专利名称：β-1,4半乳糖基转移酶I在制备肝癌诊断制剂中的应用的制作方法
技术领域：
本发明属于分子生物学和医学领域，具体涉及β -1，4半乳糖基转移酶I在制备肝 癌诊断制剂中的应用。更具体地，涉及将β _1，4半乳糖基转移酶I作为肝癌初筛、诊断和 预后判断以及肝癌手术后预后判断及复发诊断方面的一项指标。
背景技术：
原发性肝癌(简称肝癌)是我国常见的恶性肿瘤之一，其肿瘤发病率在男性为 第三位，仅次于胃癌及食管癌，女性则为第四位。我国每年新增患者11万，人群发病率为 23. 7/10万人。由于肝癌起病隐匿，患者就诊时大多已属中、晚期，再加上合并肝硬化率高 及手术后复发率高等多种因素，治疗效果较差，死亡率高。因此对于肝癌的初筛、诊断和预 后判断以及肝癌手术后预后判断及复发诊断显得尤为重要，目前的检测指标具有一定局限 性，迫切需要找到新的诊断指标。大量研究证实人及动物模型肝癌细胞与正常肝细胞相比 蛋白质及脂质糖基化存在差异。有些糖基化发生改变的糖蛋白已应用于人类肝癌的诊断、 分期和预后评估；同时一些聚糖衍生物已被应用于肝癌的辅助治疗。肝癌细胞中的异常糖基化主要包括糖蛋白和糖脂组分的改变。其中糖蛋白是蛋白 质和寡糖链通过共价结合的复合物，主要有两种连接方式一种为糖链与肽链中丝氨酸或 苏氨酸的羟基氧相连，称为0-糖链；另一种为糖链与肽链中天冬酰胺的酰胺键相连，称为 N-糖链。其中以N-糖链的连接方式较多，与肿瘤的关系也较密切。Van Beek在比较不同恶 性程度的大鼠肝癌细胞、胎肝和新生鼠肝细胞膜上糖蛋白时发现，所有肝癌细胞都有含多 量岩藻糖的糖蛋白出现，且与恶性程度无关，而胎肝和新生鼠肝细胞则无此种改变，证明糖 蛋白糖基化改变是一个恶性肿瘤的现象，而与细胞的正常生长无关。这种肿瘤细胞的糖蛋 白糖链分子增大的现象即所谓的Warren-Glick现象。进一步研究表明，糖链的相对分子质 量增加是由于糖链分支的增加，其中尤以糖链上唾液酸的增加为多见。肝癌中常见的N-聚 糖改变类型可归纳为表1所列的9种情况。糖蛋白的糖基化需要糖基转移酶的参与，因此肝癌细胞糖蛋白中糖链结构的改变 必然与转移酶的活性改变有关。酶活力改变与N-聚糖结构改变的一致性已有大量实验证 明，如在亚硝胺诱发大鼠肝癌时，肝中碱性磷酸酶(ALP)的N-聚糖中平分型N-乙酰葡糖 胺(GlcNAc)和天线数增多分别与GIcNAc转移酶(GlcNAcT)-III和V的活力增高相符合。 H印G2肝癌株中甲胎蛋白(AFP)的N-聚糖有较多的C2C2，6三天线和核心Fuc，其GlcNAcT-V 和α 1，6-岩藻糖转移酶(al，6-FucT)的活力均较高。HuH_7肝癌株的AFP只含极少的平 分型GlcNAc和C2C2，6三天线结构，其GlcNAcT-III和V均较低。研究发现转染GlcNAc T-III的高转移性肿瘤细胞表面的E-钙粘蛋白(E-cadherin)从细胞表面脱落减少，细胞的 侵袭及转移能力降低，结构分析显示E-钙粘蛋白聚糖上的平分型GlcNAc增多，而β 1，6连 接GlcNAc的则减少，提示GIcNAcT-V的活力被抑制。因此，GIcNAcT-V和GlcNAcT-III分 别可看作与促肿瘤转移或抗肿瘤转移相关的糖基转移酶。此外，我们的研究显示β1，4半 乳糖基转移酶I(GalT I)可使人肝癌细胞株N-聚糖上的β 1，6连接GlcNAc表达增多，从而促进肿瘤细胞的生长和侵袭以及在裸鼠体内的病灶形成。
表1.肝癌中糖蛋白N-聚糖改变的类型
权利要求
1.β -1，4半乳糖基转移酶I在制备肝癌诊断制剂中的应用，其中，将肝组织或者血液 样本中β _1，4半乳糖基转移酶I活性作为肝癌诊断指标；所述的β_1，4半乳糖基转移酶 I活性增强是指组织样本的β_1，4半乳糖基转移酶I表达量增加，或者样本中β_1，4半乳 糖苷键的数量的增加。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，将肝组织和血液中β_1，4半乳糖基转移 酶I活性增强作为肝癌初筛的诊断指标。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，将肝组织和血液中β_1，4半乳糖基转移 酶I活性增强作为肝癌术后复发的诊断指标。
4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，其中肝组织样本的β_1，4半乳糖基转移 酶I表达量的检测方法是提取肝组织样本的RNA，然后反转录成cDNA，扩增β-1，4半乳糖 基转移酶I的核苷酸编码序列，所得产物多于对照的即为肝组织样本的β_1，4半乳糖基转 移酶I表达量增加。
5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述肝组织样本中β_1，4半乳糖苷键数 量的检测方法是将肝组织样本制成石蜡切片，脱蜡入水；加入Η202或者甲醇阻断内源性 的过氧化物酶，加入抗生物素蛋白阻断内源性的生物素；唾液酸酶消化，封闭，然后加入生 物素-蓖麻凝集素-I孵育过夜；加入标记过的抗生物素蛋白-生物素孵育，显色；对照组用 羊血清代替生物素-蓖麻凝集素-I，或者在加入生物素-蓖麻凝集素-I的同时添加半乳糖 竞争抑制。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，采用辣根过氧化酶进行标记，二氨基联苯 胺显色。
7.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，血液样本中β_1，4半乳糖苷键数量的检 测方法是提取血液样本中的血清蛋白，western blot转移到PVDF膜，封闭过夜，与标记过 的蓖麻凝集素-I孵育，洗膜，然后检测蓖麻凝集素-I的结合数量，蓖麻凝集素-I的结合数 量的增加即为肝组织样本中β -1，4半乳糖苷键数量的增加。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，采用辣根过氧化酶进行标记，ECL化学发 光系统检测蓖麻凝集素-I的结合数量。
全文摘要
本发明属于分子生物学和医学领域，涉及β-1，4半乳糖基转移酶I在制备肝癌诊断制剂中的应用。本发明将β-1，4半乳糖基转移酶I活性作为肝癌诊断指标；β-1，4半乳糖基转移酶I活性增强是指其表达量增加，或者样本中β-1，4半乳糖苷键的数量的增加。将本发明的β-1，4半乳糖基转移酶I活性指标用于肝癌初筛、诊断和预后判断以及肝癌手术后预后判断及复发诊断，特异灵敏，高效简易，而且本发明的检测方法只需提取患者很少量的肝组织或者血液样本进行体外反应，大大减轻了患者的痛苦及其家属的负担。此外，该指标还可以与甲肽蛋白等其它肝癌诊断标记优势互补，作为肝癌确诊的依据。
文档编号C12Q1/48GK102041295SQ200910197379
公开日2011年5月4日 申请日期2009年10月19日 优先权日2009年10月19日
发明者徐洁杰, 恽小婧, 江建海, 顾建新 申请人:复旦大学