一种利用固定化乳糖酶制备无乳糖乳制品的方法
【技术领域】
[0001]本发明公开了一种利用固定化乳糖酶制备无乳糖乳制品的方法，属于无乳糖乳制品制备技术领域。
【背景技术】
[0002]无乳糖是指用某种工艺(乳糖酶)去除了奶中的乳糖，乳糖酶分泌过少的人应该食用无乳糖的奶制品。
[0003]乳糖是动物乳汁中一种特有双糖，不能被人体直接吸收，必须经过乳糖酶水解成半乳糖和葡萄糖，而亚洲人由于没有日常饮用乳的习惯，很大一部分人群体内缺乏乳糖酶，喝牛奶后的典型表现是拉肚子，即乳糖不耐症。另外发酵乳在发酵的过程中，虽然一部分乳糖被分解，但是还有一定量的乳糖残留，乳糖不耐症严重者饮食发酵乳也会发生不适反应，同时，未有症状的乳糖不耐症患者，对发酵乳营养的吸收也大打折扣。因此，研发一种低乳糖甚至无乳糖的发酵乳具有重要的意义。
[0004]目前传统方法在制备无乳糖乳制品时，采用将乳糖酶加入鲜牛奶中将乳糖水解为葡糖糖和半乳糖，然后再接种发酵剂制得发酵乳，或者是将乳糖酶加入牛奶中并同时接种发酵剂制得低乳糖发酵乳，虽然该方法降低了发酵乳中乳糖的含量，但乳糖含量降低仍未达到国标规定的无乳糖限量，对乳糖不耐症患者严重的人仍然不适用，而且由于酸奶发酵过程中PH会持续降低，在中性奶中适用的乳糖酶在发酵阶段酶活性会降低甚至失效，导致酶解效率大幅降低，即使在配料过程中加大乳糖酶的使用量也无法制得国标限定的无乳糖发酵乳。
[0005]除此以外，目前乳糖酶并未在中国食品和乳制品工业中得到广泛的应用，主要原因是:(I)乳糖酶的单位产量较低；(2)市场上销售的乳糖酶多为胞内酶，酶的耐热性差、适用范围窄，且这种酵母来源的胞胞内酶，需破碎细胞才能得到，提取、纯化工艺繁杂，另外生活中适用的乳糖酶往往为游离酶，不仅成本高、适用范围窄，而且不能满足食品和乳制品工业多方面的需要。
【发明内容】
[0006]本发明主要解决的技术问题:针对目前在制备无乳糖乳制品的过程中，往往使用游离的乳糖酶对原料乳进行酶解，导致在发酵阶段酶活性会降低甚至失效，酶解效率大幅度降低，即使加大乳糖酶的使用量也无法制得国标限定的无乳糖发酵乳的现状，提供了一种通过脆壁克鲁维酵母菌发酵培养制得粗酶液，经盐析、脱盐制得纯化乳糖酶，将其用戊二醛交联固定在凹凸棒土上，制得固定化乳糖酶，再将其用于原料乳的酶解中，从而得到利用固定化乳糖酶制备无乳糖乳制品的方法。该方法操作简便，不仅利用固定化乳糖酶提高了酶的稳定性，降低了发酵乳中乳糖的含量，达到了国家规定的无乳糖标准，而且制得的无乳糖发酵乳产品口味极佳、营养丰富，容易被人体吸收，适合大规模生产应用。
[0007 ]为了解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案是: (1)按接种量为10%将脆壁克鲁维酵母菌接种于马铃薯培养基上，移入恒温箱中于30?35°C下培养3?4天，用棉签刮下孢子移入200?300mL灭菌后的质量浓度为0.9%的盐水中，放置在漩涡振荡仪中，以30?40W功率振荡分散30?40min制得孢子悬液，通过灭菌后的漏斗过滤，得孢子；
(2)再按IX 14?2X 14个/mL的接种量，将上述所得的孢子转接于发酵培养基中，于25?35°C条件下培养7?8天后过滤，得到发酵液，再用双层滤纸抽滤去除多余孢子，即得粗酶液；
(3)量取300?400mL得到的粗酶液，向里加入10?12g硫酸铵，于4?6°C的冰水浴中静置盐析12?14h后用高速离心机以10000?12000r/min转速离心分离得到沉淀，最后用pH为5.5的醋酸和醋酸钠缓冲液洗涤脱盐后即得纯化乳糖酶，备用；
(4)称取100?200g凹凸棒土用研钵研磨后过100目标准筛，分别用浓度为0.lmol/L盐酸和0.3mol/L氢氧化钠溶液摇床振荡浸渍10?12h，再放入马弗炉于300?400 °C下煅烧3?4h，得固定化酶载体；
(5)称取10?20g固定化酶载体装入IL锥形瓶中，加入400?500mLpH为7.0由磷酸氢二钠和磷酸二氢钠组成的磷酸缓冲液，静置10?12h后，再加入I?2g备用的纯化乳糖酶，移入4?6 °C冰水浴中，用磁力搅拌机以300?400r/min转速进行搅拌；
(6)在搅拌的过程中再加入50?60mL质量浓度为2%戊二醛溶液，升高水浴温度至30?35 V，继续搅拌交联反应4?6h后，过滤得滤渣，移入布氏漏斗中用pH为7.0磷酸缓冲液反复抽滤洗涤3?5遍后，即得固定化乳糖酶；
(7)称取I?2L原料乳、I?2g果胶、3?5g木糖醇和2?3g上述制得的固定化乳糖酶混合均匀后倒入酶解罐，设置酶解温度为35?40°C，保温酶解10?12h后，过滤回收固定化乳糖酶，将得到的酶解乳制品瞬时高温灭菌后即得利用固定化乳糖酶制备的无乳糖乳制品。
[0008]所述的马铃薯培养基是由200?300g马铃薯、20?30g葡萄糖、15?20g琼脂和IL蒸馏水复配制得。
[0009]所述的发酵培养基是由5?1g果胶、20?30g玉米、15?20g豆柏粉、2?3g硝酸铵、10?12g磷酸氢二钾和IL蒸馏水复配制得。
[0010]本发明的应用方法是:本发明利用固定化乳糖酶制备的无乳糖乳制品无需冷藏，早上食用早餐时，饮用200?300mL本发明制得的无乳糖乳制品，连续坚持食用20?25天，可明显感觉人体抵抗力得到提高，睡眠得到改善，且口味极佳、营养丰富，容易被人体吸收。
[0011]本发明的有益效果是:
(1)本发明方法独特新颖，利用固定化乳糖酶代替传统游离乳糖酶，不仅提高了酶的稳定性，降低了发酵乳中乳糖的含量，而且使得制得的无乳糖乳制品达到了国家规定的无乳糖标准；
(2)本发明制得的无乳糖乳制品口味极佳、营养丰富，容易被人体吸收，具有较好的市场前景，可大规模生产应用。
【具体实施方式】
[0012]首先按接种量为10%将脆壁克鲁维酵母菌接种于马铃薯培养基上，移入恒温箱中于30?35°C下培养3?4天，用棉签刮下孢子移入200?300mL灭菌后的质量浓度为0.9%的盐水中，放置在漩涡振荡仪中，以30?40W功率振荡分散30?40min制得孢子悬液，通过灭菌后的漏斗过滤，得孢子;然后再按I X 14?2X 14个/mL的接种量，将上述所得的孢子转接于发酵培养基中，于25?35°C条件下培养7?8天后过滤，得到发酵液，再用双层滤纸抽滤去除多余孢子，即得粗酶液;接下来量取300?400mL得到的粗酶液，向里加入10?12g硫酸铵，于4?6°C的冰水浴中静置盐析12?14h后用高速离心机以10000?12000r/min转速离心分离得到沉淀，最后用PH为5.5的醋酸和醋酸钠缓冲液洗涤脱盐后即得纯化乳糖酶，备用；之后称取100?200g凹凸棒土用研钵研磨后过100目标准筛，分别用浓度为0.1 mo I/L盐酸和
0.3mol/L氢氧化钠溶液摇床振荡浸渍10?12h，再放入马弗炉于300?400°C下煅烧3?4h，得固定化酶载体；随后称取10?20g固定化酶载体装入IL锥形瓶中，加入400?500mL pH为7.0由磷酸氢二钠和磷酸二氢钠组成的磷酸缓冲液，静置10?12h后，再加入I?2g备用的纯化乳糖酶，移入4?6 °C冰水浴中，用磁力搅拌机以300?400r/min转速进行搅拌;在搅拌的过程中再加入50?60mL质量浓度为2%戊二醛溶液，升高水浴温度至30?35°C，继续搅拌交联反应4?6h后，过滤得滤渣，移入布氏漏斗中用pH为7.0磷酸缓冲液反复抽滤洗涤3?5遍后，即得固定化乳糖酶;最后称取I?2L原料乳、I?2g果胶、3?5g木糖醇和2?3g上述制得的固定化乳糖酶混合均匀后倒入酶解罐，设置酶解温度为35?40°C，保温酶解10?12h后，过滤回收固定化乳糖酶，将得到的酶解乳制品瞬时高温灭菌后即得利用固定化乳糖酶制备的无乳糖乳制品。其中所述的马铃薯培养基是由200?300g马铃薯、20?30g葡萄糖、15?20g琼脂和IL蒸馏水复配制得，所述的发酵培养基是由5?1g果胶、20?30g玉米、15?20g豆柏粉、2?3g硝酸铵、10?12g磷酸氢二钾和IL蒸馏水复配制得。
[0013]实例I
首先按接种量为10%将脆壁克鲁维酵母菌接种于马铃薯培养基上，移入恒温箱中于30°C下培养3天，用棉签刮下孢子移入200mL灭菌后的质量浓度为0.9%的盐水中，放置在漩涡振荡仪中，以30W功率振荡分散30min制得孢子悬液，通过灭菌后的漏斗过滤，得孢子;然后再按I X 14个/mL的接种量，将上述所得的孢子转接于发酵培养基中，于25°C条件下培养7天后过滤，得到发酵液，再用双层滤纸抽滤去除多余孢子，即得粗酶液;接下来量取300mL得到的粗酶液，向里加入1g硫酸铵，于4°C的冰水浴中静置盐析12h后用高速离心机以lOOOOr/min转速离心分离得到沉淀，最后用pH为5.5的醋酸和醋酸钠缓冲液洗涤脱盐后即得纯化乳糖酶，备用；之后称取10g凹凸棒土用研钵研磨后过100目标准筛，分别用浓度为
0.lmol/L盐酸和0.3mol/L氢氧化钠溶液摇床振荡浸渍10h，再放入马弗炉于300°C下煅烧3h，得固定化酶载体;随后称取1g固定化酶载体装入IL锥形瓶中，加入400mL pH为7.0由磷酸氢二钠和磷酸二氢钠组成的磷酸缓冲液，静置1h后，再加入Ig备用的纯化乳