专利名称：修饰的米曲霉乳糖酶及其制备方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及修饰的酶及其制备方法，尤其涉及修饰的米曲霉乳糖酶及其制备方法和应用，属于米曲霉乳糖酶的修饰领域。
背景技术：
随着人们生活水平的提高，健康的饮食习惯越来越受到重视，最明显的表现就是乳及乳制品的消费量迅速增加。但是亚洲人口中约有70%的人患有不同程度的“乳糖不耐症”，“乳糖不耐症”在很大程度上限制了人们对乳及乳制品的摄入，会产生一系列不良影响，如引发钙吸收不良、腹泻、软骨病和骨质疏松等，阻碍了乳工业的发展。利用乳糖酶降解乳糖目前是解决“乳糖不耐症”的最佳处理方法。
乳糖酶(Lactase)是一类催化特殊类型的糖苷键——β -半乳糖苷类化合物中 β -半乳糖苷键发生水解断裂的酶。乳糖酶能将乳糖水解为半乳糖和葡萄糖，并具有半乳糖苷的转移作用，在乳糖分子的半乳糖一侧连接1-4个半乳糖，生成低聚半乳糖。米曲霉乳糖酶是胞外酶，发酵成本低，分离提取方便，而且较耐热、耐酸，稳定性好。米曲霉乳糖酶属高温乳糖酶，最适作用温度较高，一般在50°C以上，生产中能有效地防止杂菌的污染；反应速度快，反应时间短，酶的用量少，生产效率高。
乳糖酶可广泛应用于食品工业和医药工业。乳糖酶可以将乳糖水解为葡萄糖和半乳糖，可明显提高乳制品的甜度，减少甜味剂的用量，降低乳制品中乳糖的含量，提高乳制品的可消化性。由于乳糖的溶解度较低，在冷冻乳制品中容易结晶析出，影响产品的质量，乳糖的降解可以克服乳制品中乳糖的析出问题，从而延长产品的货架期。在发酵乳制作酸乳中添加乳糖酶，可以缩短发酵时 间，减少蔗糖用量，改善发酵乳的风味和口感。乳糖酶可以催化半乳糖基转移反应，因此可以用于低聚半乳糖的生产，低聚半乳糖是一种具有天然属性的功能性低聚糖，能够促进人体肠道内有益菌的增殖；促进矿物元素的吸收，特别是促进钙的吸收；改善脂质代谢，降低血清中胆固醇的浓度，提高血清中高密度脂蛋白所占比例。乳糖酶在医药工业中可做为助消化类药物，适用于婴儿各种消化不良症，如先天性乳糖酶缺乏症、由胃障碍及缺铁所致的幼儿慢性腹泻、幼儿及新生儿腹泻、由感冒及消化不良等引起的继发性腹泻，特别是霉菌所产的乳糖酶耐酸性较强，不被胃酸分解，能够到达小肠降解乳糖，缓解消化不良等症状。
聚乙二醇(PEG)是一种惰性、两亲、不带电荷的柔性长链高分子聚合物，是一种安全载体，PEG通过共价键与蛋白质连接，可以与蛋白质分子中的α-氨基、ξ_氨基反应对蛋白质分子进行修饰，通过对蛋白质表面氨基进行修饰以有效地改变蛋白质的生理特性。修饰后的蛋白质具有一些特殊的性质1、PEG化可以使蛋白质稳定性、抗酸能力、抗变性能力及抗蛋白酶水解能力提高；2、PEG化可以降低蛋白质的药物抗原性，扩大应用范围；3、PEG 化对酶活性影响不太，大多数酶活性损失不大。
米曲霉乳糖酶分子量在90000Da左右，最适反应温度为55°C，低温下相对稳定， 4°C保存I个月后，酶活开始下降，高温条件下稳定性较差，70°C保温2h，残留酶活力几乎完全丧失，仅存5%左右；最适反应pH值为5. 5, pH值为4. O 8. O时相对稳定。在最适条件下，米曲霉乳糖酶活力为13000U/g。发明内容
本发明的目的之一是将米曲霉乳糖酶用聚乙二醇或其衍生物进行修饰得到修饰的米曲霉乳糖酶；
本发明的目的之二是提供一种修饰米曲霉乳糖酶的方法；
本发明的上述目的是通过以下技术方案来实现的
聚乙二醇修饰的米曲霉乳糖酶，其结构通式为=R1-NH-R2 ；
其中，R1为活化的聚乙二醇或活化的聚乙二醇衍生物；
优选的，所述的活化的聚乙二醇是单甲氧基聚乙二醇；
所述的活化的聚乙二醇衍生物选自单甲氧基聚乙二醇三氟乙基磺酸酯、单甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺碳酸酯、单甲氧基聚乙二醇苯并三唑碳酸酯、单甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺琥珀酸酯、甲酸甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺酯、乙酸甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺酯、 丙酸甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺酯、丁酸甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺酯、单甲氧基聚乙二醇甲醛或单甲氧基聚乙二醇乙醛；
其中，所述的聚乙二醇是直链的聚乙二醇或是带支链的聚乙二醇，聚乙二醇的分子量为5000 20000 ；
R2为去除一个氨基的米曲霉乳糖酶分子。
本发明的另外一个目的是提供制备所述聚乙二醇修饰的米曲霉乳糖酶的方法，该方法包括以下步骤
将米曲霉乳糖酶溶液的pH值调节为弱酸性或中性，加入活化的聚乙二醇或活化的聚乙二醇衍生物进行修饰反应，得到聚乙二醇修饰的米曲霉乳糖酶；
本发明通过实验发现，米曲霉乳糖酶溶液的pH值对于修饰反应的修饰率以及修饰后产物的相对酶活有较为明显的影响；本发明通过大量的试验发现，将米曲霉乳糖酶溶液的PH值调节为4. 5 7. 5时，能够有效提升修饰率，修饰后的米曲霉乳糖酶也能保持较高的酶活；本发明通过进一步的实验发现，当米曲霉乳糖酶溶液的pH值为5. O 6. O,尤其是5. 5时，不仅修饰率达到最高点，修饰的产物-米曲霉乳糖酶也能保持较高的酶活；为此， 本发明修饰反应中，米曲霉乳糖酶溶液的PH值优选为5. O 6. O,最优选为5. 5。
本发明通过实验发现米曲霉乳糖酶溶液的浓度对修饰效果影响不大，所以在修饰反应中米曲霉乳糖酶溶液的浓度可以根据反应的情况(例如所加入活化剂的浓度等)进行调整，作为参考，本发明修饰反应中的米曲霉乳糖酶溶液的浓度可以为500 5000U/mL，优选为 2000U/mL。
本发明通过大量的试验进一步发现，所加入的活化剂(活化的聚乙二醇或活化的聚乙二醇的衍生物)与米曲霉乳糖酶的摩尔比对于修饰反应的修饰率以及修饰后产物米曲霉乳糖酶的酶活有非常显著的影响；本发明通过大量的筛选试验发现，所加入的活化剂 (活化的聚乙二醇或活化的聚乙二醇的衍生物)与米曲霉乳糖酶的摩尔比为3 20 :1，修饰反应的产物具有较高的修饰率，产物也能保持较高的酶活；活化剂与米曲霉乳糖酶的摩尔比优选为15 20 :1，进一步优选为16 20 :1，特别优选为16 17 :1，在上述摩尔比范围内，修饰率不仅有非常显著的提升，修饰后的米曲霉乳糖酶也能保持较高的酶活，其中，当活化剂与米曲霉乳糖酶的摩尔比为16:1时，修饰后的米曲霉乳糖酶在相对酶活和修饰率之间达到了最佳平衡。
所述的修饰反应的温度优选为4 37°C，优选为20 25°C，最优选为25°C。
所述的修饰反应的时间优选为10 120分钟，优选为25 40分钟，最优选为30分钟。
本发明进一步提供一种从上述修饰反应产物中分离和纯化聚乙二醇修饰的米曲霉乳糖酶的方法，该方法包括以下步骤
将反应产物依次经过离子交换层析和凝胶过滤层析提纯，去除游离的聚乙二醇 (PEG)和未反应蛋白，得到纯化的聚乙二醇修饰的米曲霉乳糖酶。
所述的离子交换层析可以采用阳离子交换层析进行分离，使用的阳离子交换介质包括聚苯乙烯型、纤维素型、葡聚糖型、琼脂糖型等，阳离子交换体积可以为6 600mL，流速可以为O. 5 50mL/min，用起始缓冲液平衡3 8倍柱体积，上液量为2 200mL，先用 I 5倍柱体积的起始缓冲液洗脱未吸附部分，再使用梯度洗脱，梯度液组成为起始缓冲液、起始缓冲液+0 O. 4mol/LNaCl溶液，洗脱3 15倍柱体积；所述起始缓冲液可使用磷酸盐缓冲液和醋酸盐缓冲液等，PH值在4. 5 7. 5 ;收集各组分洗脱液，采用高效液相色谱分析各组分，合并聚乙二醇修饰的米曲霉乳糖酶。
所述的凝胶过滤层析的方法包括将离子交换层析中所收集的洗脱液用醋酸纤维素膜超滤浓缩，取浓缩液做凝胶过滤层析，使用的凝胶过滤介质包括葡聚糖型和琼脂糖型等，凝胶过滤层析柱体积可以为25 2500mL，流速可以为O.1 10mL/min，pH4. 5 7. 5缓冲液平衡I 2倍体积，上液量为O. 2 20mL，pH4. O 7. O缓冲液洗脱I 2倍体积，收集各洗脱组分，采用高效液相色谱分析，合并聚乙二醇修饰的米曲霉乳糖酶，得到纯化的聚乙二醇修饰的米曲霉乳糖酶。
采用本发明方法所制备得到的聚乙二醇修饰的米曲霉乳糖酶，米曲霉乳糖酶转化率在90%以上，修饰后的米曲霉乳糖酶相比未修饰酶，其酶活能保持在85%以上，修饰后的米曲霉乳糖酶热稳定性和抗酸能力有显著提高；修饰后的乳糖酶抗蛋白酶水解能力显著提高，稳定性提高；修饰后的米曲霉乳糖酶的免疫抗原性明显降低，扩大了应用范围。
具体实施方式
下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
1、乳糖酶活力测定方法
以邻硝基苯-β -D-半乳糖苷(ONPG)为底物，在一定条件下水解，生成邻硝基苯酚 (ONP)和半乳糖，邻硝基苯酚在420nm处有特异性吸收，用分光光度计测定OD值，与标准曲线比较测定生成的邻硝基苯酚的量。
酶活定义每分钟水解ONPG产生I μ mo I邻硝基苯酚所需的酶量为1U。
2、乳糖酶修饰率的测定方法
取Iml含O.1 Img修饰蛋白的溶液，加入lmL4%pH8. O的磷酸盐缓冲液，20分钟后加入Iml O. 1%2，4，6 一三硝基苯磺酸钠(TNBS)溶液，40°C保温2小时，再加入lmL10%十二烷基磺酸钠溶液和O. 5ml lmol/L的盐酸终止反应。335nm下读取吸光度。同样浓度的蛋白质在修饰反应前后光吸收值之比即为残留氨基量。
修饰率=1-残留氨基率。
实施例1乳糖酶的修饰及分离纯化
将米曲霉乳糖酶溶液(2000U/mL)的pH值调节5. 5，加入单甲氧基聚乙二醇(购自上海炎怡生物科技有限公司)进行修饰反应，所加入的单甲氧基聚乙二醇与米曲霉乳糖酶的摩尔比为16 1 ;修饰反应的温度为25°C，反应40分钟，得到含有聚乙二醇修饰的米曲霉乳糖酶的反应产物；
将上述反应产物采用离子交换层析和凝胶过滤层析，分离并纯化得到聚乙二醇修饰的米曲霉乳糖酶
离子交换层析将反应产物采用阳离子交换层析进行分离，使用的阳离子交换介质为聚苯乙烯型，阳离子交换体积为IOOmL,流速为20mL/min，用起始缓冲液平衡6倍柱体积，上液量为IOOmL,先用I 5倍柱体积的起始缓冲液洗脱未吸附部分，再使用梯度洗脱， 梯度液组成为起始缓冲液(磷酸盐缓冲液，PH值在5. 5)、起始缓冲液+0. 2mol/L NaCl溶液， 洗脱6倍柱体积，收集各组分洗脱液；
凝胶过滤层析将洗脱液用醋酸纤维素膜超滤浓缩，取浓缩液做凝胶过滤层析，使用的凝胶过滤介质(葡聚糖型)，凝胶过滤层析柱体积为500mL,流速为5mL/min,pH5. 5缓冲液平衡2倍体积，上液量为10mL，pH5. 5缓冲液洗脱2倍体积，收集各洗脱组分，采用高效液相色谱分析，合并聚乙二醇修饰的米曲霉乳糖酶，得到纯化的聚乙二醇修饰的米曲霉乳糖酶。
经检测，本实施例所制备的聚乙二醇修饰的米曲霉乳糖酶的相对酶活为89. 3%，修饰率为68. 9%。
实施例2乳糖酶的修饰
将米曲霉乳糖酶溶液(2000U/mL)的pH值调节5. 5，加入单甲氧基聚乙二醇三氟乙基磺酸酯(购自上海炎怡生物科技有限公司)进行修饰反应，所加入的单甲氧基聚乙二醇三氟乙基磺酸酯与米曲霉乳糖酶的摩尔比为3 1 ;修饰反应的温度为25°C，反应时间为40分钟，得到含有聚乙二醇修饰的米曲霉乳糖酶的反应产物。
将反应产物采用离子交换层析和凝胶过滤层析，分离并纯化得到聚乙二醇修饰的米曲霉乳糖酶
将上述反应产物采用离子交换层析和凝胶过滤层析，分离并纯化得到聚乙二醇修饰的米曲霉乳糖酶
离子交换层析将反应产物采用阳离子交换层析进行分离，使用的阳离子交换介质为聚苯乙烯型，阳离子交换体积为IOOmL,流速为20mL/min，用起始缓冲液平衡6倍柱体积，上液量为IOOmL,先用I 5倍柱体积的起始缓冲液洗脱未吸附部分，再使用梯度洗脱， 梯度液组成为起始缓冲液(磷酸盐缓冲液，PH值在5. 5)、起始缓冲液+0. 2mo 1/L NaCl溶液，洗脱6倍柱体积，收集各组分洗脱液；
凝胶过滤层析将洗脱液用醋酸纤维素膜超滤浓缩，取浓缩液做凝胶过滤层析，使用的凝胶过滤介质(葡聚糖型)，凝胶过滤层析柱体积为500mL,流速为5mL/min,pH5. 5缓冲液平衡2倍体积，上液量为10mL，pH5. 5缓冲液洗脱2倍体积，收集各洗脱组分，采用高效液相色谱分析，合并聚乙二醇修饰的米曲霉乳糖酶，得到纯化的聚乙二醇修饰的米曲霉乳糖酶。
经检测，本实施例所制备的聚乙二醇修饰的米曲霉乳糖酶的相对酶活为97. 3%，修饰率为11. 6%ο
实施例3乳糖酶的修饰
将米曲霉乳糖酶溶液(2000U/mL)的pH值调节5. 5，加入甲酸甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺酯(购自上海炎怡生物科技有限公司)进行修饰反应，所加入的甲酸甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺酯与米曲霉乳糖酶的摩尔比20 1 ;修饰反应的温度为25°C，修饰反应的时间为 40分钟，得到含有聚乙二醇修饰的米曲霉乳糖酶的反应产物。
将反应产物采用离子交换层析和凝胶过滤层析，分离并纯化得到聚乙二醇修饰的米曲霉乳糖酶
离子交换层析将反应产物采用阳离子交换层析进行分离，使用的阳离子交换介质为聚苯乙烯型，阳离子交换体积为IOOmL,流速为20mL/min，用起始缓冲液平衡6倍柱体积，上液量为IOOmL,先用I 5倍柱体积的起始缓冲液洗脱未吸附部分，再使用梯度洗脱， 梯度液组成为起始缓冲液(磷酸盐缓冲液，PH值在5. 5)、起始缓冲液+0. 2mo 1/L NaCl溶液，洗脱6倍柱体积，收集各组分洗脱液；
凝胶过滤层析将洗脱液用醋酸纤维素膜超滤浓缩，取浓缩液做凝胶过滤层析，使用的凝胶过滤介质(葡聚糖型)，凝胶过滤层析柱体积为500mL,流速为5mL/min,pH5. 5缓冲液平衡2倍体积，上液量为10mL，pH5. 5缓冲液洗脱2倍体积，收集各洗脱组分，采用高效液相色谱分析，合并聚乙二醇修饰的米曲霉乳糖酶，得到纯化的聚乙二醇修饰的米曲霉乳糖 酶。
经检测，本实施例所制备的聚乙二醇修饰的米曲霉乳糖酶的相对酶活为67. 8%，修饰率为78. 2%。
实施例4乳糖酶的修饰
将米曲霉乳糖酶溶液(2000U/mL)的pH值调节为7. 5，加入丙酸甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺酯(购自上海炎怡生物科技有限公司)进行修饰反应，所加入的丙酸甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺酯与米曲霉乳糖酶的摩尔比为15 1 ;修饰反应的温度为37°C，修饰反应的时间为10分钟；得到含有聚乙二醇修饰的米曲霉乳糖酶的反应产物。
将反应产物采用离子交换层析和凝胶过滤层析，分离并纯化得到聚乙二醇修饰的米曲霉乳糖酶
离子交换层析将反应产物采用阳离子交换层析进行分离，使用的阳离子交换介质为聚苯乙烯型，阳离子交换体积为IOOmL,流速为20mL/min，用起始缓冲液平衡6倍柱体积，上液量为IOOmL,先用I 5倍柱体积的起始缓冲液洗脱未吸附部分，再使用梯度洗脱， 梯度液组成为起始缓冲液(磷酸盐缓冲液，PH值在7. 5)、起始缓冲液+0. 2mol/L NaCl溶液， 洗脱6倍柱体积，收集各组分洗脱液；
凝胶过滤层析将洗脱液用醋酸纤维素膜超滤浓缩，取浓缩液做凝胶过滤层析，使用的凝胶过滤介质(葡聚糖型)，凝胶过滤层析柱体积为500mL,流速为5mL/min,pH7. 5缓冲液平衡2倍体积，上液量为10mL，pH5. 5缓冲液洗脱2倍体积，收集各洗脱组分，采用高效液相色谱分析，合并聚乙二醇修饰的米曲霉乳糖酶，得到纯化的聚乙二醇修饰的米曲霉乳糖酶。
经检测，本实施例所制备的聚乙二醇修饰的米曲霉乳糖酶的相对酶活为85. 2%，修饰率为54. 6%。
实施例5乳糖酶的修饰
将米曲霉乳糖酶溶液(2000U/mL)的pH值调节为5. 5，加入单甲氧基聚乙二醇(购自上海炎怡生物科技有限公司)进行修饰反应，所加入的单甲氧基聚乙二醇与米曲霉乳糖酶的摩尔比为17 1 ;修饰反应的温度为25°C，修饰反应的时间为40分钟；得到含有聚乙二醇修饰的米曲霉乳糖酶的反应产物。
将反应产物采用离子交换层析和凝胶过滤层析，分离并纯化得到聚乙二醇修饰的米曲霉乳糖酶
离子交换层析将反应产物采用阳离子交换层析进行分离，使用的阳离子交换介质为聚苯乙烯型，阳离子交换体积为IOOmL,流速为20mL/min，用起始缓冲液平衡6倍柱体积，上液量为IOOmL,先用I 5倍柱体积的起始缓冲液洗脱未吸附部分，再使用梯度洗脱， 梯度液组成为起始缓冲液(磷酸盐缓冲液，PH值在5. 5)、起始缓冲液+0. 2mol/L NaCl溶液， 洗脱6倍柱体积，收集各组分洗脱液；
凝胶过滤层析将洗脱液用醋酸纤维素膜超滤浓缩，取浓缩液做凝胶过滤层析，使用的凝胶过滤介质(葡聚糖型)，凝胶过滤层析柱体积为500mL,流速为5mL/min,pH5. 5缓冲液平衡2倍体积，上液量为10mL，pH5. 5缓冲液洗脱2倍体积，收集各洗脱组分，采用高效液相色谱分析，合并聚乙二醇修饰的米曲霉乳糖酶，得到纯化的聚乙二醇修饰的米曲霉乳糖酶。
经检测，本实施例所制备的聚乙二醇修饰的米曲霉乳糖酶的相对酶活为78. 1%，修饰率为69. 2%。
实施例6乳糖酶的修饰
将米曲霉乳糖酶溶液(2000U/mL)的pH值调节为5. 5，加入单甲氧基聚乙二醇(购自上海炎怡生物科技有限公司)进行修饰反应，所加入的单甲氧基聚乙二醇与米曲霉乳糖酶的摩尔比为15 1 ;修饰反应的温度为25°C，修饰反应的时间为40分钟；得到含有聚乙二醇修饰的米曲霉乳糖酶的反应产物。
将反应产物采用离子交换层析和凝胶过滤层析，分离并纯化得到聚乙二醇修饰的米曲霉乳糖酶
离子交换层析将反应产物采用阳离子交换层析进行分离，使用的阳离子交换介质为聚苯乙烯型，阳离子交换体积为IOOmL,流速为20mL/min，用起始缓冲液平衡6倍柱体积，上液量为IOOmL,先用I 5倍柱体积的起始缓冲液洗脱未吸附部分，再使用梯度洗脱， 梯度液组成为起始缓冲液(磷酸盐缓冲液，PH值在5. 5)、起始缓冲液+0. 2mol/L NaCl溶液， 洗脱6倍柱体积，收集各组分洗脱液；
凝胶过滤层析将洗脱液用醋酸纤维素膜超滤浓缩，取浓缩液做凝胶过滤层析，使用的凝胶过滤介质(葡聚糖型)，凝胶过滤层析柱体积为500mL,流速为5mL/min,pH5. 5缓冲液平衡2倍体积，上液量为10mL，pH5. 5缓冲液洗脱2倍体积，收集各洗脱组分，采用高效液相色谱分析，合并聚乙二醇修饰的米曲霉乳糖酶，得到纯化的聚乙二醇修饰的米曲霉乳糖酶。
经检测，本实施例所制备的聚乙二醇修饰的米曲霉乳糖酶的相对酶活为85. 7%，修饰率为53. 2%。
实施例7乳糖酶的修饰
将米曲霉乳糖酶溶液(2000U/mL)的pH值调节5. 5，加入单甲氧基聚乙二醇甲醛 (购自上海炎怡生物科技有限公司)进行修饰反应，所加入的单甲氧基聚乙二醇甲醛与米曲霉乳糖酶的摩尔比为12 1 ;修饰反应的温度为25°C，修饰反应的时间为40分钟；得到含有聚乙二醇修饰的米曲霉乳糖酶的反应产物。
将反应产物采用离子交换层析和凝胶过滤层析，分离并纯化得到聚乙二醇修饰的米曲霉乳糖酶
离子交换层析将反应产物采用阳离子交换层析进行分离，使用的阳离子交换介质为聚苯乙烯型，阳离子交换体积为IOOmL,流速为20mL/min，用起始缓冲液平衡6倍柱体积，上液量为IOOmL,先用I 5倍柱体积的起始缓冲液洗脱未吸附部分，再使用梯度洗脱， 梯度液组成为起始缓冲液(磷酸盐缓冲液，PH值在5. 5)、起始缓冲液+0. 2mol/L NaCl溶液， 洗脱6倍柱体积，收集各组分洗脱液；
凝胶过滤层析将洗脱液用醋酸纤维素膜超滤浓缩，取浓缩液做凝胶过滤层析，使用的凝胶过滤介质(葡聚糖型)，凝胶过滤层析柱体积为500mL,流速为5mL/min,pH5. 5缓冲液平衡2倍体积，上液量为10mL，pH5. 5缓冲液洗脱2倍体积，收集各洗脱组分，采用高效液相色谱分析，合并聚乙二醇修饰的米曲霉乳糖酶，得到纯化的聚乙二醇修饰的米曲霉乳糖酶。
经检测，本实施例所制备的聚乙二醇修饰的米曲霉乳糖酶的相对酶活为89. 6%，修饰率为47. 6%。
实施例8乳糖酶的修饰
将米曲霉乳糖酶溶液(2000U/mL)的pH值调节5. 5，加入单甲氧基聚乙二醇乙醛 (购自上海炎怡生物科技有限公司)进行修饰反应，所加入的单甲氧基聚乙二醇乙醛与米曲霉乳糖酶的摩尔比为8 1 ;修饰反应的温度为25°C，修饰反应的时间为40分钟；得到含有聚乙二醇修饰的米曲霉乳糖酶的反应产物。
将反应产物采用离子交换层析和凝胶过滤层析，分离并纯化得到聚乙二醇修饰的米曲霉乳糖酶
离子交换层析将反应产物采用阳离子交换层析进行分离，使用的阳离子交换介质为聚苯乙烯型，阳离子交换体积为IOOmL,流速为20mL/min，用起始缓冲液平衡6倍柱体积，上液量为IOOmL,先用I 5倍柱体积的起始缓冲液洗脱未吸附部分，再使用梯度洗脱， 梯度液组成为起始缓冲液(磷酸盐缓冲液，PH值在5. 5)、起始缓冲液+0. 2mol/L NaCl溶液， 洗脱6倍柱体积，收集各组分洗脱液；
凝胶过滤层析将洗脱液用醋酸纤维素膜超滤浓缩，取浓缩液做凝胶过滤层析，使用的凝胶过滤介质(葡聚糖型)，凝胶过滤层析柱体积为500mL,流速为5mL/min,pH5. 5缓冲液平衡2倍体积，上液量为10mL，pH5. 5缓冲液洗脱2倍体积，收集各洗脱组分，采用高效液相色谱分析，合并聚乙二醇修饰的米曲霉乳糖酶，得到纯化的聚乙二醇修饰的米曲霉乳糖酶。
经检测，本实施例所制备的聚乙二醇修饰的米曲霉乳糖酶的相对酶活为92. 9%，修饰率为31. 7%。
实验例I乳糖酶热稳定性实验
1、实验材料
供试材料实施例1-8所制备的修饰后米曲霉乳糖酶；
对照材料未修饰的米曲霉乳糖酶；
2、实验方法
将供试材料和对照材料分别在不同温度条件下(60°C ,70°C)的水浴中保存，不同时间(O. 5小时、I小时、2小时、3小时、4小时)后取样，迅速用冰水冷却至55°C，测定乳糖酶残留的活力。
3、实验结果
实验结果表明，70°C保温2h后，未修饰米曲霉乳糖酶(对照材料)活力几乎完全丧失，仅存5% ;而修饰的米曲霉乳糖酶(供试材料)的相对酶活平均为43. 1%，保温4h后，相对酶活仍平均有20%。
实验例2乳糖酶pH稳定性实验
1、实验材料
供试材料实施例1-8所制备的修饰后米曲霉乳糖酶；
对照材料未修饰米曲霉乳糖酶；
2、实验方法
将供试材料和对照材料分别溶于不同pH值(pH2、pH3、pH4、pH5、pH6、pH7、pH8、 pH9、pH10)的缓冲液中保存，不同时间点取样，测定乳糖酶残留的活力。
3、实验结果
实验结果表明，相同条件下，实施例1-8所制备的PEG化乳糖酶残余酶活均比未修饰酶高，尤其是在pH较低条件下，如pH为3时，保存2h后，未修饰米曲霉乳糖酶相对酶活仅为40%，而实施例1-8所制备的PEG化乳糖酶相对酶活平均达75%，供试材料显示出更高的pH稳定性。
实验例3乳糖酶抗酶解能力实验
1、实验材料
供试材料实施例1-8所制备的修饰后米曲霉乳糖酶；
对照材料未修饰米曲霉乳糖酶
2、实验方法
将未修饰米曲霉乳糖酶和修饰后米曲霉乳糖酶Iml分别加入人工肠液9ml中，充分混匀，37°C保温，O. 5h时、Ih时、2h时、3h时分别取样测定剩余酶活力。
人工肠液取磷酸二氢钾6. 8g,加水500ml使之溶解,用O. 4%的氢氧化钠溶液调节pH至6. 8 ;另取胰酶IOg加水适量溶解，将两液混合后，加水稀释至IOOOml即可。
3、实验结果
实验结果表明保温3h后，本发明实施例1-8所制备的修饰后米曲霉乳糖酶残留酶活为73%，而未修饰米曲霉乳糖酶不到60%，修饰后的米曲霉乳糖酶比未修饰酶对蛋白酶具有更好的抗性。
实验例4活化剂与乳糖酶的摩尔比对修饰效果的影响实验
1、实验方法
将活化剂单甲氧基聚乙二醇与乳糖酶按照表I所述的摩尔比溶于5mLpH值5. 5的乙酸缓冲液或磷酸盐缓冲液中，室温(20-25°C)下反应40分钟，然后在反应液中分别加入 lmol/L甘氨酸1. 5mL终止反应，以未修饰的乳糖酶的活力为100%，分别测定产物的酶活变化和修饰率。
2、实验结果
实验结果见表I。
表I
权利要求
1.聚乙二醇修饰的米曲霉乳糖酶，其特征在于，其结构通式为=R1-NH-R2；其中，R1为活化的聚乙二醇或活化的聚乙二醇衍生物；R2为去除一个氨基的米曲霉乳糖酶分子。
2.按照权利要求1所述的聚乙二醇修饰的米曲霉乳糖酶，其特征在于所述的活化的聚乙二醇是单甲氧基聚乙二醇；所述的活化的聚乙二醇衍生物选自单甲氧基聚乙二醇三氟乙基磺酸酯、单甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺碳酸酯、单甲氧基聚乙二醇苯并三唑碳酸酯、单甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺琥珀酸酯、甲酸甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺酯、乙酸甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺酯、丙酸甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺酯、丁酸甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺酯、单甲氧基聚乙二醇甲醛或单甲氧基聚乙二醇乙醛。
3.按照权利要求1所述的聚乙二醇修饰的米曲霉乳糖酶，其特征在于所述的聚乙二醇是直链的聚乙二醇或是带支链的聚乙二醇，聚乙二醇的分子量为5000 20000。
4.一种制备权利要求1-3任何一项所述聚乙二醇修饰的米曲霉乳糖酶的方法，该方法包括以下步骤将米曲霉乳糖酶溶液的PH值调节为弱酸性或中性，加入活化的聚乙二醇或活化的聚乙二醇衍生物进行修饰反应，得到聚乙二醇修饰的米曲霉乳糖酶。
5.按照权利要求4所述的方法，其特征在于将米曲霉乳糖酶溶液的pH值调节为.4.5 7. 5，优选为5. 5。
6.按照权利要求4所述的方法，其特征在于所加入的活化的聚乙二醇或活化的聚乙二醇的衍生物与米曲霉乳糖酶的摩尔比为3 20 :1，优选为15 .20 :1，更优选为16 20 :1，最优选为16 =I0
7.按照权利要求4所述的方法，其特征在于所述的修饰反应的温度为4 37°C，优选为20 25 °C，最优选为25 °C。
8.按照权利要求4所述的方法，其特征在于所述的修饰反应的时间为10 120分钟， 优选为25 40分钟，最优选为30分钟。
9.按照权利要求4所述的方法，其特征在于所述的所述的活化的聚乙二醇是单甲氧基聚乙二醇；所述的活化的聚乙二醇衍生物选自单甲氧基聚乙二醇三氟乙基磺酸酯、单甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺碳酸酯、单甲氧基聚乙二醇苯并三唑碳酸酯、单甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺琥珀酸酯、甲酸甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺酯、乙酸甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺酯、丙酸甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺酯、丁酸甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺酯、单甲氧基聚乙二醇甲醛或单甲氧基聚乙二醇乙醛。
10.按照权利要求4所述的方法，其特征在于，还包括以下步骤将反应产物依次经过离子交换层析和凝胶过滤层析提纯，去除游离的聚乙二醇和未反应蛋白，得到纯化的聚乙二醇修饰的米曲霉乳糖酶。
全文摘要
本发明公开了修饰的米曲霉乳糖酶及其制备方法和应用。所述聚乙二醇修饰的米曲霉乳糖酶的结构通式为R1-NH-R2；其中，R1为活化的聚乙二醇或活化的聚乙二醇衍生物；R2为去除一个氨基的米曲霉乳糖酶分子。本发明进一步公开了制备所述修饰的米曲霉乳糖酶的方法，该方法包括将米曲霉乳糖酶溶液的pH值调节为酸性或中性，加入活化的聚乙二醇或活化的聚乙二醇衍生物进行修饰反应得到聚乙二醇修饰的米曲霉乳糖酶。本发明方法米曲霉乳糖酶转化率高，所修饰得到的米曲霉乳糖酶酶活保持在85%以上，热稳定性和抗酸能力有显著提高，免疫抗原性有所降低，扩大了应用范围。
文档编号C12N9/38GK102994477SQ201210487038
公开日2013年3月27日 申请日期2012年11月26日 优先权日2012年11月26日
发明者赵从波, 陈文杰, 马清河, 章淑艳, 李军, 王云鹏, 秦艳梅 申请人:河北省微生物研究所