一种改进的茎环引物qRT-PCR检测miRNA的方法
【专利摘要】本发明涉及一种改进的茎环引物qRT-PCR检测miRNA的方法，包括：（1）miRNA检测引物的设计：茎环引物包括两部分，通用的茎环序列和与靶标miRNA3’端互补配对的特异引物序列，其中与靶标miRNA互补配对的碱基数为11bp；qPCR的下游引物针对通用的茎环序列，上游引物针对靶标miRNA的5’端；在所述上游引物的5’末端增加GC尾巴，以使上下游引物的退火温度相近；（2）将靶标miRNA反转录成cDNA；（3）定量PCR扩增并采用SYBR?Green?qPCR检测法进行检测。本发明的方法特异性好、灵敏性高，且只需合成一种下游引物，采用SYBR?Green?I荧光染料法，大大节约了成本。
【专利说明】—种改进的茎环引物qRT-PCR检测miRNA的方法
【技术领域】
[0001]本发明属于miRNA的检测方法领域，特别涉及一种改进的茎环引物qRT-PCR检测miRNA的方法。
【背景技术】
[0002]MicroRNAs (miRNAs)是一类由大约22个核苷酸组成的单链非编码RNA，主要通过信使RNA的直接剪切或间接抑制翻译在转录后水平调控靶基因的表达。MiCT0RNAs在个体发育的不同时期如细胞分化、增殖、凋亡等及不同组织中有不同的表达模式，表明其在发育和分化中起着重要的调控作用。
[0003]传统的miRNA 检测技术如 northern hybridization, microarray,对低丰度的miRNA 的扩增敏感性差。qRT-PCR(Quantitative reverse transcription PCR)法是检测基因表达量最灵敏、可靠的方法，但常规的qRT-PCR技术难以检测约22bp的miRNAs，为克服这个问题，开发了茎环引物逆转录法、poly-Α加尾法等。通过延长逆转录产物的长度，便于qPCR引物设计，以利于PCR产物扩增。
[0004]Chen等开发的Taqman探针qRT-PCR检测法，采用基因特异的茎环引物，增强了RNA-DNA杂化双链的热稳定性，及茎环引物所产生的空间约束，使逆转录具有较高的灵敏性和特异性。但此方法成本 较高，且Taqman探针只结合到逆转录产物的部分cDNA序列无法完全保证其特异性，亦无法通过融解曲线分析PCR反应的特异性。
【发明内容】
[0005]本发明所要解决的技术问题是提供一种改进的茎环引物qRT-PCR检测miRNA的方法，该方法特异性好、灵敏性高，且只需合成一种下游引物，采用SYBR Green I荧光染料法，大大节约了技术成本。
[0006]本发明的一种改进的茎环引物qRT-PCR检测miRNA的方法，包括:
[0007](I) miRNA检测弓丨物的设计:
[0008]茎环引物包括两部分，通用的茎环序列和与靶标miRNA3’端互补配对的特异引物序列，其中与靶标miRNA互补配对的碱基数为Ilbp ；
[0009]qPCR的下游引物针对通用的茎环序列，上游引物针对靶标miRNA的5’端；在所述上游引物的5’末端增加GC尾巴，以使上下游引物的退火温度相近；
[0010](2)采用步骤(1)设计的miRNA检测引物将祀标miRNA反转录成cDNA ；
[0011](3)定量PCR扩增并采用SYBR Green qPCR检测法进行检测。
[0012]步骤(1)中所述的靶标miRNA 为 miR-SOS-SP-RT^miR-SOS-SP-RT2 或 miR-16-RT。
[0013]所述的miR-SOS-SP-RT1对应的miRNA检测引物为:
[0014]PCR-F1: GCGAGCACCGTCAACACTTG; PCR-R1: TGGTGTCGTGGAGTCGGC.[0015]所述的miR-505-3P-RT2对应的miRNA检测引物为:
[0016]PCR-F2: GCGAGCACCGTCAACACT, PCR-R2: TGGTGTCGTGGAGTCGGC.[0017]所述的miR-16-RT对应的miRNA检测引物为:
[0018]PCR-F:CGCGCTAGCAGCACGTAAAT;PCR-R:GTGCAGGGTCCGAGGT.[0019]步骤(3)中所述的PCR扩增中PCR反应终体系20yL包括:10yL2XSYBR GreenPCR master mix,0.4μ L ROX, 2.5 μ L cDNA 模板，3yL PCR 上下游引物 2 μ Μ, 4.1yL水，同时设阴性对照；PCR循环条件为95°C预变性2min，95°C变性15s，62°C延伸32s，共40个循环。
[0020]本发明基于茎环引物逆转录和SYBR Green qPCR检测法，将Taqman探针改为SYBRGreen荧光染料(百泰克)，并通过优化逆转录茎环引物的长度，建立改进的茎环引物RT-PCR实时定量检测方法。
[0021]本发明的茎环引物在靶标miRNA存在的条件下，能够高特异和高灵敏的结合到靶标miRNA上，得到延长的逆转录产物。qPCR中所使用的荧光染料SYBR Green I是一种结合于所有dsDNA双螺旋小沟区域的具有绿色激发波长的染料。在游离状态下，SYBR Green I发出微弱的荧光，但一旦与双链DNA结合后，荧光大大增强。因此，SYBR Green I的荧光信号强度与双链DNA的数量相关，可以根据荧光信号实时检测出PCR体系存在的双链DNA数量。设计原理如图1所示。
[0022]为实现上述目的，本发明所提供的茎环引物如下:
[0023]茎环引物包括两部分，通用的茎环序列和与靶标miRNA3’端互补配对的特异引物序列；
[0024]本发明中对Stem-1oop引物进行优化，其中通用的茎环序列保持不变，将其互补配对的特异引物序列延长4bp。
[0025]qPCR的下游引物针对通用的茎环序列，为提高上游引物的退火温度，在其5’末端的增加GC尾巴，以使上下游引物的退火温度相近。
[0026]有益效果:
[0027](I)本发明的检测miRNA的方法中，设计的PCR下游引物是针对茎环逆转录引物通用的茎环序列的，其可以通用，故只需合成一种下游引物，且采用SYBR Green I荧光染料法,大大节约了技术成本。
[0028](2)本发明引物具有良好的特异性，qPCR的融解曲线只有单一的峰。并且能够很好的区分靶标miRNA和其前体，相同浓度下成熟miRNA和其前体可相差8个Ct值。
[0029](3)本发明引物具有良好的灵敏性，检测范围可以跨越7个浓度梯度，对低通量的miRNA具有较高的准确度和精确度。
[0030](4)本发明中miRNA的检测方法可用于快速高效的检测小鼠组织样本中靶标miRNA的表达量差异，且可较好的适用于不同组织。
【专利附图】
【附图说明】
[0031]图1本发明的stem-loop qRT-PCR原理示意图；
[0032]图2实施例1中引物序列；
[0033]图3优化引物扩增产物的琼脂糖凝胶电泳；
[0034]图4优化引物的PCR产物融解曲线；
[0035]图5优化引物可以区分成熟miR-505_3P和它的前体；[0036]图6合成的miR-505_3P的扩增曲线；
[0037]图7优化后引物与优化前引物的标准曲线；
[0038]图8从不同组织中提取RNA样本，利用本发明设计的引物检测miR-505_3P的相对
表达量。
【具体实施方式】
[0039]下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
[0040]实施例1
[0041 ] 1、miRNA检测弓丨物的设计
[0042](I)茎环引物包括两部分，通用的茎环序列和与靶标miRNA3’端互补配对的特异引物序列；优化的茎环引物，将与靶标miRNA互补配对的碱基数从7bp增加到llbp。
[0043](2) qPCR的下游引物针对通用的茎环序列，上游引物针对靶标miRNA的5’端，5’末端的加了 8bp的尾巴，引物设计如图2所示。
[0044]2、验证引物的特 异性和灵敏性
[0045]( I)反转录
[0046]米用SuperScript II Reverse Transcriptase 试剂盒(Fermentas)进行反转录，反应终体系10 μ L包括:6.25 μ L DNase I处理的总RNA，0.5 μ L茎环引物(2 μ Μ)，0.5 μ LdNTP Mix(IOmM)。首先反应在 16°C 进行 15min 后，加入剩余体系(2 μ L5XRT buffer,0.5μ LRevertAid M-MuLV Reverse Transcriptase (200U/μ L), 0.25 μ L RNase inhibitor(20U/μ L))，反应程序为:35°C 60min, 80°C 15min。
[0047](2)实时定量PCR扩增
[0048]PCR 反应终体系 20 μ L 包括:10 μ L2 X SYBR Green PCR master mix, 0.4 μ L ROX,
2.5yL cDNA模板，3yL PCR上下游引物(2 μ M)，4.1 μ L 7jC，同时设阴性对照。PCR循环条件为95°C预变性2min，95°C变性15s，62°C延伸32s，共40个循环。电泳结果显示，优化后的引物只有单一的条带，且阴性对照无引物二聚体条带，如图3所示。样本融解曲线也只有在Tm值80°C左右有单一的峰，如图4所示。
[0049]合成的成熟miRNA和前体模板稀释到相同的浓度1.08X108/RT反应下，如图5所示，只有miRNA前体存在时，所得到的Ct值比成熟的miRNA至少高8.3个Ct值，说明如果检测的成熟miRNA和前体是在同一浓度下，其前体对成熟miRNA的检测结果只有0.31%的影响。用总RNA代替合成的miRNA模板，结果显示，前体的Ct值比成熟的miRNA高至少10个Ct值，表明在组织样本中miRNA的前体是低丰度的。
[0050]将合成的miR-505-3P RNA模板10倍稀释7个浓度梯度，如图6、7，结果显示，和原来的逆转录引物相比，优化引物的CT值和RNA模板呈现了更好的线性，表明优化的引物具有更高的效率和更灵敏的检测范围。
[0051]3、利用优化引物对不同组织中的miRNA进行检测
[0052]以2个品系(转基因和C57BL/6)小鼠的丘脑、垂体、卵巢、肌肉和脂肪组织为样本。分别取5、15、25、35日龄颈椎脱白处死，迅速取出下丘脑、垂体、卵巢、肌肉、脂肪样本。具体依据TRIzoI提取试剂盒说明书提取总RNA。具体流程如下:
[0053]a.匀衆处理:将组织在液氮中磨碎,每50~IOOmg组织加入1ml TRIzol,用匀衆仪进行匀浆处理。样品体积不应超过TRIzoI体积10 %。
[0054]b.将匀浆样品在室温(15~30°C)放置5分钟，使核酸蛋白复合物完全分离。
[0055]c.每使用Iml TRIzol加入0.2ml氯仿，剧烈振荡15秒,室温放置3分钟。
[0056]d.2-80C 10000Xg离心15分钟。样品分为三层:底层为黄色有机相，上层为无色水相和一个中间层。RNA主要在水相中，水相体积约为所用TRIzol试剂的60 %。
[0057]e.把水相转移到新管中，如要分离DNA和蛋白质可保留有机相，进一步操作见后。用异丙醇沉淀水相中的RNA。每使用lmlTRIzol加入0.5ml异丙醇，室温放置10分钟。
[0058]f.2~8V 1000OXg离心10分钟，离心前看不出RNA沉淀，离心后在管侧和管底出现胶状沉淀。移去上清。
[0059]g.用75 %乙醇洗涤RNA沉淀。每使用Iml TRIzol至少加lml75 %乙醇。2~8°C不超过7500 Xg离心5分钟，弃上清。
[0060]h.室温放置干燥或真空抽干RNA沉淀，大约晾5~10分钟。加入25~200 μ I无RNase的水，用枪头吸打几次，55~60°C放置10分钟使RNA溶解。
[0061]结果显示，我们的方法可以检测到120个不同组织中的HiiCT0RNA样本，且发现在转基因和C57BL/6小鼠的不同时间点下，相较于其他组织，在肌肉和脂肪组织中差异显著，这与本实验室在表型上观测到的`数据是一致的，如图7所示。
【权利要求】
1.一种改进的茎环引物qRT-PCR检测miRNA的方法，包括: (1)miRNA检测引物的设计: 茎环引物包括两部分，通用的茎环序列和与靶标miRNA3’端互补配对的特异引物序列，其中与靶标miRNA互补配对的碱基数为Ilbp ； qPCR的下游引物针对通用的茎环序列，上游引物针对靶标miRNA的5’端；在所述上游弓丨物的5’末端增加GC尾巴，以使上下游引物的退火温度相近； (2)采用步骤(1)设计的miRNA检测引物将祀标miRNA反转录成cDNA； (3)定量PCR扩增并采用SYBRGreen qPCR检测法进行检测。
2.根据权利要求1所述的一种改进的茎环引物qRT-PCR检测miRNA的方法，其特征在于:步骤(1)中所述的靶标 miRNA 为 miR-SOS-SP-RT1、miR-505_3P-RT2 或 miR-16-RT。
3.根据权利要求2所述的一种改进的茎环引物qRT-PCR检测miRNA的方法，其特征在于:所述的miR-SOS-SP-RT1对应的miRNA检测引物为:
PCR-F1: GCGAGCACCGTCAACACTTG; PCR-R1: TGGTGTCGTGGAGTCGGC。
4.根据权利要求2所述的一种改进的茎环引物qRT-PCR检测miRNA的方法，其特征在于:所述的miR-505-3P-RT2对应的miRNA检测引物为:
PCR-F2:GCGAGCACCGTCAACACT, PCR-R2: TGGTGTCGTGGAGTCGGC。
5.根据权利要求2所述`的一种改进的茎环引物qRT-PCR检测miRNA的方法，其特征在于:所述的miR-16-RT对应的miRNA检测引物为:
PCR-F:CGCGCTAGCAGCACGTAAAT;PCR-R:GTGCAGGGTCCGAGGT。
6.根据权利要求1所述的一种改进的茎环引物qRT-PCR检测miRNA的方法，其特征在于:步骤(3)中所述的PCR扩增中PCR反应终体系20 μ L包括:10 μ L2 X SYBR Green PCRmaster mix,0.4μ L ROX, 2.5 μ L cDNA 模板，3yL PCR 上下游引物 2 μ Μ, 4.I μ L水，同时设阴性对照；PCR循环条件为95°C预变性2min，95°C变性15s，62°C延伸32s，共40个循环。
【文档编号】C12Q1/68GK103866009SQ201410067044
【公开日】2014年6月18日 申请日期:2014年2月26日 优先权日:2014年2月26日
【发明者】薛慧慧, 肖君华, 周宇荀, 李凯 申请人:东华大学