046] 1、莽菜DNA的制备
[0047] 取莽菜新鲜叶片200mg，采用液氮研磨，常规CTAB法提取各莽菜叶片DNA。
[004引2、用于检测莽菜JC-ALS-I和JC-ALS-2突变位点的特异性引物，引物序列见实施例 Io
[0049] 3、用于检测莽菜ALS突变位点的PCR反应体系
[00加]PCR反应体系，其中IOXPCR反应缓冲液化L，15mM MgCl2〇.5化，2.5mM dNTPs 1化， IOyM引物各0.化L，hq DNA聚合酶IU，DNA模板化L，其余为灭菌双蒸水，终体积为20化。
[0051 ] 4、用于检测莽菜ALS突变位点的PCR扩增程序
[0052] 94°C 预变性 3min;94°C 变性 1111111，55.3。(：退火1111111，72。(：延伸1111111，共30个循环；最 后 72°C 延伸 lOmin。
[0化3] 5、PCR产物的鉴定
[0054]取化L PCR产物，用1% (重量/体积)琼脂糖凝胶电泳分离，经漠化乙锭染色后于紫 外灯下根据扩增产物的大小判定结果。
[0055] 6、PCR产物测序
[0056]引物对JC-ALS-F/JC-ALS-R的PCR扩增产物用引物JC-ALS-F和JC-ALS-R分别正反 向测序。测序由北京六合华大基因科技股份有限公司完成。对测序结果进行比对分析。 [0化7]实验结果：
[0化引检测特异性引物对JC-ALSF/JC-ALSR对不同莽菜PCR扩增结果（图1)显示运对引物 具有很好的特异性(扩增目的片段约1687bp)。测序结果进一步证实运对引物能够同时扩增 JC-ALS-I和JC-ALS-2序列，图2中A为克隆测序结果的部分序列比对图，其中黑色部分为 1OO % -致部分，AA为JC-ALS-I序列，GG为JC-ALS-2序列。图2中B为PCR产物直接测序峰图截 图，在相同位点找到了AA和GG的套峰，说明运对引物能够同时扩增JC-ALS-I和JC-ALS-2序 列，用运对引物扩增的PCR产物直接测序能够检测到莽菜的两条ALS基因序列。
[0059] 用运对引物扩增出来的敏感和抗药性莽菜的PCR产物分别测序，在相应位点能够 找到序列上的差异。
[0060] 实施例3PCR法检测田间抗ALS抑制剂的莽菜 [0061 ] 检测方法如下：
[0062] 1、样品采集与DNA制备
[0063] 为验证PCR检测方法的可行性，2013和2014年连续两年在疑似发生抗药性莽菜的 农田采集样品，在实验室进行检测。运些田块在小麦返青后施用过一次苯横隆来防除莽菜， 但没有效果，因此怀疑可能对苯横隆产生抗性。因此，从运些疑似发生抗药性农田采集莽菜 植株，进行适当保湿处理后，邮寄至实验室进行检测。取莽菜新鲜叶片200mg，采用液氮研 磨，常规CTAB法提取各莽菜叶片DNA。
[0064] 2、用于检测莽菜JC-ALS-巧日JC-ALS-2突变位点的特异性引物，引物序列见实施例1。
[0065] 3、用于检测莽菜ALS突变位点的PCR反应体系
[0066] 同实施例2。
[0067] 4、用于检测莽菜ALS突变位点的PCR扩增程序 [006引同实施例2。
[0069] 5、PCR产物的鉴定
[0070] 同实施例2。
[0071] 6、PCR产物测序
[0072] 同实施例2。
[0073] 实验结果：
[0074] 2013年和2014年从河北、陕西、江苏、山东省的不同农田，共采集31个，按照本发明 的检测方法对其进行检测。检测结果显示(表1)(图3~6)。其中，有21个莽菜样品的JC-ALS 在编码197位氨基酸的碱基发生突变，有5个莽菜样品的JC-ALS在编码376位氨基酸的碱基 发生突变，有4个种群的JC-ALS在编码574位氨基酸的碱基发生突变。
[0075] 由此可见，该方法能够快速、准确地检测采自田间的疑似抗药性莽菜的抗药性突 变的发生位点及取代的氨基酸种类，能够快速准确地给出能否继续使用ALS抑制剂来防除 莽菜，是一种检测莽菜抗药性种群的简单、快速的方法。
[0076] 表1 PCR法检测田间莽菜抗药性突变位点结果
[0077]
[007引实施例4
[0079] 实验材料:在上述已发现祀标突变的田间采集抗性莽菜种群（2014-JC-1、2014-JC-33)，W敏感种群作为对照。
[0080] 实验方法：
[0081] 1、采自不同田间的抗性莽菜种群的种子和敏感种群种子，经过打破休眠处理后均 匀播种于直径为12cm的花盆，花盆内±壤与有机肥比例为3:1(重量比）。播种好的莽菜在培 养箱内培养，溫度15-25 °C。
[0082] 2、植株长至2叶开始间苗，使每盆莽菜植株均匀分布，每盆留10株。
[0083] 3、莽菜长至3叶施用一系列浓度梯度的苯横隆，其有效剂量为0、0.0 l、0.1、1、10、 100、1000g a.i./ha，21 天后调查。
[0084] 4、从施用苯横隆后存活的抗药性种群2014-JC-U2014-JC-33中各取5株，从敏感 种群2011-JC-S的空白对照取5株。
[0085] 5、DNA制备方法同实例2。
[0086] 6、用于检测莽菜ALS基因突变位点的特异性引物，引物序列见实施例1。
[0087] 7、用于检测莽菜ALS基因突变位点的PCR反应体系同实施例2。
[00则 8、用于检测莽菜ALS基因突变位点的PCR扩增程序同实施例2。
[0089] 9、PCR产物的鉴定同实施例2。
[0090] 10、PCR产物测序同实施例2。
[0091] 实验结果:敏感种群在施用Ig a. i. Aa苯横隆后21天已全部死亡，两个抗药性种 群2014-JC-1和2014-JC-33在100g a.i./ha苯横隆作用下仍有存活，表现出极强的抗性（图 7)。
[0092] 从每个抗药性和敏感种群存活植株中随机选取5个植株，检测其ALS基因序列。检 测结果显示，两个敏感种群的ALS都没有发生突变，抗药性种群2014-JC-1的5个植株在相对 于拟南芥的第574位氨基酸的密码子发生TGG-TTG碱基突变，2014-JC-33的5个植株在相对 于拟南芥的第376位氨基酸的密码子发生GAT-GAA碱基突变。运个结果与已有的其他植物的 报道相符化ttp: //www. weedscience. o;rg/Mutations/MutationDisplayAll. as阳）。因此， 可W通过PCR的方法快速检测由于祀标突变引起的杂草的抗性。
[0093] 虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在 本发明基础上，可W对之作一些修改或改进，运对本领域技术人员而言是显而易见的。因 此，在不偏离本发明精神的基础上所做的运些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
【主权项】
1. 与荠菜抗药性相关的特异性DNA片段，其特征在于，所述特异性DNA片段为： (1)核苷酸序列如SEQ ID No.l所示的JC-ALS-1基因；所编码的蛋白的氨基酸序列如 SEQ ID No.3所示;其中，编码第571位氨基酸的密码子发生TGG-TTG碱基突变； 或（2)核苷酸序列如SEQ ID如.2所示的兀41^-2基因；所编码的蛋白的氨基酸序列如 SEQ ID No.4所示;其中，编码第570位氨基酸的密码子发生TGG-TTG碱基突变； 所述抗药性表现为抗乙酰乳酸合酶抑制剂类除草剂。2. 用于检测抗乙酰乳酸合酶抑制剂类除草剂荠菜的特异性PCR引物对，其特征在于，包 括用于特异性扩增权利要求1所述特异性DNA片段的引物对，引物对的核苷酸序列如下： 正向引物JC-ALS-F: 5 ' -TATTCGCTTACCCAGGTG-3 ' ； 反向引物JC-ALS-R: 5 '-GGTTCTGAGTTTCATCTCTCA-3 '。3. 用于检测抗乙酰乳酸合酶抑制剂类除草剂荠菜的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒 含有权利要求2所述引物对。4. 根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括dNTPs、Taq DNA聚合 酶、Mg2+、PCR反应缓冲液中的至少一种。5. 根据权利要求3或4所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括标准阳性模板。6. 特异性PCR引物对在检测抗乙酰乳酸合酶抑制剂类除草剂荠菜方面的应用，其特征 在于，特异性PCR引物对的核苷酸序列如下： 正向引物JC-ALS-F: 5 ' -TATTCGCTTACCCAGGTG-3 ' ； 反向引物JC-ALS-R: 5 '-GGTTCTGAGTTTCATCTCTCA-3 '。7. 根据权利要求6所述的应用，其特征在于，包括以下步骤： 1) 提取样品中的DNA; 2) 以步骤1)中提取的DNA为模板，利用所述引物对进行PCR扩增反应； 3) 分析PCR产物； 其中： PCR反应体系以20μ1计为： 模板DNA lul 2.5mM dN'lT^s 1 ul 1 ΟμΜ正向引物 0.5μ1 ΙΟμΜ 反向 I:丨物 0:,5:μ1 DNA聚合酶 rU 10. PCR反应缓冲液 2μ1 i5mM Mg2 0.5μ1 ddH20 朴足至20μ丨； PCR反应条件为:94°C预变性3分钟；94 °C变性1分钟，55.3 °C退火1分钟，72 °C延伸1分 钟，共30个循环;72 °C延伸10分钟。8. 权利要求3~5任一项所述的试剂盒在检测抗乙酰乳酸合酶抑制剂类除草剂荠菜中 的应用。9. 根据权利要求8所述的应用，其特征在于，包括以下步骤： 1) 提取样品中的DNA; 2) 以步骤1)中提取的DNA为模板，利用所述试剂盒对进行PCR扩增反应； 3) 分析PCR产物； 其中： PCR反应体系以20μ1计为： 模板DNA ΙμL 2.5mM dNTPs ΙμL ΙΟμΜ正向钥物 0.5μ1 ΙΟμΜ反向引物 0.5 μL 2? DNA聚合酶 1U 10. PCR反应缓冲液 2μ1 15mM Mg2 0.5μ1 ddll.O 补足至 20μ1; PCR反应条件为:94°C预变性3分钟；94 °C变性1分钟，55.3 °C退火1分钟，72 °C延伸1分 钟，共30个循环;72 °C延伸10分钟。10. 权利要求2所述引物在特异性扩增权利要求1所述特异性DNA片段中的应用。
【专利摘要】本发明是申请号为201410643602.9，名称为“与荠菜抗药性相关的分子标记及其检测试剂盒”专利申请的分案申请，本发明提供了与荠菜抗药性相关的特异性DNA片段和用于检测抗乙酰乳酸合酶抑制剂类除草剂荠菜的特异性PCR引物对，包括用于特异性扩增荠菜JC?ALS基因的引物对。采用该引物的PCR检测方法具有极好的特异性和灵敏性，能够实现对田间疑似抗ALS抑制剂荠菜的快速鉴定和突变位点的确认，从而指导生产实践中抗性杂草的科学治理。
【IPC分类】C12N15/11, C12N9/10, C12N15/54, C12Q1/68
【公开号】CN105713914
【申请号】CN201610191666
【发明人】崔海兰, 李香菊, 张宏军
【申请人】中国农业科学院植物保护研究所
【公开日】2016年6月29日
【申请日】2014年11月10日