检测miR-4714-