专利名称：一种ɑ-1，3半乳糖基转移酶融合蛋白及制备方法
技术领域：
本发明属于生物领域，涉及一种糖基转移酶，具体涉及一种a -1，3半乳糖基转移酶融合蛋白，其催化a-半乳糖表位的形成。
背景技术：
a -I，3半乳糖基转移酶存在于一些动物如牛，鼠等体内，人类不具备此酶。该酶在特定的底物上形成a -1，3半乳糖基后成为一种能被人体内天然存在的抗体所识别的表位，此表位通常称为a-半乳糖表位；这是人类异体移植产生免疫排斥反应的生物学基础，因此，a -1，3半乳糖基转移酶可用于合成抗免疫排斥反应的药物。 后来研究发现，经过该酶修饰处理后的人体肿瘤细胞等能更有效地被自身免疫系统所识别，进而更有效地被清除，这种修饰的细胞或细胞碎片因此被称为自体疫苗。基于上述原因，提供大量并有活性的a-1，3半乳糖基转移酶具商业意义。到目前为止，a -I，3半乳糖基转移酶在细菌中表达均形成包涵体，或绝大部分形成包涵体，即不可溶的非活性的状态。虽然利用蛋白质的复性及变性方法可以改变蛋白质的不可溶的非活性的状态，但其费时费力，效果差且污染环境。
发明内容
本发明要解决的技术问题为不采用蛋白质的复性及变性技术方案而实现a_l，3半乳糖基转移酶在细菌中具生物活性的可溶性表达。本发明的一个目的是提供一种融合蛋白，由TRX蛋白与a -I，3半乳糖基转移酶融合形成，具有催化a -半乳糖表位形成活性。硫氧还蛋白(thioredoxin, Trx)是一种具有氧化还原活性的小分子蛋白质，分子质量12kD，广泛存在于所有生物体中。作为机体内一种重要的氧化还原调节蛋白，硫氧还蛋白(TRX)具有多种生物学功能。TRX是非常有效的自由基清除剂，能保护细胞免受诸如肿瘤坏死因子(TNF)以及H2O2等引起的氧化损伤。此外，TRX还通过修复受损伤的蛋白、抑制凋亡和调节某些转录因子表达对细胞起保护作用。目前研究证实TRX在组织的缺血再灌注损伤和神经退行性病变的防治中发挥了重要作用。在实现上述技术方案过程中，具体的实验设计和实施方式可以是在本技术领域的技术人员所公知的知识和方法范围内作任何等同的替代或变换或改变，并不限于该申请文件所具体陈述的范围。例如，a-l，3半乳糖基转移酶基因，除了通常用全长基因外，还可以用其功能域。我们已用了一种功能域，当然还有其他氨基酸多一些或少一些的功能域，只要功能域保持催化a-半乳糖表位形成的功能(催化结构功能)即可。类似等同的替代或变换或改变，在此不--列举。作为优选，所述a -I，3半乳糖基转移酶包括其催化结构功能域a I, 3GTcd部分。更优选地，所述a _1，3半乳糖基转移酶还包括用于纯化的序列。为了进一步简化a _1，3半乳糖基转移酶融合蛋白的纯化，本发明所述融合蛋白还可以包含任何本技术领域的技术人员所已知的例如GST或His-tag等蛋白或结构功能域。在本发明的具体实施例中，a -1，3半乳糖基转移酶的上游设计选择了 His-tag以便后续纯化之用，当然His-tag也可设计在整个融合蛋白的上游或下游，或者使用其他纯化功能的蛋白序列。本发明所述的融合蛋白，其为可溶状态。在本发明的具体实施方式
中，提供的融合蛋白氨基酸序列如SEQ ID No. 3所示。本发明为了避免包涵体的形成，直接在细菌中产生可溶性的具有酶学活性的蛋白，采取了如下技术方案克隆a _1，3半乳糖基转移酶基因，把该基因直接克隆到常用的表达载体上，结果形成了包涵体；更改不同的载体或者更改不同的受体菌仍然形成包涵体；接着，借助于蛋白融合技术，把该基因与TRX基因，即一种氧化还原蛋白thioredoxin基因融合在一起,使 a _1，3半乳糖基转移酶以融合蛋白的形式进行表达，结果该融合蛋白在通常的各种培养条件下均形成可溶性表达，并且重要的是该融合蛋白完全具有a -1，3半乳糖基转移酶活性。另外，本发明所述融合蛋白的表达量较高，占可溶性细菌裂解物的20%以上。本发明还提供产生根据所述a _1，3半乳糖基转移酶融合蛋白的细菌。作为优选，其为大肠杆菌DH5a或大肠杆菌BL21 (DE3)。本发明的又一个目的是提供一种生产所述a -I，3半乳糖基转移酶融合蛋白的方法。目前常用的是重组DNA技术，一般包括四步①获得目的基因； 与克隆载体连接，形成新的重组DNA分子用重组DNA分子转化受体细胞，并能在受体细胞中复制和遗传；④对转化子筛选和鉴定。⑤对获得外源基因的细胞或生物体通过培养，获得所需的遗传性状或表达出所需要的产物。作为优选，所述方法为制备包含a-1，3半乳糖基转移酶基因与TRX基因的重组DNA,将所述重组DNA分子转化受体细胞，培养获得a -1，3半乳糖基转移酶的融合蛋白。更优选地，所述重组DNA包括用于纯化的DNA序列部分。在本发明的具体实施方式
中提供的产生方法，具体步骤为步骤I、以如SEQ ID No. I所示序列为模板进行PCR扩增，其上游引物序列如SEQID No. 4所示；下游引物序列如SEQ ID No. 5所示；步骤2 :将PCR产物与pET_32a质粒载体用KpnI及XhoI两种限制性内切酶的作用下酶切；步骤3 :在T4DNA连接酶的作用下，连接载体与基因；将连接产物转化感受态细菌，培养获得a-1，3半乳糖基转移酶的融合蛋白。作为优选所述细菌为大肠杆菌DH5 a或大肠杆菌BL21 (DE3)。本发明借助于蛋白融合技术，把a-1，3半乳糖基转移酶基因与TRX基因，即一种氧化还原蛋白thioredoxin基因融合在一起,使a-1，3半乳糖基转移酶以融合蛋白的形式进行表达，并形成可溶性表达，经试验验证，本发明所述融合蛋白完全具有a-l，3半乳糖基转移酶活性，且表达量较高，占可溶性细菌裂解物的20%以上，具有良好的工业应用前
旦
o
图I为本发明所述a _1，3半乳糖基转移酶融合蛋白的纯化凝胶电泳照片，其中，第I栏分子量标准；第2栏菌体总蛋白；
第3栏菌体破碎离心后的上清蛋白；第4栏纯化的a -I，3半乳糖基转移酶融合蛋白；第5栏纯化的a -I，3半乳糖基转移酶融合蛋白。
具体实施例方式本发明公开了一种a _1，3半乳糖基转移酶融合蛋白及制备方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明所述的a-l，3半乳糖基转移酶融合蛋白及制备方法已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。为了使本领域的技术人员更好地理解本发明的技术方案，下面结合具体实施例对本发明作进一步的详细说明。实施例I克隆a -I，3半乳糖基转移酶基因利用本技术领域的技术人员已知的方法，我们克隆到的a -1，3半乳糖基转移酶基因序列如SEQ ID No. I所示，该基因所对应的a-l，3半乳糖基转移酶氨基酸序列如SEQID No. 2所示。为了后续克隆的方便，基因的上游加有NdeI等限制性内切酶位点，基因的下游加有BamHI位点。实施例2a-1，3半乳糖基转移酶表达克隆的构建将上述实施例I所克隆到的a -1，3半乳糖基转移酶基因用PCR的方法引入限制性内切酶NdeI和BamHI的酶切位点，所用的上游引物序列为5’GAATACCATATGGAAAGCAAGCTTAAGCTATCG3’ ；下游引物序列为5 ’ GAAGGATCCTTATCAGACATTAITTCTAAC3 ’。将回收后的 PCR产物，pET-15b质粒载体均用NdeI (NEB)及BamHI (NEB)两种限制性内切酶作用下酶切3小时；琼脂糖凝胶电泳检测酶切效果后回收载体及基因片段；在了40嫩连接酶(NEB)的作用下，连接该载体与该基因；将连接产物直接加入到冰浴融化的大肠杆菌DH5 a的感受态中，孵育30分钟后42°C水浴热击转化；最后筛选的转化子用测序验证序列正确的a -1，3半乳糖基转移酶表达克隆。实施例3a -I，3半乳糖基转移酶与TRX融合表达克隆的构建将上述实施例I所克隆到的a -1，3半乳糖基转移酶基因用PCR的方法引入限制性内切酶KpnI和XhoI的酶切位点，所用的上游引物序列为5’ GAATACGGTACCGAAAGCAAGCTTAAGCTATCG3’(序列如 SEQ ID No. 4 所示)；下游引物序列为
5’ GAACTCGAGTTATCAGACATTAITTCTAAC3’(序列如 SEQ ID No. 4 所示)；将回收后的PCR产物与pET_32a质粒载体均用KpnI及XhoI两种限制性内切酶的作用下酶切3小时；琼脂糖凝胶电泳检测酶切效果后回收载体及基因；在T4DNA连接酶(NEB)的作用下，连接载体与基因；将连接产物直接加入到冰浴融化的大肠杆菌DH5 a的感受态中，孵育30分钟后42°C水浴热击转化；最后筛选的转化子用测序验证序列正确的a -1，3半乳糖基转移酶融合蛋白表达克隆。本实施例选择pET_32a质粒载体是利用其上游含有TRX基因序列；当然也可以把TRX基因用PCR方法插于到其他含有a-I，3半乳糖基转移酶基因序列的载体上，可以同样实现a-1，3半乳糖基转移酶融合蛋白表达克隆构建的目的。实施例4a -I，3半乳糖基转移酶克隆的I升表达把上述实施例2已证实的a-I，3半乳糖基转移酶表达克隆DNA转化大肠杆菌 BL2KDE3)，然后从LB平板上挑取单菌落，挑取的单菌落在4毫升含有50微克/毫升的LB液体培养基中过夜培养，过夜培养物随后按1:250的比例加入到2个500毫升的LB液体培养基中，37°C培养18小时以上，然后4°C离心收集培养物，沉淀的菌体用超声波破碎仪处理，4°C离心收集上清，取上清经SDS-PAGE检测表达状况表明表达的绝大部分或全部为不可溶的包涵体。实施例5a-I，3半乳糖基转移酶融合蛋白克隆的I升表达把上述实施例3已证实的a -1，3半乳糖基转移酶融合蛋白表达克隆DNA转化大肠杆菌BL2KDE3)，后从LB平板上挑取单菌落，挑取的单菌落在4毫升含有50微克/毫升的LB液体培养基中过夜培养，过夜培养物随后按1:250的比例加入到2个500毫升的LB液体培养基中，37°C培养18小时以上，然后4°C离心收集培养物，沉淀的菌体用超声波破碎仪处理，4°C离心收集上清，取该上清经SDS-PAGE检测该a -I，3半乳糖基转移酶融合蛋白克隆的表达表明表达的绝大部分或全部为可溶状态。实施例6a-1,3半乳糖基转移酶融合蛋白的纯化上述实施例5制得的上清加载于已用5倍床体积的平衡液处理的镍亲和层吸住中，上清加完后用10倍床体积的平衡液除去未结合或非特异结合的细菌蛋白或其他杂质，a -1，3半乳糖基转移酶融合蛋白最后用含200mM咪唑的洗脱液获得。该融合蛋白经此一步亲和层析的纯度达80%以上，其氨基酸序列如SEQ ID No. 3所示。该融合蛋白透析后可以直接用于a-l，3半乳糖基转移酶生物活力的测定。当然，进一步利用例如凝胶过滤层析等方法可使该融合蛋白得到进一步纯化，酶的比活力得到相应的提高。另外，由于我们选择的pET_32a质粒载体在TRX与插入的a-l，3半乳糖基转移酶之间含有凝血酶的识别位点，所以可以用凝血酶把a -1，3半乳糖基转移酶功能域释放出来；也可以选择设计其他用途类似的蛋白内切酶类来到达同样的目的。是否释放则完全依赖具体商业目的，因为该a-1，3半乳糖基转移酶融合蛋白具有游离的a-1，3半乳糖基转移酶所具有的催化功能。实施例7
a -I，3半乳糖基转移酶融合蛋白的活性测定用96孔板培养人肺癌细胞株A549细胞至合适密度；用4%PFA (多聚甲醛)室温固定A549细胞30分钟，用PBS洗两次，每次5分钟；然后用神经氨酸酶在37°处理20分钟，室温下PBS洗两次；在室温下加入100微升含IOmM TrisHCl pH7. 0，IOmM氯化锰，0. 1%牛血清白蛋白，0. 3mM尿嘧啶二磷酸-半乳糖的缓冲液，同时加入适量的上述实施例6纯化的a -I，3半乳糖基转移酶融合蛋白，该反应置37°下25分钟；后用IOOmM EDTA的二钠盐终止反应。随后即按通常的ELISA反应测定a _1，3半乳糖基转移酶的活力。在与未加入该融合蛋白的对照孔相比，加入上述实施例6纯化的a-1，3半乳糖基转移酶融合蛋白的反应孔即呈显色反应，表明具 催化a-半乳糖表位形成的活性，亦可作进一步定量分析。以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
权利要求
1.一种融合蛋白，其特征在于，由TRX蛋白与a-1，3半乳糖基转移酶融合形成，具有催化a-半乳糖表位形成活性。
2.根据权利要求I所述的融合蛋白，其特征在于所述a-1，3半乳糖基转移酶包括其催化结构功能域ct I, 3GTcd部分。
3.根据权利要求I所述的融合蛋白，其特征在于所述a-1，3半乳糖基转移酶还包括用于纯化的序列。
4.根据权利要求I所述的融合蛋白，其特征在于所述用于纯化的序列为GST或His-tag结构域。
5.根据权利要求1-4任一项所述的融合蛋白，其特征在于其为可溶状态。
6.根据权利要求1-4任一项所述的融合蛋白，其特征在于其氨基酸序列如SEQID、No. 3所示。
7.产生根据权利要求1-6任一项所述融合蛋白的细菌。
8.根据权利要求7所述的细菌，其特征在于，其为大肠杆菌DH5a或大肠杆菌BL21(DE3)。
9.一种生产权利要求I至6任一项所述融合蛋白的方法。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于制备包含a-1，3半乳糖基转移酶基因与TRX基因的重组DNA，将所述重组DNA分子转化受体细胞，培养获得a_l，3半乳糖基转移酶的融合蛋白。
11.根据权利要求10所述的方法，其特征在于所述重组DNA包括用于纯化的DNA序列部分。
12.根据权利要求10所述的方法，其特征在于具体步骤为 步骤I、以如SEQ ID No. I所示序列为模板进行PCR扩增，其上游引物序列如SEQ IDNo. 4所示；下游引物序列如SEQ ID No. 5所示; 步骤2 :将PCR产物与pET-32a质粒载体用KpnI及XhoI两种限制性内切酶的作用下酶切； 步骤3 :在T4DNA连接酶的作用下，连接载体与基因；将连接产物转化感受态细菌，培养获得a-1，3半乳糖基转移酶的融合蛋白。
13.根据权利要求12所述的方法，其特征在于所述细菌为大肠杆菌DH5ci或大肠杆菌 BL21 (DE3)。
全文摘要
本发明公开了一种α-1，3半乳糖基转移酶融合蛋白及其制备方法。本发明所述α-1，3半乳糖基转移酶融合蛋白包含TRX，催化α-半乳糖表位形成。本发明还提供产生该α-1，3半乳糖基转移酶融合蛋白的细菌。本发明所述融合蛋白完全具有α-1，3半乳糖基转移酶活性，为可溶性表达且表达量较高，占可溶性细菌裂解物的20%以上，具有良好的工业应用前景。
文档编号C12R1/19GK102703399SQ20121019513
公开日2012年10月3日 申请日期2012年6月13日 优先权日2012年6月13日
发明者云升, 王云虹, 蔡传奇, 郭海军, 闫宇鹏 申请人:北京京蒙高科干细胞技术有限公司