专利名称：中性液体乳糖酶生产方法
技术领域：
本发明涉及的是一种活性酶的制备方法，具体地说是一种活性乳糖酶的制备方法。
背景技术：
人体小肠中可分解乳糖的酶有乳糖酶(lactase)和β-半乳糖苷酶(β-galactosidase)，乳糖酶位于小肠粘膜刷状缘，而β-半乳糖苷酶位于溶酶体内，不能分解肠腔中的乳糖。乳糖酶缺乏是指小肠刷状缘绒毛膜细胞的膜结合酶即乳糖酶活性低下。乳糖酶缺乏有三种类型(1)先天性乳糖酶缺乏是指自出生时机体乳糖酶活性即低下或缺乏，是机体常染色体上隐性基因所致，这一类型很少见。(2)继发性乳糖酶缺乏是指由于各种原因致使小肠上皮损伤而导致的暂时性乳糖酶活性低下，如感染性腹泻、免疫球蛋白缺乏症、乳糜泻、局限性回肠炎、营养不良等疾病，可在机体疾病康复后恢复正常。(3)原发性乳糖酶缺乏(又称成人型乳糖酶缺乏)是最常见的一种，不是由疾病的影响所致，主要是由于乳糖酶活性随年龄逐渐降低而引起，发生时间因种族和地区不同而不同，在婴儿断乳后就开始发生，有的20岁左右时开始出现。我国人群多在7～8岁时发生。一般认为乳糖酶缺乏是与世代形成的饮食习惯不同所造成的遗传基因突变有关。乳糖酶缺乏发生率随不同国家、不同种族人群的变化而变化。欧洲人群30％以上乳糖酶缺乏，亚洲人群乳糖酶缺乏占75％～100％，美国白人12％、黑人70％，非洲90％～100％；日本100％，中国3～13岁儿童乳糖酶缺乏发生率为87％。
牛乳中的乳糖进入小肠后，由于乳糖酶的缺乏，乳糖不能被分解成葡萄糖和半乳糖被吸收，称为乳糖消化不良和乳糖吸收不良。当乳糖进入结肠后，被细菌发酵生成短链有机酸如醋酸、丙酸、丁酸等和气体如甲烷、H2、CO2等，乳糖发酵过程可引起肠鸣、腹痛、直肠气体和渗透性腹泻，存在这些症状时称为乳糖不耐受症，严重的乳糖消化不良或吸收不良多在摄入一定量乳糖后30分钟至数小时内发生。乳糖不耐受对婴幼儿影响较大，半乳糖是大脑正常发育的重要物质，由于缺乏乳糖酶不能将乳糖分解为葡萄糖和半乳糖被吸收，因此，儿童的生长迟缓，对大脑发育也有一定的影响，并会同时伴有呕吐等现象，成人有时伴有恶心反应。乳糖酶缺乏者中有20％左右的人存在乳糖不耐受症状，而且乳糖不耐症状个体差异很大。不耐受症状的多少和严重程度与小肠内乳糖酶活性、摄入的乳糖量以及是否同时摄入其它类食品有关，因此生产低乳糖奶具有十分重要的意义。
发明内容本发明的目的在于提供一种可以将鲜牛乳、消毒乳或还原乳转化成低乳糖液体奶和低乳糖奶粉的中性液体乳糖酶的生产方法。
本发明的目的是这样实现的1、脆壁克鲁维酵母细胞的培养按照重量比为乳清粉0.5-25％、酵母膏0.1-20％、蛋白胨0.1-20％、硫酸铵0.1-10％、磷酸氢二钾0.01-2％和余量的水的比例配置培养基，pH7.2，105℃灭菌处理15分钟，按照接种量为1％-25％的比例接种脆壁克鲁维酵母细胞，通入无菌空气搅拌培养10-72小时；2、脆壁克鲁维酵母菌悬液的制备将培养成熟的脆壁克鲁维酵母细胞经10000r/min高速离心，得到新鲜活性菌体细胞，将新鲜活性菌体细胞用无菌水洗涤1-2次，然后用无菌水配制成细胞菌悬液，细胞的重量比浓度为1.0％-40.0％；3、酶预破壁处理取上述菌悬液500mL，加入β-葡聚糖酶、纤维素酶和蛋白酶，纤维素酶、蛋白酶用量分别为0.1-150.0u/g湿菌体，β-葡聚糖酶用量0.1-150.0u/g湿菌体，pH5.5-7.5，20℃-65℃保温1-6小时；4、冻融破壁将经酶处理后的细胞悬液取出，置于-20℃--50℃温度下冷冻，再将冷冻的细胞置于20℃-75℃融化，得到冻融细胞悬液；5、高压匀浆机、终极破壁将冻融的细胞悬液置于液体剪切破碎装置进行二次破壁，进口处的温度维持在18-22℃，出口处的温度小于50℃，压力维持在30MPa-120MPa，得到无细胞结构的活性乳糖酶溶液；6、然后进行3500-15000r/min离心或过滤处理，获得无菌体细胞碎片的活性乳糖酶溶液，再进行低温减压浓缩至10-70％浓度，加入5-30％氯化钠和5-30％的蔗糖，即得到中性液体乳糖酶。
用本发明的方法所得到的中性液体乳糖酶处理鲜牛乳、消毒乳或还原乳，在pH自然，温度4-55℃，反应时间为0.5-10小时，即可生产低乳糖液体奶和低乳糖奶粉。在此条件下，如果按100mL液体奶加入0.05-20mL液体乳糖酶的比例，乳糖含量可降低40％-100％。
(四)
具体实施例方式
具体实施例方式
一1、脆壁克鲁维酵母细胞的培养方法按照重量比为乳清粉0.5-25％、酵母膏0.1-20％、蛋白胨0.1-20％、硫酸铵0.1-10％、磷酸氢二钾0.01-2％和余量的水的比例配置培养基，pH 7.2，105℃灭菌处理15分钟，按照接种量为1％-25％的比例接种脆壁克鲁维酵母细胞，通入无菌空气搅拌培养10-72小时。
2、脆壁克鲁维酵母菌悬液的制备方法将培养成熟的脆壁克鲁维酵母细胞经10000r/min高速离心，获得新鲜活性菌体细胞，将菌体细胞用无菌水洗涤1-2次，然后用无菌水配制成细胞菌悬液，细胞浓度为1.0％-40.0％。
3、酶预破壁处理方法取上述菌悬液500mL，加入β-葡聚糖酶、纤维素酶和蛋白酶，纤维素酶、蛋白酶用量分别为0.1-150.0u/g湿菌体，β-葡聚糖酶用量0.1-150.0u/g湿菌体，pH5.5-7.5，20℃-65℃保温1-6小时。
4、冻融破壁方法将经酶处理后的细胞悬液取出，置于-20℃--50℃温度下快速冷冻，使其彻底冻结，再将冷冻的细胞置于20℃-75℃融化，得到冻融细胞悬液。
5、高压匀浆机终极破壁将冻融的细胞悬液置于液体剪切破碎装置中进行二次破壁，进口处的温度维持在20℃，出口处的温度不要高于50℃，压力维持在30MPa-120MPa，得到无细胞结构的活性乳糖酶溶液。所述的液体剪切破碎装置可以是高压匀浆机或超声波细胞破碎机。
6、然后进行3500-15000r/min离心或过滤处理，获得无菌体细胞碎片的活性乳糖酶溶液，再进行低温减压浓缩至10-70％浓度，加入5-30％氯化钠和5-30％的蔗糖，即得到中性液体乳糖酶。
按照100mL液体奶加入0.05-20mL液体乳糖酶的比例，将中性液体乳糖酶添加到鲜牛乳、消毒乳或还原乳中，在pH自然，温度4-55℃的条件下，反应0.5-8小时，即可得到低乳糖液体奶和低乳糖奶粉。
具体实施例方式
二1、培养基配制和酵母细胞培养乳清粉6.0％、酵母膏1.0％、蛋白胨1.5％、硫酸铵1.0％、磷酸氢二钾0.1％和余量的水，pH7.2，105℃灭菌15分钟，按照接种量为10％的比例接种脆壁克鲁维酵母细胞，通入无菌空气搅拌培养36小时。
2、将培养成熟的脆壁克鲁维酵母细胞经10000r/min高速离心，获得新鲜活性菌体细胞，然后，将菌体细胞用无菌水洗涤1次，然后用无菌水配制成细胞菌悬液，细胞浓度为5.0％，再加入β-葡聚糖酶、纤维素酶和蛋白酶，纤维素酶、蛋白酶用量分别为10u/g湿菌体，β-葡聚糖酶用量50u/g湿菌体，pH 6.8，45℃保温2小时。
3、取出后再置于-20℃温度下快速冷冻，使其彻底冻结，再将冷冻的细胞置于40℃温度下融化，得到冻融细胞悬液。
4、再将冻融细胞悬液置于液体剪切破碎装置高压匀浆机或超声波细胞破碎机中进行二次破壁，温度不要高于50℃，压力维持在80MPa，得到无细胞结构的活性乳糖酶溶液。
5、然后进行3500-15000r/min离心或过滤处理，获得无菌体细胞碎片的活性乳糖酶溶液，再进行低温减压浓缩至65％浓度，加入8％氯化钠和10％的蔗糖，即得到液体活性乳糖酶。
6、用中性液体乳糖酶处理鲜牛乳、消毒乳或还原乳，pH自然，温度4-55℃，反应时间为0.5-5小时，即可生产低乳糖液体奶和低乳糖奶粉。
权利要求
1.一种中性液体乳糖酶生产方法，其特征是(1)脆壁克鲁维酵母细胞(Kluyveromyces fragilis)的培养按照重量比为乳清粉0.5-25％、酵母膏0.1-20％、蛋白胨0.1-20％、硫酸铵0.1-10％、磷酸氢二钾0.01-2％和余量的水的比例配置培养基，pH7.2，105℃灭菌处理15分钟，按照接种量为1％-25％的比例接种脆壁克鲁维酵母细胞，通入无菌空气搅拌培养10-72小时；(2)脆壁克鲁维酵母菌悬液的制备将培养成熟的脆壁克鲁维酵母细胞经10000r/min高速离心，得到新鲜活性菌体细胞，将新鲜活性菌体细胞用无菌水洗涤1-2次，然后用无菌水配制成细胞菌悬液，细胞的重量比浓度为1.0％-40.0％；(3)酶预破壁处理取上述菌悬液500mL，加入β-葡聚糖酶、纤维素酶和蛋白酶，纤维素酶、蛋白酶用量分别为0.1-150.0u/g湿菌体，β-葡聚糖酶用量0.1-150.0u/g湿菌体，pH5.5-7.5，20℃-65℃保温1-6小时；(4)冻融破壁将经酶处理后的细胞悬液取出，置于-20℃--50℃温度下冷冻，再将冷冻的细胞置于20℃-75℃融化，得到冻融细胞悬液；(5)、高压匀浆、终极破壁将冻融的细胞悬液置于液体剪切破碎装置进行二次破壁，进口处的温度维持在18-22℃，出口处的温度小于50℃，压力维持在30MPa-120MPa，得到无细胞结构的活性乳糖酶溶液；(6)然后进行3500-15000r/min离心或过滤处理，获得无菌体细胞碎片的活性乳糖酶溶液，再进行低温减压浓缩至10-70％浓度，加入5-30％氯化钠和5-30％的蔗糖，即得到中性液体乳糖酶。
2.根据权利要求1所述的中性液体乳糖酶生产方法，其特征是(1)培养基配制和酵母细胞培养按照重量比为乳清粉6.0％、酵母膏1.0％、蛋白胨1.5％、硫酸铵1.0％、磷酸氢二钾0.1％和余量的水的比例配置培养基，pH 7.2，105℃灭菌15分钟，按照接种量为1％-25％的比例接种脆壁克鲁维酵母细胞，通入无菌空气搅拌培养36小时；(2)、将培养成熟的脆壁克鲁维酵母细胞经10000r/min高速离心，然后，将菌体细胞用无菌水洗涤1次，然后用无菌水配制成细胞菌悬液，细胞浓度为5.0％，再加入β-葡聚糖酶、纤维素酶和蛋白酶，纤维素酶、蛋白酶用量分别为10u/g湿菌体，β-葡聚糖酶用量50u/g湿菌体，pH6.8，45℃保温2小时；(3)取出后再置于-20℃温度下快速冷冻，再将冷冻的细胞置于40℃温度下融化，得到冻融细胞悬液；(4)再将冻融细胞悬液置于液体剪切破碎装置中进行二次破壁，温度不要高于50℃，压力维持在80MPa，得到无细胞结构的活性乳糖酶溶液；(5)然后进行3500-15000r/min离心或过滤处理，获得无菌体细胞碎片的活性乳糖酶溶液，再进行低温减压浓缩至65％浓度，加入8％氯化钠和10％的蔗糖，即得到液体活性乳糖酶。
3.根据权利要求1或2所述的中性液体乳糖酶生产方法，其特征是所述的液体剪切破碎装置可以是高压匀浆机或超声波细胞破碎机。
全文摘要
本发明涉及的是一种中性液体乳糖酶生产方法。通过深层液体发酵，大量培养成熟的脆壁克鲁维酵母细胞，再经高速离心，将菌体细胞用无菌水洗涤，然后用无菌水配制成细胞菌悬液，再加入β－葡聚糖酶、纤维素酶和蛋白酶，保温。取出后再下快速冷冻，使其彻底冻结，再将冷冻的细胞融化，得到冻融细胞悬液。再将冻融细胞悬液置于液体剪切破碎装置高压匀浆机或超声波细胞破碎机中进行二次破壁，得到无细胞结构的活性乳糖酶溶液。然后，进行离心或过滤处理，获得无菌体细胞碎片的活性乳糖酶溶液，加入氯化钠和的蔗糖，即得到液体活性乳糖酶。用本发明的方法所得到的中性液体乳糖酶处理鲜牛乳、消毒乳或还原乳，即可生产低乳糖液体奶和低乳糖奶粉。
文档编号C12N1/16GK1916170SQ20061001051
公开日2007年2月21日 申请日期2006年9月8日 优先权日2006年9月8日
发明者肖雯娟 申请人:肖雯娟