[0046] 4)酶切:限制性内切酶具有特异的酶切位点，参考发现GHR-intron 2、GHR-intron 5和GHR-P3分别具有内切酶Hindll I、Nsp I和Xap I相同的酶切位点；
[0047] 表5限制性内切酶的识别位点及反应温度
[0048]
[0049] 5)使用DNA Star(5.0)软件进行DNA序列比较和寻找酶切位点，计算基因频率和基 因型频率并进行检验，进而进行不同位点遗传多态性分析和核苷酸多态位点与性状关系的 分析。
[0050] 分析结果：
[0051 ] a.AAGCTT 位点
[0052] 检测GHR-intron2基因多态性，发现intron2序列290bp和558bp位点存在两个 AAGCTT的酶切位点，测序得到：290bp位点未发现有突变，而558bp位点存在A-G的突变，SP GG型，而未发生突变的为AA型。武定鸡只发现了AA基因型，酶切和测序证实武定鸡GHR基因 Intron-2558A/A，与GenBank-致，没有突变位点；大围山微型鸡发现了 AA和GG两种基因型， 在微型鸡GHR基因内含子2第558位点上发现一个SNP突变，GHR基因 Intron-2 558 A/G。测序 图谱如图1所示。
[0053] 武定鸡和大围山微型鸡290bp测序结果和GeneBank上序列的比对结果：
[0054] TGATAAAAATGAACATAAGCTTGCTGTAGATTCCTAAAATTTTGCACCTT 53550
[0055] TGATAAAAATGAACATAAGCTTGCTGTAGATTCCCAAAATTTTGCACCTT 311 [0056] 武定鸡和大围山微型鸡558bp测序结果和GeneBank上序列的比对结果：
[0057] GGAATGTGAAATAAAGCTTCCAAAATTAGGTGTATATAGGAAAATTACAG 53800
[0058] GGAATGTGAAATAGAGCTTCCAAAATTAGGTGTATATAGGAAAATTACAG 561
[0059] b.571bp 位点
[0060] 检测GHR-intron5基因多态性，测序得到571bp位点未发生突变的AA型和和571bp 发生A-G的突变的为GG型。武定鸡只发现了 AA基因型，武定鸡GHR基因 Intron-5 571A/A，与 GenBank-致，没有突变位点。大围山微型鸡发现了AA、GG和AG三种基因型，在GHR基因内含 子5第571位点上发现一个SNP突变，GHR基因 Intron-5 571 A/G。测序图谱如图2所示。
[0061] 武定鸡571bp测序结果和GeneBank上序列的比对结果：
[0062] CATCAATGGTGTATGCACATGCAGTTAAGACTGTATTCCTACAAGTGACT 68250
[0063] CATCAATGGTGTATGCACATGCAGTTAAGACTGTATTCCTACAAGTGACT 540 [0064] 大围山微型鸡571bp测序结果和GeneBank上序列的比对结果：
[0065] i !
[0066] 检测位于GHR基因的5'UTR上的GHR-P1基因多态性，在5'UTR序列6540334nt位点存 在T-C的SNP突变位点，命名为GHR-P1。在实验过程中，武定鸡和微型鸡都发现了TT和CT两 种基因型。武定鸡TT基因型频率为0.89, CT基因型频率为0.11。微型鸡TT基因型频率为 0.83，CT基因型频率为0.17。两个鸡种共检测了 200只鸡，没有发现CC纯合型。测序图谱如图 3所示。
[0067]五、大围山微型鸡、武定鸡GHR基因多态性的分析
[0068] (1)大围山微型鸡与武定鸡GHR基因多态位点、基因型及基因频率的分析见表6。
[0069] 经卡方适合性检验表明：
[0070] 在1]11：1'〇112(!1;[11(1111)上，武定鸡种群的乂2值无法计算，没有发现多态位点，8卩武定 鸡的混合群体处于Hardy-Weingerg平衡状态。大围山微型鸡混合群体的P值均小于0.01，差 异极显著，即大围山微型鸡的群体均处于Hardy-Weingerg极不平衡状态。
[0071 ] 在Intron5(NspI)上，武定鸡种群的X2值无法计算，没有发现多态位点，即武定鸡 的混合群体处于Hardy-Weingerg平衡状态;而大围山微型鸡混合群体的P值均小于0.01，差 异极显著，即大围山微型鸡的群体均处于Hardy-Weingerg极不平衡状态。
[0072] 在GHR-P1 (XapI)的5 ' UTR上，武定鸡种群和大围山微型鸡群体的P值均小于0.01， 差异极显著，即大围山微型鸡的群体均处于Hardy-Weingerg极不平衡状态。
[0073] 表6鸡GHR基因多态位点基因型及等位基因频率
[0074]
[0076] Hardy-Weingerg平衡检验卡方值：差异极显著（P〈0.01)，差异显著（0.01 <P〈 0.05)，差异不显著(？>0.05)。
[0077] (2)大围山微型鸡与武定鸡IGF1R基因纯合度、杂合度、有效等位基因数和多态信 息含量的分析见表7。
[0078] 表7鸡GHR基因的纯合度、杂合度、有效等位基因数和多态信息含量
[0079]
[0080] PIC是估计基因多态性的一个指标。Bostein(1980)确定座位多态性的标准是PIC> 〇.5，为高度多态；0.5>?100.25，为中度多态；？1(：〈0.25，为低度多态。从表7可知 ：在 Intron2(HindIII)、Intron5(NspI)上和GHR-P1 (XapI)的5'UTR上多态位点上，武定鸡和大 围山微型鸡均表现为低度多态。
[0081 ]六、大围山微型鸡、武定鸡GHR基因多态性与体尺性状的关联性分析 [0082] GHR基因 Intron2 558A/G、Intron5 571A/G、GHR-P1 242C/T SNP多态与体重的关 联性分析见表8。验结果显示:大围山微型鸡和武定鸡Intron 2 558A/G、GHR-P1 242C/T基 因与体重无显著的相关性(P>〇.〇5)。大围山微型鸡Intron5 571A/G基因与体重显著相关(P <0.05)〇
[0083]表8 GHR基因多态与表型性状指标的关联性
[0084]
[0085] 注:NS表示差异不显著（Ρ>0·05)
[0086] 本发明利用云南特有的武定鸡和大围山微型鸡为研究材料，采用目标区域深度重 测序的方法，结合生物信息学分析，筛选和鉴定与大围山微型鸡和武定鸡生长性能相关SNP 位点，并进行分子标记，在GHR基因内含子5上筛选到与体重有显著相关的571A/G位点，并以 此位点作为分子标记对鸡的选育进行辅助选择，为云南本土鸡的选育提供重要的科学借 鉴。
[0087] 本发明还提供了一种大围山微型鸡选育中遗传改良的方法，可通过对GHR基因分 子标记的检测，检测GHR基因内含子5上的571A/G突变位点(GHR基因内含子5第571位点），筛 选GHR基因 mRNA表达量较高的个体，淘汰GHR基因 mRNA表达量较低的个体，提高种群中优良 个体的纯化率。
[0088] 最终，以上实施例和附图仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过上述 实施例已经对本发明进行了详细的描述，但本领域技术人员应当理解，可以在形式上和细 节上对其作出各种各样的改变，而不偏离本发明权利要求书所限定的范围。
【主权项】
1. 一种鸡生长性能选育分子标记GHR基因，是从云南大围山微型鸡和武定鸡肌肉组织 中分离、克隆的与体尺性状相关的生长激素受体基因，其特征在于:基因的CDS序列全长为 1827bp，其CDS核苷酸序列分别为SEQ.ID.NO.1和SEQ.ID.NO.2，并且CDS核苷酸序列编码 608个氨基酸，氨基酸序列分别为SEQ.ID.NO.3和SEQ.ID.NO.4。2.根据权利要求1所述的鸡生长性能选育分子标记GHR基因在云南大围山微型鸡和武 定鸡中体重性状选育中的应用。3.根据权利要求1所述的与大围山微型鸡的体重性状有显著相关性的鸡生长性能选育 分子标记，其特征在于:所述的与大围山微型鸡的体尺性状有显著相关突变位点为GHR基因 内含子5上的571A/G位点，其为GHR基因第75630位点。4.根据权利要求3所述的与大围山微型鸡的体重性状有显著相关鸡生长性能选育分子 标记，其特征在于:GHR基因内含子5上的571A/G位点作为鸡体重性状选育分子标记在在云 南大围山微型鸡体重性状选育中的应用。5. -种大围山微型鸡选育中遗传改良的方法，其特征在于:在大围山微型鸡鸡群中，检 测GHR基因内含子5上的571A/G突变位点，筛选GHR基因mRNA表达量较高的个体，淘汰GHR基 因mRNA表达量较低的个体。
【专利摘要】本发明涉及动物分子育种的基因工程技术，特别是一种鸡生长性能选育分子标记GHR基因及其应用技术。本发明利用云南特有的武定鸡和大围山微型鸡为研究材料，采用目标区域深度重测序的方法，结合生物信息学分析，筛选和鉴定与大围山微型鸡和武定鸡生长性能相关SNP位点，并进行分子标记，在GHR基因内含子5上筛选到与体重有显著相关的571A/G突变位点（GHR基因第75630位点），并以此位点作为分子标记对鸡的选育进行辅助选择，为云南本土鸡的选育提供重要的科学借鉴。
【IPC分类】C12Q1/68, C12N15/11
【公开号】CN105441559
【申请号】CN201511016795
【发明人】荣华, 曹振辉, 刘丽仙, 贾俊静, 豆腾飞, 汪善荣, 赵筱, 张彦华, 李琦华, 李正田, 徐志强, 谷大海, 林秋叶, 佟荟全, 葛长荣
【申请人】云南农业大学
【公开日】2016年3月30日
【申请日】2015年12月29日