一种京海黄鸡300日龄产蛋数分子遗传标记及应用的制作方法
【专利摘要】本发明涉及家禽育种领域，涉及京海黄鸡京海黄鸡300日龄产蛋数分子遗传标记的应用。公开了Myf5基因京海黄鸡300日龄产蛋数分子遗传标记的应用。筛选应用时，取待测样本的鸡基因组DNA，经序列如SEQ?ID?NO：1-6所示的特异性引物扩增得到173、247和150bp的片段，目的片段经SSCP分析，凝胶电泳后用银染显色，得到3个DNA的SSCP图谱，根据3个图谱中的带型筛选基因型分别如图1中1、7、11的个体，即H1H3单倍型组合的个体。该选择的效果显著，检测方法简单快捷，且不受外界环境的影响，可以用于京海黄鸡300日龄产蛋数的分子遗传标记。
【专利说明】—种京海黄鸡300日龄产蛋数分子遗传标记及应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及家禽育种领域，具体涉及一种利用单倍型组合提高京海黄鸡300日龄产蛋数的方法。
【背景技术】
[0002]在鸡的繁殖性状中，产蛋数是一个重要的经济性状和重要指标，提高产蛋数能够给鸡场带来巨大的经济效益。而繁殖性状为数量性状，遗传力比较低，运用传统育种方法进展缓慢。运用候选基因法，鉴定分离出与这些性状遗传变异相关的QTL有利于家禽经济性状的有效选择。SNPs作为第三代分子标记，在复杂疾病的基因定位、关联分析、个体疾病易感性分析与药物基因组学等的研究中发挥着越来越重要的作用。单个的SNP —般只是具有二态性，能够提供的信息相对较少，而I个候选基因通常存在多个SNPs位点，如果采用不同的SNP位点进行候选基因与性状间的关联分析，可以弥补单个SNP提供信息量不足的缺点。目前，利用单倍型或单倍型块来研究QTL与动物生产性能的相关性是候选基因研究的趋势之一 .
【发明内容】
[0003]本发明要解决的技术问题是提供一种利用DNA标记提高京海黄鸡产蛋数的方法，该方法利用生肌因子5 (Myf5)基因的单倍型组合对京海黄鸡300日龄产蛋数标记辅助选择，不受环境影响。
[0004]本发明公开了 Myf5基因作为DNA标记提高京海黄鸡产蛋数的方法。利用单倍型组合提高京海黄鸡300日龄产蛋数的方法是:取待测样本的鸡基因组DNA，经序列如SEQ IDNO:1-6所示的特异性引物扩增得到173、247和150bp的片段，目的片段经SSCP分析，凝胶电泳后用银染显色，分别得到DNA的SSCP图谱P1、P2和P3，根据图谱中的带型筛选基因型分别为图1中1、7、11的个体，也就是H1H3单倍型组合的个体。
[0005]本发明的原理是:针对Myf5基因设计3对引物(Pl，P2，P3)，引物Pl扩增产物存在6种基因型，引物P2、P3各存在3种基因型，检测区域存在8个SNPs位点。测序结果与Myf5基因原序列(GenBank ID:NW_003763474.1)比对发现，这8个位点分别为C967T，C968T, C976T, T998C, C1007T, G1043A, A1313G, G1717A,前 7 个突变均位于 Myf5 基因的外显子1，第8个位于内含子I。其中C967T和C968T —起突变造成了编码氨基酸由丝氨酸到苯丙氨酸的变化，C976T造成了丝氨酸到亮氨酸的突变，其余突变未造成编码氨基酸的改变。利用PHASE2.1软件计算分析单倍型种类及其频率，其中频率大于1%的有9种，分别命名为Hl~H9。统计分析表明单倍型组合H1H3的300日龄产蛋数最多，极显著高于单倍型组合H1H4(P〈0.01)。该选择的效果显著，检测方法简单快捷，且不受外界环境的影响，可以用于京海黄鸡300日龄产蛋数的分子遗传标记。
【专利附图】
【附图说明】[0006]图1是Myf 5基因扩增产物的PCR-SSCP图谱。
[0007]Pl为引物Pl扩增产物多态形成的带型，P2为引物P2扩增产物多态形成的的带型，P3是引物P3扩增产物多态形成的带型。
[0008]图2是京海黄鸡Myf5基因8个SNPs位点的序列比较
【具体实施方式】
[0009]实施例
[0010]1.1实验动物
[0011]随机采取江苏京海禽业集团有限公司同一批次的379只京海黄鸡母鸡血样。采用酚氯仿抽提法提取鸡基因组DNA，溶于TE，NAN0DR0P1000核酸浓度测定仪测定浓度和纯度后-20°C保存备用。
[0012]1.2引物设计与PCR扩增
[0013]根据GenBank中已发表的Myf5基因序列(登录号为:NW_003763474.1)，采用Primer3.0设计3对引物。扩增产物大小分别为173、247和150bp。引物序列如下:
[0014]Pl:F:5/ -AGATGGAGGTGATGGACAGC-3' (SEQ ID NO:1)
[0015]R:5/ -GGACGTGTTCCTCTTCCTCA-3' (SEQ ID NO:2)
[0016]P2:F:5/ -GCAGCCACTATGAGGGAGAG-3' (SEQ ID NO:3)
[0017]R:5/ -TTACCATCACATCGGAGCAG-3' (SEQ ID NO:4)
[0018]P3:F:5/ -CTCTACCGGGACGCTTCG-3'(SEQ ID NO:5)
[0019]R:5/ -CCTTACCGTGGGGCATCT-3'(SEQ ID NO:6)
[0020]PCR 反应体系为为 2O μ L，包括 10XBuffer2y L，MgCl2 (25mmol/L) 2.2 μ L，dNTPs(lOmmol/L) 0.8 μ L,上下游引物(10 μ mol/L)各 I μ L,模板 I μ L, Taq 酶 0.2 μ L,补双蒸水11.8 μ L至20 μ L。反应条件为94°C预变性5min ；31个循环(94°C变性45s，各自最佳退火温度退火40s，72°C延伸35s);最后72°C延伸性lOmin，4°C保存产物。PCR产物用10%非变性聚丙烯酰胺凝胶检测。
[0021]1.3SSCP分析和测序
[0022]将3yL PCR产物和7.5μ L上样缓冲液(98%去离子甲酰胺、0.025%溴酚蓝、0.025%二甲苯？？、10臟01/1 EDTA (ρΗ8.0)、2%甘油)混合，98°C变性IOmin后，迅速冰浴lOmin, 10V/cm进行非变性聚丙烯酰胺凝胶(PAGE30%，
[0023]Acr: Bis=29: I)电泳10~12h后，银染显色。P1、P2和P3分别显示6、3和3种基因型(图1)。
[0024]各基因型各选取3个样本交由上海生工生物工程技术服务有限公司进行测序。测序结果与Myf5基因原序列(GenBank ID:NW_003763474.1)比对发现，这8个位点分别为C967T, C968T, C976T, T998C, C1007T, G1043A, A1313G, G1717A (图 2)，前 7 个均位于 Myf5的外显子I上，第8个突变位于内含子I。其中C967T和C968T —起突变造成了编码氨基酸由丝氨酸到苯丙氨酸的变化，C976T造成了丝氨酸到亮氨酸的突变，其余突变未造成编码氨基酸的改变。
[0025]1.4Myf5基因突变位点的单倍型分析及单倍型组合对京海黄鸡300日龄产蛋数的遗传效应[0026]利用PHASE2.1软件计算分析单倍型种类及其频率，其中频率大于1%的有9种，分别命名为Hl~H9 (表1)。配合下列模型分析单倍型组合对京海黄鸡300日龄产蛋数的影响:Υ= μ +单倍型组合效应+残差效应。京海黄鸡H1H3单倍型组合与其他单倍型组合300日龄产蛋数的比较见表1。H1H3单倍型组合的300日龄产蛋数最多，比H1H4单倍型组合多
5.68个(P〈0.01)，比其余4种单倍型组合300日龄平均产蛋数123.87个多7.05个。筛选H1H3单倍型组合可以提高京海黄鸡300日龄产蛋数，所以根据Myf5基因的带型筛选基因型分别为1、7、11的个体，即筛选H1H3单倍型组合可作为提高京海黄鸡300日龄产蛋数的方法。
[0027]表1Myf5基因单倍型分析结果
[0028]
【权利要求】
1.生肌因子5基因Myf5作为京海黄鸡300日龄产蛋数分子遗传标记的应用。
2.如权利要求1所述的应用，其特征在于具体是:取待测样本的鸡基因组DNA，经序列如SEQ ID NO:1-6所示的特异性引物扩增得到173,247和150bp的片段，目的片段经SSCP分析，凝胶电泳后用银染显色，得到3个DNA的SSCP图谱，根据3个图谱中的带型筛选H1H3单倍型组合的个体。
【文档编号】C12Q1/68GK103789444SQ201410067202
【公开日】2014年5月14日 申请日期:2014年2月26日 优先权日:2014年2月26日
【发明者】张跟喜, 王金玉, 唐莹, 张涛, 戴国俊, 谢恺舟, 俞亚波 申请人:扬州大学