与荠菜抗药性相关的分子标记及其检测试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明是申请号为201410643602.9,名称为"与莽菜抗药性相关的分子标记及其 检测试剂盒"专利申请的分案申请，本发明设及抗除草剂杂草检测技术，具体地说，设及与 莽菜抗药性相关的分子标记及其检测试剂盒。
【背景技术】
[0002] 乙酷乳酸合酶（acetolactate synthase ,简称ALS)，也称乙酷径酸合酶 (acetohyhowacid syn化ase，简称AHAS)，是诱导植物和微生物体内鄉氨酸、亮氨酸、异亮 氨酸的生物合成过程中关键性酶，也是一种重要的除草剂祀标。ALS抑制剂类除草剂的开发 及使用始于上世纪80年代初，由于此类除草剂有超高活性、对人及动物低毒、环境友好等明 显的优势，受到广泛关注，目前已有50多个品种被开发和使用。上世纪80年代开始，我国陆 续在冬小麦田推广使用苯横隆、甲横隆、氯横隆、双氣横草胺、晚横草胺等，2009年仅苯横隆 在我国的产量就达230多吨(有效成分），相当于麦田化除面积2亿多亩。苯横隆作为小麦田 最经济、有效的优秀除草剂，对控制莽菜等阔叶杂草起到了非常重要的作用。但由于该类除 草剂分子祀标单一，长期使用易引起杂草抗药性，近些年来，W常规剂量喷施苯横隆无法有 效防除莽菜的问题在我国河北、陕西、山东、河南、山西、江苏等地的一些麦田非常突出，并 且发现，有些麦田抗苯横隆的莽菜对双氣横草胺等ALS抑制剂也产生了交互抗性。麦田杂草 对上述几种ALS抑制剂产生交互抗性，使运些农田不能继续使用该类除草剂，而在生产中由 于农民对杂草抗药性的认识上的不足，盲目增大用药剂量，不仅增加了成本，使药害风险加 大，严重影响农民收入和国家粮食安全。因此，目前迫切需要一个简便，快速的抗药性杂草 检测鉴定方法。
[0003] 我国抗药性杂草的研究起步较晚，传统的抗药性杂草检测通常采用室内生物测定 法，既对田间采集的疑似抗性的杂草的种子在室内进行培养，在一定叶龄喷施除草剂后，调 查株防效和地上部分生物量来计算抗性指数。运种方法能够客观地评价某种杂草对相应除 草剂的抗性情况，但也有其局限性，主要表现在W下两方面:一是不能当季、当时进行检测， 二是占地多、时间长、工作量大。
[0004] 随着分子生物学技术在杂草抗药性机理研究方面的应用，越来越多的杂草的抗药 性机理得到明确。目前已有的研究报道显示，对ALS抑制剂产生抗性的植物在其祀标酶ALS 保守区共发现了 8个 SNP位点（http://www.weedscience.org/Mutations/ MutationDisplayAll.aspx)，运些位点的任意一个位点氨基酸突变为其他氨基酸都使植物 对相应除草剂产生抗性。运8个氨基酸位点目前公认W拟南芥ALS为标准标注位点，包括 122、197、205、376、377、574、653、654位氨基酸。其中，莽菜对苯横隆等ALS抑制剂类除草剂 产生抗性的原因也已证实与编码ALS保守区某一位点发生点突变相关。研究报道中只克隆 了莽菜的一个ALS基因，但我们在研究中发现，莽菜具有两个ALS基因，分别命名为JC-ALS-I 和JC-ALS-2,运两个基因都具有功能，任意一个基因在保守区发生突变，都能够引起抗药性 产生。因此，可W通过分子生物学手段检测其祀标酶ALS的保守区突变位点来检测莽菜是否 发生抗药性。
【发明内容】
[0005] 为了解决现有技术中存在的问题，本发明的目的是提供一种抗乙酷乳酸合酶抑制 剂类除草剂莽菜的检测方法。
[0006] 为了实现本发明的目的，本发明首先提供与莽菜抗药性相关的分子标记，所述分 子标记为：
[0007] (1)核巧酸序列如SEQ ID No. 1所示的JC-ALS-I基因；所编码的蛋白的氨基酸序列 如SEQ ID No.3所示；其中，编码第373位氨基酸的密码子发生GAT-GAA碱基突变，或编码第 571位氨基酸的密码子发生TGG-TTG碱基突变，导致莽菜抗药性出现多态性；
[000引或（2)核巧酸序列如SEQ ID No.2所示的JC-ALS-2基因；所编码的蛋白的氨基酸序 列如SEQ ID No.4所示；其中，编码第372位氨基酸的密码子发生GAT-GAA碱基突变，或编码 第570位氨基酸的密码子发生TGG-TTG碱基突变，导致莽菜抗药性出现多态性；
[0009] 所述抗药性具体表现为抗乙酷乳酸合酶抑制剂类除草剂。
[0010] 需要指出的是JC-ALS-I基因发生碱基突变，导致翻译的氨基酸发生变化的第373 位和第571位氨基酸位点，若W拟南芥ALS氨基酸顺序，则分别为376位和574位。同样，JC-ALS-2基因发生碱基突变，导致翻译的氨基酸发生变化的第372位和第570位氨基酸位点，若 W拟南芥ALS氨基酸顺序，则分别为376位和574位。
[0011] 因此，本发明所述分子标记翻译的氨基酸序列，相对于拟南芥ALS氨基酸顺序来 说，由于在编码第376位氨基酸的密码子发生GAT-GAA碱基突变，使得该位置氨基酸由Asp变 为Glu;或由于在编码第574位氨基酸的密码子发生TGG-TTG碱基突变，使得该位置氨基酸由 了巧变为Leu。
[0012]为了叙述简洁，本发明在后文中将利用拟南芥ALS氨基酸顺序，对所述分子标记导 致的氨基酸突变位点进行描述。
[OOU]本发明还提供了用于检现聯乙酷乳酸合酶抑制剂类除草剂莽菜的特异性PCR引物 对，包括用于特异性扩增莽菜JC-ALS-I基因和JC-ALS-2基因的引物对，引物对的核巧酸序 列如下：
[0014] 正向引物JC-ALS-F:5'-TATTCGCTTACCCAGGTG-3'；
[0015] 反向引物JC-ALS-R:5'-GGTTCTGAGTTTCATCTCTCA-3'。
[0016] 本发明还进一步提供了用于检测抗乙酷乳酸合酶抑制剂类除草剂莽菜的试剂盒， 所述试剂盒含有前述引物对。
[0017] 作为优选，所述试剂盒还包括dNTPs、Taq DNA聚合酶、Mgh、PCR反应缓冲液中的至 少一种。
[0018] 更为优选，所述试剂盒还包括标准阳性模板。
[0019] 本发明还提供一种抗乙酷乳酸合酶抑制剂类除草剂莽菜的PCR检测方法，利用前 述引物对或试剂盒检测抗乙酷乳酸合酶抑制剂类除草剂的莽菜。
[0020] 进一步地，所述PCR检测方法具体包括W下步骤：
[0021] 1)提取样品中的DNA;
[0022] 2) W步骤1)中提取的DNA为模板，利用前述引物对或试剂盒进行PCR扩增反应；
[0023] 3)分析PCR产物。
[0024] PCR 后廊化器 W Wii H+责.
[0025]
[0026] PCR反应条件为:94 °C预变性3分钟;94 °C变性1分钟，55.3 °C退火1分钟，72 °C延伸1 分钟，共30个循环;72°C延伸10分钟。
[0027] 本发明根据莽菜的JC-ALS-I和JC-ALS-2序列信息（SEQ ID No.l和沈Q ID No.2) 设计出特异性引物JC-ALS-F和JC-ALS-R，采用该引物的PCR检测方法具有极好的特异性和 灵敏性，经特异性试验证明（图1、2)能够将莽菜的两个ALS基因同时扩增出来。由于PCR方法 操作简便快捷，基于对核巧酸的检测，当季就可W取样检测，从取样到出结果仅需2~4天。 其灵敏度和特异性能够实现对田间疑似抗ALS抑制剂类除草剂莽菜的快速鉴定和突变位点 的确认，从而指导生产实践中抗性杂草的科学治理。
[002引本发明提供的用于检测抗ALS抑制剂类除草剂莽菜的试剂盒，可对田间采集的疑 似抗性的莽菜进行快速检测。可W替代一直沿用的生物测定的传统检测方法，并适于在其 他抗药性杂草的监测领域中广泛开发应用，实用性强，可满足田间抗药性杂草快速诊断的 需要。
【附图说明】
[0029] 图1为本发明实施例帥利用特异性检测引物JC-ALS-F/JC-ALS-R对不同莽菜DNA 的PCR扩增结果。其中，7为DNA Marker(DL2000)，1-6泳道为引物对JC-ALS-F/JC-ALS-R扩增 6个莽菜样品的结果。
[0030] 图2为为本发明实施例2中利用特异性检测引物JC-ALS-F/JC-ALS-R对莽菜DNA的 PCR产物测序结果部分截图。其中A为克隆后测序结果，B为PCR产物直接测序结果。
[0031] 图3为本发明实施例3中利用JC-ALS-F/JC-ALS-R引物对扩增敏感性莽菜PCR产物 测序结果。其中，A为JC-ALS-I和JC-ALS-2的编码第197位氨基酸附近截图，此位点均为CCT; B为JC-ALS-I和JC-ALS-2的编码第376位氨基酸附近截图，此位点均为GAT; C为JC-ALS-I和 JC-ALS-2的编码第574位氨基酸附近截图，此位点均为TGG(反向互补序列）。
[0032] 图4为本发明实施例3中利用JC-ALS-F/JC-ALS-R引物对扩增抗药性莽菜PCR产物 测序结果。A中有一条ALS的编码第197位氨基端的碱基由CCT突变为TCT;B中有一条ALS的编 码第197位氨基酸的碱基由CCT突变为ACT;C中有一条ALS的编码第197位氨基酸的碱基由 CCT突变为CTT。
[0033] 图5为本发明实施例3中利用JC-ALS-F/JC-ALS-R引物对扩增抗药性莽菜PCR产物 测序结果。其中，有一条ALS的编码第376位氨基酸的碱基由GAT突变为GAA。
[0034] 图6为本发明实施例3中利用JC-ALS-F/JC-ALS-R引物对扩增抗药性莽菜PCR产物 测序结果。其中，有一条ALS的编码第574位氨基酸的碱基由TGG突变为TTG(反向互补序列）。
[0035] 图7为本发明实施例4中敏感和抗药性种群在施用一系列浓度梯度苯横隆后21天 的效果。
【具体实施方式】
[0036] W下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例 均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册（Sambrook J&Russell DW, Molecular cloning:a Iaboratoiy manual,2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。
[0037] 实施例1用于检测抗ALS抑制剂类除草剂莽菜的PCR引物的合成
[0038] 在GenBank数据库中查询莽菜ALS基因序列（GenBank登录号:H Q880660.1)，根据 查询到的序列信息，利用引物设计生物学软件，设计用于特异性扩增JC-ALS-I和JC-ALS-2 的保守区序列的PCR引物，并通过3'RACE和染色体步移的方法获得两端序列，最终分别获得 莽菜的两个ALS基因序列。
[0039] 引物序列如下：
[0040] 正向引物JC-ALS-F: 5 ' -TATTCGCTTACCCAGGTG-3 ' ；
[0041 ]反向引物JC-ALS-R:5'-GGTTCTGAGTTTCATCTCTCA-3'。
[0042] 引物合成由北京六合华大基因科技股份有限公司完成。
[0043] 实施例2抗ALS抑制剂类除草剂莽菜的PCR检测方法
[0044] 实验材料：采自不同地区的莽菜Kapsella bursa-pastoris)。
[0045] 实验方法：
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