专利名称：一种成纤维细胞培养液的制作方法
技术领域：
本发明涉及动物细胞培养技术领域，尤其涉及ー种成纤维细胞培养液。
背景技术：
细胞是生物体的基本结构和功能单位，在生命科学迅速发展的当今社会，动物克隆、干细胞、乳腺生物反应器转基因动物、人造组织和器官等重大科学进展都离不开细胞エ程所建立的平台。细胞工程是人类按照一定的设计方案，通过在细胞、亚细胞或组织水平上进行实验操作，获得重构的细胞、组织、器官，甚至个体，从而培育创造优秀品种或产品的综合性生物工程。当前细胞工程所涉及的主要技术领域有细胞培养、细胞融合、细胞拆合、染 色体操作及基因转移等方面。细胞工程已经渗透到人类生活衣食住行等许多领域，如治疗疾病的药物、预防疾病的疫苗、美容的化妆品、吃的食物等。细胞培养是细胞工程得以产业化应用的平台和基础，通过培养出大量的细胞用于生产和研究才能生产出细胞工程产品。在培养应用的众多细胞中，成纤维细胞是应用最广泛的细胞之一。成纤维细胞具有来源广泛，因细胞呈现纤维状形态而得名，各种组织器官中均含有大量的成纤维细胞，成纤维细胞在组织中常用于受损组织器官的快速修复。目前，成纤维细胞已广泛应用于动物克隆、干细胞、转基因乳腺生物反应器动物、人造组织和器官等重大科学研究和生产实践。但是，高质量和生长性能的成纤维细胞对于细胞工程产品的质量和效率至关重要。在成纤维细胞的培养生长过程中，细胞培养液是必不可少的。目前的常规细胞培养液，在使用中存在成纤维细胞生长速度慢，増殖能力弱，培养的成纤维细胞经常不具有典型的纤维状形态，以及抗凋亡能力较弱而且容易衰老的问题。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供ー种成纤维细胞培养液。为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是ー种成纤维细胞培养液，由以下组分组成
10%月台牛血清,4 ng/ml碱性成纤维细胞生长因子,2. 5 μ g/ml Plasmocin, 100 U/ml青霉素，100 μ g/ml链霉素，高糖DMEM培养液补足到100%。喊性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor,bFGF)是成纤维细胞生长因子蛋白(fibroblast growth factors, FGFs)家族中的一员。目前已发现至少22种FGF，bFGF是哺乳动物和人体中ー种非常微量的活性物质，具有广泛的生理功能和重要的临床应用价值。bFGF具有能刺激新生血管形成，參与创伤愈合和组织再生，促进胚胎组织发育和分化等，此外还与肿瘤的发生发展密切相关。近年来，重组bFGF已被应用于临床治疗创伤、溃疡及神经系统等疾病。在细胞培养中支原体感染发生率达到63%，支原体感染发生后能改变细胞的DNA、RNA及蛋白表达,从而导致细胞生长缓慢和质量较差。Plasmocin属于新一代杀菌抗生素，能强烈的作用于感染支原体的细胞，杀灭支原体。同时，Plasmocin能以ー种较低的作用浓度发挥广谱的抗革兰氏阳性和革兰氏阴性的细菌作用，比如能作用于耐青霉素与链霉素的细菌，已经证实Plasmocin对真核细胞没有毒性，不影响细胞本身的代谢。本发明的有益效果是
本发明设计的成纤维细胞培养液与常规成纤维细胞培养液相比，能使成纤维细胞生长速度快，増殖能力强，培养的成纤维细胞具有典型的纤维状形态，及具有更强的抗凋亡能力而不易衰老。因此，本发明设计的成纤维细胞培养液培养的成纤维细胞应用于生产实践将会生产出更高质量和效率的细胞工程产品。
下面结合附图和具体实施方式
对本发明作进ー步详细的说明。 图I是在本发明设计的成纤维细胞培养液中生长的纤维状细胞形态。图2是在常规成纤维细胞培养液中生长的纤维状细胞形态。
具体实施例方式一、材料与方法
I、成纤维细胞的培养
取牛、羊、猪和小鼠的成纤维细胞进行培养，实验组采用设计的新型成纤维细胞培养液(下称新型培养液)，新型培养液的组分为10% FBS+ 4 ng/ml碱性成纤维细胞生长因子+2. 5 μ g/ml Plasmocin + 100 U/ml 青霉素+100 μ g/ml 链霉素 +高糖 DMEM培养液。对照组采用常规成纤维细胞培养液(下称常规培养液)，常规培养液的组分为10% FBS +100 U/ml青霉素+ 100 μ g/ml链霉素+高糖DMEM培养液。分别取不同物种相同培养代数的成纤维细胞，采用上述两种培养液进行培养。2、成纤维细胞的增殖能力检测
分别按相同的密度接种不同物种的成纤维细胞，采用上述两种培养液，在其它因素相同的培养条件下进行培养，对于生长增殖能力进行检测的细胞，用4%多聚甲醛进行固定，用I μ g/ml的荧光染料DAPI进行细胞核染色，Imin后荧光镜下观察细胞增殖结果和细胞增殖状态。同时，用胰酶消化细胞，收集单个细胞，进行细胞计数，统计分析细胞的増殖能力。3、成纤维细胞的抗凋亡能力检测
分别按相同的密度接种不同物种的成纤维细胞，采用上述两种培养液，在其它因素相同的培养条件下进行培养，用lOyg/ml的丝裂霉素处理成纤维细胞，处理后消化成纤维细胞，再接种进行培养，分别于I周后用4%多聚甲醛进行固定，用I μ g/ml的荧光染料DAPI进行细胞核染色，Imin后荧光镜下观察细胞抗凋亡能力。在不用丝裂霉素处理的情况下，分别对细胞进行传代，传代至第五代时在细胞生长的第二天用4%多聚甲醛进行固定，用Iyg/ml的荧光染料DAPI进行细胞核染色Imin后荧光镜下观察细胞抗凋亡能力。ニ、实验结果
I、成纤维细胞的典型纤维状生长形态
如图I所示，在使用设计的新型培养液之后，牛、羊、猪和小鼠的成纤维细胞均呈现典型的纤维状生长形态，处于生长阶段的成纤维细胞其纤维状形态较为短粗，而处于铺满培养皿阶段的成纤维细胞则呈现狭长的纤维状形态，成纤维细胞之间连接紧密，単位细胞生长面积细胞密度较大。纤维状的细胞紧密连接形成涡旋状细胞群体形态，涡旋状细胞群体形态是高质量成纤维细胞的重要细胞形态表现。如图2所示，在相同培养环境条件下，使用常规培养液的牛、羊、猪和小鼠的成纤维细胞则呈现扁平状细胞形态，単位面积细胞生长密度相对较小。2、成纤维细胞快速的生长增殖能力
牛、羊、猪和小鼠的成纤维细胞在I :3比例进行培养传代的情况下，常规培养液则需要3天才能铺满培养皿，而使用新型培养液仅需要I I. 5天即可铺满培养皿。对铺满培养皿的细胞进行计数显示，使用设计的新型培养液细胞数量是常规培养液细胞数量的5 10倍。碱性成纤维细胞生长因子在培养液中仅添加使用一次，以后进行传代培养的细胞相对于只用常规培养液培养的细胞而言均具有较强的増殖能力。碱性成纤维细胞生长因子在培养液中的浓度超过4 ng/ml之后，细胞的生长增殖速度和细胞的生长形态均无明显差异和 影响。3、成纤维细胞较强的抗凋亡能力
细胞凋亡是细胞在生长过程中的自然死亡和衰老现象。牛、羊、猪和小鼠的成纤维细胞在使用设计的新型培养液之后，于培养的第五代时细胞凋亡现象极少出现，而在常规培养液培养的成纤维细胞则凋亡现象非常明显，特别是对于来源于猪和小鼠的成纤维细胞而言，使用常规培养液比使用设计的新型培养液细胞凋亡现象增加10 50倍。对于用丝裂霉素处理的成纤维细胞而言，使用常规培养液比使用设计的新型培养液细胞凋亡现象在I周后也表现增加10 50倍，结果显示设计的新型培养液使成纤维细胞具有较强的抗凋亡和抗衰老的能力。以上所述的本发明实施方式，并不构成对本发明保护范围的限定。任何在本发明的精神和原则之内所作的修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的权利要求保护范围之内。
权利要求
1.ー种成纤维细胞培养液，其特征在干由以下组分组成 10%月台牛血清,4 ng/ml碱性成纤维细胞生长因子,2. 5 μ g/ml Plasmocin, 100 U/ml青霉素，100 μ g/ml链霉素，高糖DMEM培养液补足到100%。
全文摘要
本发明公开了一种成纤维细胞培养液，由以下组分组成10％胎牛血清，4ng/ml碱性成纤维细胞生长因子，2.5μg/mlPlasmocin，100U/ml青霉素，100μg/ml链霉素，高糖DMEM培养液补足到100%。本发明设计的成纤维细胞培养液与常规的成纤维细胞培养液相比，能使成纤维细胞生长速度快，增殖能力强，培养的成纤维细胞具有典型的纤维状形态，及具有更强的抗凋亡能力而不易衰老。因此，本发明设计的成纤维细胞培养液培养的成纤维细胞应用于生产实践将会生产出更高质量和效率的细胞工程产品。
文档编号C12N5/071GK102690782SQ20121019486
公开日2012年9月26日 申请日期2012年6月14日 优先权日2012年6月14日
发明者刘亚, 张运海, 方富贵, 曹鸿国, 李运生, 杨盼, 章孝荣, 蒲勇, 陶勇 申请人:安徽农业大学