一种鸡生长性能选育分子标记ghr基因及其应用
【技术领域】
[0001 ]本发明涉及动物分子育种的基因工程技术，特别是一种鸡生长性能选育分子标记 GHR基因及其应用技术。
【背景技术】
[0002] 生长激素受体(GHR)处于GH-GHR-IGF轴上，通过介导生长激素(GH)来调控IGFs的 表达，从而在体内起着重要的调节生长发育的作用。GH和GHR结合可调控动物生长，具有调 节营养分配、促进蛋白合成、减少脂肪沉积、促进骨骼肌肉生长、提高动物生长速度和饲料 报酬等功能，并参与动物免疫、生殖、泌乳等生理功能和代谢的调节。
[0003] GHR为动物正常发育所必需。GH在促进动物生长、发育等代谢过程中起重要作用， 而其发挥生理作用的第一步是与靶细胞膜表面的GHR结合，由GHR介导将信号传入细胞内从 而产生一系列的生理效应，因此组织中GHR量的多少及功能的正常与否将会影响GH生理效 应的发挥。而GH作用于GHR，产生IGF-1，IGF-1作用于多种类型的细胞，促进细胞的分裂，促 进DNA复制和蛋白质的合成。尽管动物的许多组织器官都产生IGF-1，但血液中的IGF-1主要 来源于肝脏，因此肝脏GHR在此起关键性作用。
[0004] 在GHR基因的研究中，人的LTD矮小症、性连锁矮小鸡是两个研究得比较透彻的因 GHR基因突变导致生长缓慢和矮小的例子，肝脏缺乏有效的GHR，或是GHR基因的突变，使得 GH和GHR的有效结合匮乏，导致生长轴作用通路的中断，最终导致IGF-1水平低下，即使血浆 GH浓度明显高于正常鸡，生长仍然受到阻碍，从而SLD鸡的体型明显低于正常鸡个体。
[0005] 改善动物的生长性能是家畜品种改良的重要目标。分子标记从本质上揭示遗传变 异及其变异规律，在动物的育种中发挥了越来越重要的作用，为动物DNA分子标记辅助选择 奠定了一定的基础。在畜禽育种过程中，找到与畜禽生长速度相关的分子标记，对畜禽育种 有着重要的意义。因此，探索GHR基因对家禽生长性能的影响，可为优质家禽的品种改良和 选育提供一定的理论依据。
【发明内容】
[0006] 鉴于以上研究背景，本发明利用云南特有的武定鸡和大围山微型鸡为研究材料， 采用目标区域深度重测序的方法，结合生物信息学分析，筛选和鉴定与大围山微型鸡和武 定鸡生长性能相关SNP位点，并进行分子标记，在GHR基因内含子5上筛选到与体重有显著相 关的571A/G位点，并以此位点作为分子标记对鸡的选育进行辅助选择，为云南本土鸡的选 育提供重要的科学借鉴。
[0007] 本发明的目的是提供一种鸡生长性能选育分子标记GHR基因，通过设计特异性引 物克隆了大围山微型鸡和武定鸡GHR基因编码区的全长序列（CDS)，如SEQ.ID.N0.1和 SEQ. ID.NO. 2，GenBank登陆号分别为KC242242和KC242241;并按照克隆出来的CDS序列预测 了GHR基因编码区的蛋白质序列，氨基酸序列如SEQ.ID.N0.3和SEQ.ID.N0.4。
[0008] 本发明的另一个目的是GHR基因作为鸡体重性状选育分子标记在在云南大围山微 型鸡体重性状选育中的应用，并采用PCR-RFLP方法，检测GHR基因内含子的多态性，并分析 了不同基因型与体重的关联性，即通过现代分子生物学技术筛选出与大围山微型鸡的体重 性状有显著相关性的571A/G位点，以此位点作为体重性状的分子标记对大围山微型鸡的选 育进行辅助选择。
[0009] 作为上述分子标记GHR基因的应用，本发明还公开了一种大围山微型鸡选育中遗 传改良的方法，在大围山微型鸡鸡群中，检测GHR基因内含子5上的571A/G位点(GHR基因第 75630位点），筛选GHR基因 mRNA表达量较高的个体，淘汰GHR基因 mRNA表达量较低的个体。
[0010] 本发明的有益效果：
[0011] 1、本发明通过设计特异性引物克隆了大围山微型鸡和武定鸡GHR基因编码区的全 长序列（CDS)，实现对大围山微型鸡和武定鸡的GHR基因进行完全测序，并探索云南本土鸡 种GHR基因上的突变位点，为云南本土鸡种提供一定的理论依据
[0012] 2、本发明采用目标区域深度重测序的方法，结合生物信息学分析，利用PCR-RFLP 技术对GHR基因进行多态性分析，筛选出与大围山微型鸡的体重性状有显著相关性的GHR基 因内含子5上的571A/G位点，并以此位点作为分子标记对鸡的体尺性状选育进行辅助选择， 为云南本土鸡的选育提供重要的科学借鉴。
[0013] 3、本发明还提供了一种大围山微型鸡选育中遗传改良的方法，可通过对GHR基因 分子标记的检测，检测GHR基因内含子5上的571A/G突变位点(GHR基因内含子5第571位点）， 筛选GHR基因 mRNA表达量较高的个体，淘汰GHR基因 mRNA表达量较低的个体。
【附图说明】
[0014] 图1、2为本发明GHR基因 GHR-intron2GG型测序图谱；
[0015] 图3、4为本发明GHR基因 GHR-intron2AA型测序图谱；
[0016] 图5为本发明GHR基因 GHR-intron5AA型测序图谱； 图6为本发明GHR基因 GHR-intron5GG型测序图谱； 图7为本发明GHR基因 GHR-intron5AG型测序图谱； 图8为本发明GHR基因 GHR-P1基因 TT型测序图谱； 图9为本发明GHR基因 GHR-P1基因 CT型测序图谱；
【具体实施方式】
[0017] 下面将结合本发明实施例和附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整 地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本 发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他 实施例，都属于本发明保护的范围。
[0018] 一、体重性状指标的测定
[0019] 本试验采用20周龄大围山微型鸡和武定鸡各100只，公母各半，进行体重测量。20 周龄武定鸡体重显著高于大围山微型鸡。
[0020] 表1不同品种鸡体重及体尺性状的比较分析
[0021]
[0022] 注:P.>0.05,差异不显著;0.01〈?〈0.05，差异显著;？〈0.01，差异极显著。
[0023] 二、血液激素水平指标样品采集
[0024]采血前均禁食12小时，于次日早晨进行翅静脉采血。制备血浆，检测GHR激素含量。 结果显示武定鸡血液中GHR激素含量高于大围山微型鸡。
[0025] 表2 20周龄微型鸡和武定鸡血浆中GHR激素含量
[0026]
[0027] 三、GHR基因 CDS区的克隆：
[0028] 1)提取武定鸡和大围山微型鸡肌肉组织总RNA，并反转录为cDNA。
[0029] 2)根据GenBank中原鸡（Gal lus gal lus)的GHR基因序列（GenBank登录号为： M74057，设计6对引物分别为:GHR-1、GHR-2和GHR-3，剩下的GHR-4、GHR-5和GHR-6，全部覆盖 了GHR基因的编码区（⑶S)全序列。
[0030] 表3 GHR基因引物信息
[0031]
[0033] 3)采用PCR扩增试剂盒扩增目标片段。
[0034] 4)采用UNIQ柱式DNA胶回收试剂盒纯化PCR目标产物DNA片段。
[0035] 6)对GHR基因进行扩增片段连接反应后，进行基因克隆质粒转化，取合格菌液进行 测序。
[0036] 7)大围山微型鸡和武定鸡GHR基因，PCR产物经纯化回收，克隆测序。测序结果通过 人工仔细核对碱基及其所对应的谱图，更正错误的碱基，经DNAStar分析软件比对并拼接碱 基序列。
[0037] 测序结果：
[0038] 以GenBank原鸡GHR基因（NM_001001293)mRNA为参考，根据本次测序结果比对和拼 接大围山微型鸡GHR基因的序列。将测序所得到的3个序列核对、校正和拼接完成大围山微 型鸡GHR基因 CDS区全序列1827bp，如SEQ.ID.N0.1，编码608个氨基酸，氨基酸序列如 SEQ. ID. N0.3。大围山微型鸡GHR基因 CDS区全序列成功提交GenBank，登陆号:KC242242。武 定鸡GHR基因 CDS区全序列1827bp，如SEQ.ID.N0.2,编码608个氨基酸，氨基酸序列如 SEQ. ID. N0.4。武定鸡GHR基因 CDS区全序列成功提交GenBank，登陆号:KC242241。
[0039] 通过大围山微型鸡GHR基因 CDS区（KC242242)、武定鸡GHR基因 CDS区（KC2422410与 鸡GHR基因（NM_001001293)mRNA全序列（参考序列)编码氨基酸比对结果显示，在GHR编码区 共检测到三个突变位点：GHR CDS 150C/G，GHR CDS152C/G及GHR CDS 1726G/ADGHR CDS 150 C/G，GHR⑶S152 C/G两个位点武定鸡和微型鸡之间相同，地方鸡种与NCBI参考基因序 列不同，这两个突变位点定性为品种间的差异，而不是影响微型鸡体型的主要突变位点。而 在微型鸡GHR编码区1726位点上发现一个由A替代G的SNP突变，GHR CDS 1726 G/A，该位点 为非同义突变，所编码的氨基端序列发生改变，由甘氨酸变为丝氨酸，武定鸡与NCBI参考基 因组相同，均为甘氨酸。该位点改变可能导致蛋白质结果发送改变，影响GH与GHR的结合活 性，从而导致生长轴信号通路改变。
[0040] 四、利用PCR-RFLP技术对GHR基因进行多态性分析
[0041 ] 1)提取血液基因组DNA，进行PCR实验。
[0042] 2)设计三对引物，分别位于GHR基因 intron-2 (GHR-intron 2)，intron-5 (GHR-intron 5)以及exon_3(GHR-P7)。
[0043] 表4 GHR基因引物信息
[0044]
[0045] 3)采用PCR扩增试剂盒扩增目标片段；