一种酸性外切多聚半乳糖醛酸酶及其基因和应用
【专利摘要】本发明涉及基因工程领域，具体涉及一种酸性外切多聚半乳糖醛酸酶及其制备方法和应用。所述酸性外切多聚半乳糖醛酸酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示。该酶最适pH为3.5、热稳定性好(最适温度70℃，在60、70℃中处理1h都能保持80％以上的酶活)，容易发酵生产。所有这些优点都意味着新发明的外切多聚半乳糖醛酸酶在饲料、食品行业中，将会比以前报道的外切多聚半乳糖醛酸酶更有应用价值。
【专利说明】
-种酸性外切多聚半乳糖酵酸酶及其基因和应用
技术领域
[0001] 本发明设及基因工程领域，具体设及一种酸性外切多聚半乳糖醒酸酶及其基因和 应用。
【背景技术】
[0002] 果胶是一类带负电的高分子多糖，广泛存在于高等植物，特别是水果和蔬菜的组 织中，是果蔬植物细胞中胶层的主要成分。果胶由不同醋化度的D-半乳糖醒酸Wa-1，4糖巧 键连接而成的多糖链，常带有鼠李糖、阿拉伯糖、半乳糖、木糖等组成的侧链，分子量介于 2540~36040之间。果胶类物质分为4类：原果胶（91'〇1:〇96(31:;[]1)、果胶（96(31:;[]1)、果胶酸 (pectic acid,pectate)和果胶醋酸(pectinic acid,pectinate)。果胶酶是分解果胶质的 多种酶的总称，它能将高分子果胶多糖降解为小分子或单体还原糖形式，能够有效降解果 胶，因此果胶酶具有重要的工业应用化ucie Parenicova et al.,FEBS Letters(2000) 467:333-336)。按作用机制果胶酶可W分为原果胶酶、解聚酶和果胶醋酶。解聚酶又可分为 果胶水解酶和果胶裂解酶。其中水解酶通过水解作用切割D-半乳糖酸的a-l，4糖巧键生成 寡聚半乳糖醒酸，而裂解酶则通过反式消去作用切断0-1，4糖巧键生成0-4，5不饱和半乳糖 醒酸，果胶醋酶水解果胶中的甲醋，生成果胶酸(Nilay Demir et al. Journal of Food 化gineering(2001)47:275-280)。
[0003] 多聚半乳糖醒酸链可通过裂解酶和水解酶两种方式进行解聚。多聚半乳糖醒酸酶 (PolygalacUironase，End〇-/EC 3.2.1.15，Ex〇-/EC 3.2.1.67)作用于多聚半乳糖醒酸链 的a-l，4-d-糖巧键，发生水解反应，产生单个或寡聚的半乳糖醒酸。多聚半乳糖醒酸酶的研 究和应用最为广泛（Sharma et al.,Reviews in Environmental Science and Bio/ Technology 2013,12:45-60。
[0004] 多聚半乳糖醒酸酶是果胶酶系中研究最为广泛的酶种，属于糖巧水解酶第28家 族，特异催化水解多聚半乳糖醒酸链中0-1,4-糖巧键产生单个或寡聚的半乳糖醒酸，而不 能水解甲醋化或乙酷醋化的多聚半乳糖醒酸。与其他糖巧水解酶一样，多聚半乳糖醒酸酶 有内切酶(endo-)和外切酶(exo-)之分，内切多聚半乳糖醒酸酶化C 3.2.1.15)的水解产物 是寡聚半乳糖醒酸，而细菌和真菌来源的外切多聚半乳糖醒酸酶化C 3.2.1.67)的水解终 产物有所不同：细菌外切多聚半乳糖醒酸酶水解终产物为半乳糖醒酸;真菌外切多聚半乳 糖醒酸酶的水解终产物为二聚半乳糖醒酸。
[0005] 不同来源的多聚半乳糖醒酸酶，酶学性质差异显著。大多数外切多聚半乳糖醒酸 酶的最适pH值属于碱性范围，外切多聚半乳糖醒酸酶的最适溫度保持在50-60°C的范围。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的是提供了一种酸性、耐热外切多聚半乳糖醒酸酶。
[0007] 本发明的再一目的是提供上述外切多聚半乳糖醒酸酶的编码基因。
[000引本发明的再一目的是提供包含上述外切多聚半乳糖醒酸酶基因的重组载体。
[0009] 本发明的再一目的是提供包含上述外切多聚半乳糖醒酸酶基因的重组菌株。
[0010] 本发明的再一目的是提供一种制备外切多聚半乳糖醒酸酶的方法。
[0011] 本发明的再一目的是提供上述外切多聚半乳糖醒酸酶的应用。
[0012] 本发明首先所要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种性质优良的、 适合于在饲料、食品等行业中应用的新的外切多聚半乳糖醒酸酶，其氨基酸序列如SEQ ID N0.1： 1 M邸SNTLTQA rSLL化GLilV E.GSGI脚郷D MC肥册阳R PMPPS肥技化 51 TCHfE舰G腑TOD涨肌LQA L哦CN服嫌V V碰揽KTYll的化觀邱成 101 NVDIEILGTI QFTNDTMYWQ AMF1QIYQN ATTFFQLGGE： DVNVYGGGTI 151 DGNGQVWYDL YAQNPLILRP ILMGII化KG GT1G化KL賊 SPQW孤V'M
[0013] 2的，SSD化FDGLD ISGFSTSKNT AKNTDGWDLY RSNNIVIQNS VINNGDDCVS 茲 1 FKP肥TE化V Q化肥服細G ISVGSLGQYL 組VDIVKNVL VYNISMFNAS 3的，DGARIKVWPG VSSAMS扣LQ GGGGLGSVSN ITYDTMYIEN VDYAIEVTQC 3邑 I YGQS化化CN EYPSNMT1SD I 耶NN抑GTT 沈KYEPLVGS 1VCSSPNVCS 401 DIYATNIDVE SPEGTNEFAC TNVDKS化AI DCV*
[0014] 该酶全长433个氨基酸，N端22个氨基酸为信号肤序列"MKFSNTLTQA I化LSLGLAV EG"。
[0015] 因此，成熟的外切多聚半乳糖醒酸酶的理论分子量为45. OkDa，其氨基酸序列如 沈Q ID NO.2:
[0016] 1涨I附娜孤A畑P孤P郎PM PP細桃VKTC HVE.畑G服VD DSK饥LQALH 5;1 QC'娜祕防巧瓶赚巧n知化腳TFL脚V t)化化GUQF TNDT脚fQAN 101 AF锁lYQ臟T IFF化G独DV NY魄说口 DG NGQVWYDLYA 卿PUL 反机L 1脚齡口化瓶GT说既KL照欲QtmFViWSS ;WL抑化0廣你 ST涨脚AK 201 肌DGWDLY勝 NNIVIQ殿…NM^DCVSFK P殿把工LVQN L取腑甜GIS:
[0017] 251 y啟L彌孔斌化I:VK膊L?Y mSM願A涨G ARI软WP饼S SAM站化Q雜 301 G孤照的了 YDTM拍ENVITYAIEV巧:(；孤 QSNLTIXNEY KSNMITS的H 351做师'恥竹SK邸EPLV殺:IV C縱PNVC涨IYAT姐DVE辨 E灼'NEF庄C械 401 VDKSTi.AiDC
[001引该外切多聚半乳糖醒酸酶的最适pH为3.5，在阳1.0-pH7.0范围内稳定；最适溫度 70°C，在85°C时依然具有30%的酶活力，在60处理化酶活能保持80% W上，70°C中处理比酶 活能保持60% W上，在80°C下处理2min，能够保持60% W上的酶活力，具有良好的热稳定 性。
[0019]本发明还提供了编码上述外切多聚半乳糖醒酸酶的基因。该酶的全基因序列如 沈Q ID NO.3所示： 1 ATGAAGTTCT CCMTACCGT TACCGAGGGA MCAGCGTGT TCTCTGTGGG CCTGSGCGTG 61 GAAGGGTCAG GGATCAATAT TCAGAGAGAT GATGCGTGCC ACCCACACCG TCCGTTCAGG 121 CCTATGCCTC CGACTCACCC CCGAGTCAAA ACATGCCATG TTGAGAACCA CGGCMTGGC 181 GTTGATGACT CGAAGAATAT CCTGCAGGCT TTGCACCAAT GCAACAACGG TGGCMGGTT 241 GTCTTCGACG AGG(]TAAGAC GTACACCATT GGAACCGCAT TGGACATGAC TTTCTTGAAG 301 AACGTCGACA TTGAAATCCT CGGCACGATC CAGTTCACCA ACGACACAAA CTACTGGCAA 361 GCCAATGCCT TCMACAGAT CTACCAGAAC GCGACGACCT TCTTCCA成T CGGAGGCGAG 421 GACGTCAACG TCTACGGAGG CGGCACCATC GACGGCAACG GTCAGGTCTG GTACGACCTG 481 TATGCGCAGA ATCCCCTGAT TCTTCGTCCC ATCTTGATGG GA化CATTGG TCTCMGGGA 日41 GGCACCATTG GACCTCTGAA GCTCCGCTAT TCGCCTCAGT GG則CCACTT CGTTGCCMC , 1 目01 TCGTCGGATG TGCTCTTCGA CGGCCTCGAT ATCTCGGGTT TCAGCACGAG CAAGMCACC
[0020] 661 GCTAAGAACA CTGATGGATG GGATTTGTAT CGCTCCAACA ACATTGTCAT CCAGMCTCT 721 GTG/VTCAATA ACGGTGATGA TTGCGTCTCC TTCMGCCCA ACTCCACCGA GATCCTCGTC 781 CAGAACCTCC ACTGCAATGG CTCGCACGGC ATCTCTGTCG GTTCTCTTGG 洗&[1化说1节 841 GGAGAAGTTG ACATCGTGAA GAACGTTCTC GTCTACAATA TCTCCATGTT CAATGCTTCG 901 GATGGTGCCC GTATTAAGGT GTGGCCTGGT GTGTCCTCGG CTATGTCCAT CGACTTGCAG 961 GGTGGCGGTG GTCTGGGCAG CGTGTCCAAC ATCACCTACG ACACCATGTA CATCGAGAAT 1021 GTCGACTATG CCATCGAGGT GACTCAGTGC TACGGACAGA GCAACCTGAC TCTTTGCAAC 1081 GAGTACCCTA GCMCATGAC CATCTCCGAT ATCCACTTCA ATAACTTCCA CGGCACGACC 1141 TCTAAGAAGT ACGAGCCTCT TGTTGGAAGC ATCGTCTGCT CGAGCCCTAA TGTCTGCTCC 1201 GATATCTACG CCACAAACAT CGACGTCGAG AGCCCCGAGG GCACAAATGA ATTCGCTTGC 1261 ACAAATGTCG ATAAGAGCAC TTTGGCCATC GACTGCGTAT AG
[0021] 其中，信号版的碱基序列为：
[0022] "ATGAAGTTCT CCAATACCCT TACCCAGGCA ATCAGCCTGT TGTCTCTGGG CCTCGCCGTG GAAGGG，，
[0023] 因此，成熟基因的编码序列为
[0024] 沈Q ID NO .4所示： 1 TCAGGGATCA ATATTCAGAG AGATGATGCG TGCCACCCAC ACCGTCCGTT CAGGCCTATG 61 CCTCCGAGTC ACCCCCGAGT CAAAACATGC CATGTTGAGA ACGACGGCAA TGGCGTTGAT 121 GACTCGAAGA ATATCCTGCA GGCTTTGCAC CAATGCAACA ACGGTGGCAA GGTTGTCTTC 181 GACGAGGGTA AGACGTACAC CATTGGAACC GCATTGGACA TGACTTT灯T GAAGMCGTC 241 GACATTGAAA TCCTCGGCAC GATCCAGTTC ACCAACGACA CAAACTACTG GCAAGCCAAT 301 GCCTTCAAAC AGATCTACCA GAACGCGACG ACCTTCTTCC AGCTCGGAGG CGAGGACGTC 3目 1 AACGTCTACG GAGGCGGCAC CATCGACGGC AACGGTCAGG TCTGGTACGA €(：了6化'防(击 421 CAGAATCCCC TGATTCTTCG TCCCATCTTG ATGGGAATCA TTGGTCTCAA GGGAGGCACC 481 ATTGGACCTC TGAAGCTCCG CTATTCGCCT CAGTGGTACC ACTTCGTTGC CAACTCGTCG 日41 GATGTGCTCT TCGACGGCCT CGATATCTCG GGTTTCAGCA CGAGCAAGM aCCGCTAAG
[0025] 601 AACACTGATG GATGGGATTT GTATCGCTCC AACAACATTG TCATCCAGAA CTCTGTGATC 661 AATAACGGTG ATGATTGCGT CTCCTTCAAG CCCMCTCCA CCGAGATCCT CGTCCAGAAC 721 CTCCACTGCA ATGGCTCGCA CGGCATCTCT GTCGGTTCTC TTGGCCAGTA CCTGGGAGAA 781 GTTGACATCG TGAAGAACGT TCTCGTCTAC AATATCTCCA TGTTCAATGC TTCGGATGGT 841 GCCCGTATTA AGGTGTGGCC TGGTGTGTCC TCGGCTATGT CCM'CGACTT GCAGGGTGGC 901 GGTGGTCTGG GCAGCGTGTC CAACATCACC TACGACACCA TGTACATCGA GAATGTCGAC 961 TATGCCATCG AGGTGACTCA GTGCTACGGA CAGAGCAACC TGACTCTTTG CAACGAGTAC 1021 CCTAGCAACA TGACCATCTC CGATATCCAC TTGAATAACT TCGACGGCAC GACCTCTAAG 1081 AAGTACGAGC CTCTTGTTGG AAGCATCGTC TGCTCGAGCC CTAATGTCTG CTCCGATATC 1141 TACGCCACAA ACATCGACGT CGAGAGCCCC GAGGGCACAA ATGAATTCGC TTGCACAAAT 12:01 GTCGATMGA GCACTTIGGC CATCGACiGC GTATAG
[0026] 该酶属于糖基水解酶第28家族，通过比对该酶为一种新的外切多聚半乳糖酸酸 酶。
[0027] 本发明还提供了包含上述外切多聚半乳糖酸酸酶基因的重组载体，优选为毕赤酵 母表达载体。将本发明的外切多聚半乳糖酸酸酶基因插入到表达载体合适的限制性酶切位 点之间，使其核骨酸序列可操作的与表达调控序列相连接。作为本发明的一个最优选的实 施方案，优选为将外切多聚半乳糖酸酸酶基因 cDNA插入到质粒PPIC9上的EcoR巧日Notl限制 性酶切位点之间，使该核骨酸序列位于A0X1启动子的下游并受其调控，得到重组酵母表达 质粒。
[0028] 本发明还提供了包含上述外切多聚半乳糖酸酸酶基因的重组菌株，优选为重组毕 赤酵母菌株。
[0029] 本发明还提供了一种制备外切多聚半乳糖酸酸酶酶的方法，包括W下步骤：
[0030] 1)用上述重组载体转化宿主细胞，得重组菌株；
[0031] 2)培养重组菌株，诱导重组外切多聚半乳糖酸酸酶的表达;^及
[0032] 3)回收并纯化所表达的外切多聚半乳糖酸酸酶。
[0033] 其中，优选所述宿主细胞为毕赤酵母（Pichia pastoris)细胞、峰酒酵母 (Saccharomycescerevisiae)细胞或多型汉逊酵母化ansenulapolymorpha)细胞，优选将 重组酵母表达质粒转化毕赤酵母细胞(Pichic pastoris)GS115,得到重组菌株D
[0034] 本发明还提供了上述外切多聚半乳糖酸酸酶的应用。运用基因工程手段来产业化 生产外切多聚半乳糖酸酸酶。本发明从蓝状菌中得到了一个新的外切多聚半乳糖酸酸酶基 因，其编码的外切多聚半乳糖酸酸酶具有W下几个优点：酸性(最适地为3.5)、热稳定性好 (最适温度70它，在60、7(TC中处理Ih都能保持80%?上的酶活），容易发酵生产。所有这些 优点都意味着新发明的外切多聚半乳糖醒酸酶在饲料、食品行业中，将会比w前报道的外 切多聚半乳糖醒酸酶更有应用价值。本发明提供了一个新的外切多聚半乳糖醒酸酶基因， 可作应用于饲料、食品等工业。根据本发明的技术方案就可W实现利用基因工程手段生产 性质优良适合工业应用的外切多聚半乳糖醒酸酶。
【附图说明】
[0035] 图1外切多聚半乳糖醒酸酶在毕赤酵母中表达的SDS-PAGE分析，M.蛋白分子量标 准，1纯化的重组酶，2脱糖基后的重组酶。
[0036] 图2本发明重组外切多聚半乳糖醒酸酶的最适pH值。
[0037] 图3本发明外切多聚半乳糖醒酸酶的pH稳定性。
[0038] 图4本发明外切多聚半乳糖醒酸酶最适反应溫度。
[0039] 图5本发明外切多聚半乳糖醒酸酶热稳定性。
【具体实施方式】
[0040] 试验材料和试剂
[0041 ] 1、菌株及载体:表达宿主Pichia pastoris GS115,表达质粒载体PPIC9为本公司 保存。
[0042] 2、酶类及其它生化试剂：内切酶购自Fermen化S公司，连接酶购自Promaga公司，多 聚半乳糖醒酸购自Sigma公司。其它都为国产分析纯试剂(均可从普通生化试剂公司购买得 到)。
[00创 3、培养基：
[0044] (1)LB培养基:0.5%酵母提取物，1%蛋白腺，l%NaCl，pH 7.0
[0045] (2 )Yro培养基:1 %酵母提取物，2 %蛋白腺，2 %葡萄糖
[0046] (3)MD 固体培养基:2% 葡萄糖，1.5% 琼脂糖，1.34%YNB，0.00004%Biotin
[0047] (4)MM 固体培养基：1.5%琼脂糖，1.34%YNB，0.00004%Biotin，0.5%甲醇
[004引 （5)BMGY培养基：1%酵母提取物，2%蛋白腺，1%甘油（V/V)，1.34%YNB， 0.00004%Biotin
[0049] (6)BMMY 培养基：1%酵母提取物，2%蛋白腺，l.：M%YNB，0.00004%Biotin，0.5% 甲醇(V/V)
[0050] 4、本实施例中未做详细具体说明的分子生物学实验方法，均参照《分子克隆实验 指南》(第=版)J.萨姆布鲁克一书中所列的具体方法进行，或者按照试剂盒和产品说明书 进行。
[0051] 实施例1外切多聚半乳糖醒酸酶编码基因的获得
[0052] 设计克隆引 物 F:at 邑 aa 邑 ttctccaatacccttaccca 邑邑 C 和 R: c1:a1:acgcagtcgatggccaaagtgc tc。提取蓝状菌KWB1总RNA，利用01 i go (肌）2日和反转录酶得到 cDNA的一条链，然后设计扩增开放阅读框的的引物巧日R，扩增该单链cDNA，获得外切多聚半 乳糖醒酸酶的cDNA序列，扩增得到产物回收后送测序。W蓝状菌KWB1总DNA为模板进行PCR 扩增。PCR 反应参数为：951：5111111;941：3〇36。，621：3〇36。，721：6〇36。，30个循环，72°(：1〇111111。 得到一约1.3k bp片段，测序正确后获得全长编码基因。cDNA长1302bp，编码433个氨基酸和 一个终止密码子，N端22个氨基酸为其信号肤序列。
[0053] 实施例2外切多聚半乳糖醒酸酶工程菌株的构建
[0054] (1)表达载体的构建及在酵母的表达
[0055] W测序正确的外切多聚半乳糖醒酸酶的cDNA为模板，设计合成了带有EcoR I和 Not I限制性酶切位点的引物cdna-sF: actgaattctcagggatcaatattcagagagatgatgcg和 cdnaR:atagcggccgcctatacgcagtcgatggccaaagtgctc，对外切多聚半乳糖醒酸酶的成熟蛋 白的编码区进行扩增。并利用EcoR I和Not I酶切PCR产物，连接进入表达载体PPIC9,外切 多聚半乳糖醒酸酶成熟蛋白的序列插入到上述表达载体的信号肤序列的下游，与信号肤形 成正确的阅读框架，构建成酵母表达载体，转化大肠杆菌感受态细胞JM109。阳性转化子进 行DNA测序，测序表明序列正确的转化子用于大量制备重组质粒。用限制性内切酶Bgl II进 行线性化表达质粒载体DNA，电击转化酵母GS115感受态细胞，30°C培养2-3天，挑取在MD平 板上生长的转化子进行进一步的表达实验，具体操作请参考毕赤酵母表达操作手册。
[0056] W同样的方式构建含外切多聚半乳糖醒酸酶信号肤序列的cDNA的表达载体，并转 化。
[0057] (2)高外切多聚半乳糖醒酸酶活性转化子的筛选
[005引用灭过菌的牙签从长有转化子的MD板上挑取单菌落，按照编号先点到MD平板上， 将MD平板置于3(TC培养箱中培养1~2天，至菌落长出。按编号从MD平板上挑取转化子接种 于装有3mL BMGY培养基的离屯、管中，30°C、220巧m摇床培养4她;将摇床培养4她的菌液3， 000 X g离屯、15min，去上清，离屯、管中再加入ImL含有0.5 %甲醇的BMMY培养基，在30 °C、 220巧m诱导培养;诱导培养4她后，3，000 X g离屯、5min，取上清用于酶活性检测，从中筛选出 高外切多聚半乳糖醒酸酶活性的转化子，具体操作请参考毕赤酵母表达操作手册。
[0059] 实施例3重组外切多聚半乳糖醒酸酶的制备
[0060] (1)外切多聚半乳糖醒酸酶基因在毕赤酵母中摇瓶水平的大量表达
[0061 ]筛选出酶活较高的转化子，接种于300mL BMGY液体培养基的1LS角瓶中，30°C， 220rpm摇床振荡培养4她；5，OOOrpm离屯、5min，轻柔弃上清，再向菌体加入lOOmL含有0.5 % 甲醇的BMMY液体培养基，30°C，220rpm诱导培养72h。诱导培养期间，间隔24h补加一次甲醇 溶液W补偿甲醇的损失，使甲醇浓度保持在0.5 %左右；（3) 12，000 X g离屯、1 Omin，收集上清 发酵液，检测酶活性并进行SDS-PAGE蛋白电泳分析(图1)。
[0062] (2)重组外切多聚半乳糖醒酸酶的纯化
[0063] 收集摇瓶表达的重组外切多聚半乳糖醒酸酶上清液，通过膜包进行浓缩，同时用 低盐缓冲液置换其中的培养基，然后用超滤管进一步的浓缩。浓缩能稀释到一定倍数的重 组外切多聚半乳糖醒酸酶，通过离子交换层析进行纯化。具体地，取重组外切多聚半乳糖醒 酸酶浓缩液2.0血经预先用20mM化is-HCl(pH7.5)平衡过的Hi化apQSepharose)(L阴离 子柱，然后用0-lmol/L的化C1进行线性梯度洗脱，对分步收集的洗脱液检测酶活性和进行 蛋白浓度的测定。
[0064] 实施例4重组外切多聚半乳糖醒酸酶部分性质分析
[0065] 采用DNS法对本发明的外切多聚半乳糖醒酸酶进行活性分析。具体方法如下:在抑 3.5，70°C条件下，ImL的反应体系包括10化L适当的稀释酶液，900化底物，反应lOrnin，加入 1.5mL DNS终止反应，沸水煮5min。冷却后540nm测定0D值。外切多聚半乳糖醒酸酶活性单位 定义:在一定条件下，每分钟分解多聚半乳糖醒酸生成Iwiiol还原糖所需的酶量为1个活性 单位化)。
[0066] (1)外切多聚半乳糖醒酸酶的最适pH及pH稳定性
[0067] 经纯化的实施例3表达的外切多聚半乳糖醒酸酶在不同的抑下进行酶促反应W测 定其最适pH。所用缓冲液为pH 1.0~3.0甘氨酸-盐酸缓冲液，pH2.2~8.0的巧樣酸一憐酸 氨二钢系列缓冲液，pH 8.0~g.OTris-肥缓冲液，PH9.0~12甘氨酸-NaOH系列缓冲液。纯化 的外切多聚半乳糖醒酸酶在不同pH的缓冲体系。80°C下测定的pH适性结果（图2)表明：。该 外切多聚半乳糖醒酸酶的最适抑为3.5。
[0068] 将酶液在不同pH值的缓冲液中于37 °C下处理60min，再测定酶活性W研究酶的pH 稳定性。结果表明（图3)，分析结果表明该酶在pH2.0-PH8.0之间稳定，具有优良的pH稳定 性。
[0069] (2)外切多聚半乳糖醒酸酶反应最适溫度及热稳定性
[0070] 纯化的外切多聚半乳糖醒酸酶在pH 3.5条件下，测定不同溫度(40-90°C)下的酶 活性，分析实验结果表明显示，最适溫度70°C，在80°C时依然具有60%的酶活力（图4)，在60 °C下处理60min，酶活基本不损失，在70°C下处理60min，能够保持60% W上的酶活力，在80 °C下处理2min，能够保持60% W上的酶活力，具有良好的热稳定性(图5)。
[0071] W多聚半乳糖醒酸(O.lmol/L巧樣酸-憐酸氨二钢缓冲液)为底物，所述突变体和 野生型在最适条件下的比活力分别为388U/mg，Vmax=1001U/min/mg,Km=3.8mg/rnL。
【主权项】
1. 一种酸性外切多聚半乳糖醛酸酶，其特征在于，所述酸性外切多聚半乳糖醛酸酶的 氨基酸序列如SEQIDN0.1或SEQIDN0.2所示。2. -种酸性外切多聚半乳糖醛酸酶基因，其特征在于，编码权利要求1所述的酸性外切 多聚半乳糖醛酸酶。3. 根据权利要求2所述的酸性外切多聚半乳糖醛酸酶基因，其特征在于，其核苷酸序列 如SEQIDN0·3或SEQIDN0·4所示。4. 包含权利要求2所述的酸性外切多聚半乳糖醛酸酶基因的重组表达载体。5. 包含权利要求2所述的酸性外切多聚半乳糖醛酸酶基因的重组细胞。6. -种酸性外切多聚半乳糖醛酸酶的制备方法，其特征在于，该方法包括如下步骤： 1) 以权利要求4所述的重组表达载体转化宿主细胞； 2) 培养步骤1)获得的宿主细胞； 3) 分离纯化权利要求1所述的酸性外切多聚半乳糖醛酸酶。7. 权利要求1所述外切多聚半乳糖醛酸酶的应用。
【文档编号】C12R1/84GK106047840SQ201610405968
【公开日】2016年10月26日
【申请日】2016年6月10日
【发明人】李学军, 乔伟, 张金伟, 陈 胜, 夏平宇, 赵邦红
【申请人】北京盛拓达生物技术有限公司