专利名称：检测重组小鼠碱性成纤维细胞生长因子的免疫胶乳微球及其制备方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种检测重组小鼠碱性成纤维细胞生长因子的免疫胶乳微球及其制备方法和应用。
背景技术：
碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor，bFGF)是由垂体和下丘脑分泌的多肽，广泛存在于神经组织、成纤维细胞和巨噬细胞中。作为一种广谱有丝分裂原，其具有极强的生物活性①对来源于中胚层和神经外胚层的各种细胞均有促增殖作用、趋化作用和促细胞迁移运动作用；②能促进剖面毛细血管新生，改善了微循环和组织的营养状况，同时促进成纤维细胞和成肌细胞的增殖，使肉芽迅速生长；③增强源于中胚层的免疫细胞的活性，提高剖面的抗感染能力。研究表明，bFGF在机体内参与多种组织的创伤修复过程，是机体内重要的创伤愈合因子之一。创伤后bFGF的含量高低能直接反映创面修复中的血管生成水平，为检测和监测创伤修复和组织愈合情况等提供依据。在临床上，碱性成纤维细胞生长因子可用于治疗颅脑、脊髓、周围神经损伤，中毒， 感染，脑出血、脑梗塞、脑萎缩、脑发育不良，角膜溃疡，神经性耳聋，面瘫，粘膜、皮肤损伤， 烧伤，慢性溃疡，软组织损伤，内脏损害，骨折，一些内分泌疾病，断肢再植和各种手术后的伤口愈合等。bFGF可以促进损伤愈合，大大缩短病程，改善预后，但迄今对于损伤创面中原发bFGF含量的检测方法不多，且检测灵敏度、检测限和抗干扰能力等亟待提高。目前，有关 bFGF免疫检测技术的研究报告和相关专利技术国内外报道很少，迫切需要开发高效、准确、 快速的新型免疫检测技术和产品。
发明内容
本发明的目的是针对上述现状，旨在提供一种用于检测灵敏度较高，且操作简单、 重复性强，最低检测限为mbFGF蛋白60pg/ml的检测重组小鼠碱性成纤维细胞生长因子的免疫胶乳微球及其制备方法和应用。本发明目的的实现方式为，一检测重组小鼠碱性成纤维细胞生长因子的免疫胶乳微球，是用单分散羧基化聚苯乙烯微球为基质材料，用羧基-氨基化学偶联方法偶联抗 mbFGF多克隆抗体获得的免疫胶乳微球，是由抗mbFGF蛋白多克隆抗体包被的微球，微球颗粒大小50nm。检测重组小鼠碱性成纤维细胞生长因子的免疫胶乳微球的制备方法，具体步骤如下(1)根据原核细胞表达的优先密码子重新修饰并构建全长小鼠bFGF基因表达序列；(2)将小鼠bFGF基因片段通过限制酶切割插入谷胱甘肽-S-转移酶GST基因融合表达载体中，构建细菌融合表达载体；
所述谷胱甘肽-S-转移酶基因融合表达载体是PGEX-4T-3，构建完成后的融合表达载体是 pGEX-4T-3-mbFGF ；(3)对细菌融合表达载体进行细菌表达后，利用亲合层析柱纯化获得GST-mbFGF 融合蛋白；所述亲合层析柱为Glutathione Sepharose 4B ；(4)利用凝血酶在柱切割GST-mbFGF融合蛋白，洗脱物经亲合层析柱去除凝血酶后，获得小鼠 bFGF ；亲合层析柱为 Benzamidine Sepharose 4B Fast Flow (5)将弗氏佐剂溶合抗原后免疫兔，经分离纯化得到兔抗mbFGF多克隆抗体；所述抗原为mbFGF蛋白；(6)将步骤(5)所得到的兔抗mbFGF多克隆抗体，通过羧基-氨基化学偶联法偶联活化微球，得到检测重组小鼠碱性成纤维细胞生长因子的免疫胶乳微球；所述微球是单分散羧基化聚苯乙烯微球，大小50nm，表面载基团为羧基，所述微球的活化是首先用活化剂碳化二亚胺活化微球，然后加入保护剂 Sulfo-NHS使微球形成稳定的活泼酯中间体，以备连接抗体分子。检测重组小鼠碱性成纤维细胞生长因子的免疫胶乳微球的的应用，通过酶标仪， 采用酶联免疫吸附测定法，检测mbFGF样品的bFGF。本发明采用单分散羧基化聚苯乙烯微球为基质材料，用羧基-氨基化学偶联方法偶联抗mbFGF多克隆抗体获得免疫胶乳微球，取材简单、操作方便；制备方法细致严谨，重复性高；所制备的免疫胶乳微球颗粒小，粒径均勻，经酶联免疫吸附测定(ELISA)最低检测限为重组小鼠碱性成纤维细胞生长因子60pg/ml，相关系数R2 = 0. 96。
图1是羧基化聚苯乙烯微球扫描电镜照片，图2是mbFGF基因原序列，图3是菌落PCR验证mbFGF基因插入片段电泳，
图4是质粒)(ba I酶切电泳，图5是mbFGF表达载体测序，图 6 是 mbFGF 蛋白 SDS-PAGE(A)和 Western Blotting(B)检测，图7是抗血清效价测定图，图8是ELISA法检测mbFGF实物图，图9是ELISA法检测mbFGF蛋白结果。
具体实施例方式本发明的一种检测重组小鼠碱性成纤维细胞生长因子的免疫胶乳微球是用单分散羧基化聚苯乙烯微球为基质材料，用羧基-氨基化学偶联方法偶联抗mbFGF多克隆抗体获得如图1所示的的免疫胶乳微球。免疫胶乳微球由抗mbFGF蛋白多克隆抗体包被，微球颗粒大小50nm。下面详述一种检测重组小鼠碱性成纤维细胞生长因子的免疫胶乳微球的制备方法，具体步骤如下1、根据原核细胞表达的优先密码子重新修饰并构建全长小鼠bFGF基因表达序列，其具体步骤为(1)设计全长mbFGF基因序列，根据原核细胞表达的优先密码子重新修饰，采用全基因合成技术构建全长mbFGF基因，共462对碱基，克隆至载体pGEM_T Easy，结果如图2所示。(2)通过菌落PCR验证mbFGF基因片断插入的正确性，结果如图3所示。(3)将克隆mbFGF基因菌实施扩增培养，提取质粒后进行酶切和琼脂糖电泳分析， 结果如图4所示。(5)DNA测序，保证基因的全部序列100%准确，结果如图5所示。2、将小鼠bFGF基因片段通过限制酶切割插入谷胱甘肽_S_转移酶GST基因融合表达载体PGEX-4T-3中，构建细菌融合表达载体pGEX-4T-3-mbFGF，具体的操作步骤如下(1)将mbFGF基因片段通过限制酶切割插入pGEX-4T-3载体中，构建细菌融合表达载体 pGEX-4T-3-mbFGF ；(2)将融合表达载体pGEX-4T-3-mbFGF转化大肠杆菌BL21 (DE3)细胞，细胞生长条件为200转/分，温度37°C ；(3)当菌体生长OD595值为0. 5-0. 8时，加入1. OmM的诱导剂IPTG，在25°C诱导2-3 小时。在4°C时，以5，OOOXg离心5分钟，收集菌体；(4)菌体经PBS缓冲液清洗3次后，超声破碎。破碎细胞在4°C时，以15，000 X g 离心1小时，收集上清液；(5)将上清循环通过Glutathione Sepharose 4B亲合层析柱，4°C过夜。未结合蛋白用10倍床体积的1 XPBS冲洗；(6)将结合的GST-mbFGF融合蛋白用凝血酶在柱切割并用洗脱液洗脱，收集洗脱物；(7)将上述洗脱物通过Benzamidine Sepharose 4B Fast Flow亲合层析柱吸附凝血酶，经洗脱后获得蛋白抗原mbFGF。3、将弗氏佐剂溶合抗原后免疫兔，经分离纯化得到兔抗mbFGF多克隆抗体，具体的制备步骤如下(1)将mbFGF蛋白抗原与弗氏佐剂混合后，充分乳化。采用背部多点注射法免疫家兔。每次免疫的抗原量约100 μ g，免疫三次。每次免疫两周后经耳动脉取血检测抗体效价。(2)以500 μ g/ml浓度的抗原包被酶标板，100 μ 1/孔，4°C过夜；(3)洗涤后，加入待检的血清样品，100 μ 1/孔，37°C 1小时；设阴性对照孔；(4)洗涤后，加入HRP标记的羊抗兔IgG的抗体试剂，100 μ 1/孔，37°C避光显色20 分钟；用2. 5M H2SO4终止反应后，阅读各孔的A490值。对制备的mbFGF抗体，经ELISA法检测，抗体能与mbFGF特异性结合，其相关系数达到显著水平，效价>1 6000，结果如图7所示。4、兔抗mbFGF多克隆抗体通过羧基-氨基化学偶联法偶联活化微球，得到检测重组小鼠碱性成纤维细胞生长因子的免疫胶乳微球mbFGF抗体制备完成后，通过化学偶联单分散羧基化聚苯乙烯微球，制备用于检测mbFGF蛋白的免疫胶乳微球，具体的制备和检测步骤如下
(1)将单分散羧基化聚苯乙烯微球用活化剂EDC(碳化二亚胺)活化，然后加入保护剂Sulfo-NHS使微球形成稳定的活泼酯中间体；(2)加入抗mbFGF多克隆抗体，温育1-2小时；(3)洗涤后，收集免疫微球；(4)通过酶标仪，采用酶联免疫吸附测定(ELISA)法，检测mbFGF样品(如图8所示)°经ELISA方法验证，用于检测mbFGF的免疫胶乳微球最低检测限为重组小鼠碱性成纤维细胞生长因子60pg/ml，相关系数R2 = 0. 96，结果如图9所示。由此可见，本发明所制备的用于检测mbFGF的免疫胶乳微球检测灵敏度较高，且操作简单、重复性强，显示了良好的应用前景。
权利要求
1.检测重组小鼠碱性成纤维细胞生长因子的免疫胶乳微球，其特征在于是用单分散羧基化聚苯乙烯微球为基质材料，用羧基-氨基化学偶联方法偶联抗mbFGF多克隆抗体获得的免疫胶乳微球，是由抗mbFGF蛋白多克隆抗体包被的微球，微球颗粒大小50nm。
2.权利要求1所述的检测重组小鼠碱性成纤维细胞生长因子的免疫胶乳微球的制备方法，其特征在于具体步骤如下(1)根据原核细胞表达的优先密码子重新修饰并构建全长小鼠bFGF基因表达序列；(2)将小鼠bFGF基因片段通过限制酶切割插入谷胱甘肽-S-转移酶GST基因融合表达载体中，构建细菌融合表达载体；所述谷胱甘肽-S-转移酶基因融合表达载体是PGEX-4T-3，构建完成后的融合表达载体是 pGEX-4T-3-mbFGF ；(3)对细菌融合表达载体进行细菌表达后，利用亲合层析柱纯化获得GST-mbFGF融合蛋白；所述亲合层析柱为Glutathione Sepharose 4B ；(4)利用凝血酶在柱切割GST-mbFGF融合蛋白，洗脱物经亲合层析柱去除凝血酶后，获 H^Ml bFGFBenzamidine Sepharose 4B Fast Flow (5)将弗氏佐剂溶合抗原后免疫兔，经分离纯化得到兔抗mbFGF多克隆抗体；所述抗原为mbFGF蛋白；(6)将步骤( 所得到的兔抗mbFGF多克隆抗体，通过羧基-氨基化学偶联法偶联活化微球，得到检测重组小鼠碱性成纤维细胞生长因子的免疫胶乳微球；所述微球是单分散羧基化聚苯乙烯微球，大小50nm，表面载基团为羧基，所述微球的活化是首先用活化剂碳化二亚胺活化微球，然后加入保护剂Sulfo-NHS使微球形成稳定的活泼酯中间体，以备连接抗体分子。
3.根据权利要求2所述的检测重组小鼠碱性成纤维细胞生长因子的免疫胶乳微球的制备方法，其特征在于根据原核细胞表达的优先密码子重新修饰并构建全长小鼠bFGF基因表达序列的具体步骤为(1)设计全长mbFGF基因序列，根据原核细胞表达的优先密码子重新修饰，采用全基因合成技术构建全长mbFGF基因，共462对碱基，克隆至载体pGEM-T Easy，结果如图2所示。(2)通过菌落PCR验证mbFGF基因片断插入的正确性，结果如图3所示。(3)将克隆mbFGF基因菌实施扩增培养，提取质粒后进行酶切和琼脂糖电泳分析，结果如图4所示。(5) DNA测序，保证基因的全部序列100%准确
4.根据权利要求2所述的检测重组小鼠碱性成纤维细胞生长因子的免疫胶乳微球的制备方法，其特征在于将小鼠bFGF基因片段通过限制酶切割插入谷胱甘肽-S-转移酶GST 基因融合表达载体PGEX-4T-3中，构建细菌融合表达载体pGEX-4T-3-mbFGF的具体操作步骤如下(1)将mbFGF基因片段通过限制酶切割插入pGEX-4T-3载体中，构建细菌融合表达载体 pGEX-4T-3-mbFGF ；(2)将融合表达载体pGEX-4T-3-mbFGF转化大肠杆菌BL21(DE!3)细胞，细胞生长条件为 200转/分，温度37°C ；(3)当菌体生长OD595值为0.5-0. 8时，加入1. OmM的诱导剂IPTG，在25°C诱导2-3小时。在4°C时，以5，OOOXg离心5分钟，收集菌体；(4)菌体经PBS缓冲液清洗3次后，超声破碎。破碎细胞在4°C时，以15，OOOXg离心 1小时，收集上清液；(5)将上清循环通过GlutathioneSepharose 4B亲合层析柱，4°C过夜。未结合蛋白用 10倍床体积的IXPBS冲洗；(6)将结合的GST-mbFGF融合蛋白用凝血酶在柱切割并用洗脱液洗脱，收集洗脱物；(7)将上述洗脱物通过BenzamidineSepharose 4B Fast Flow亲合层析柱吸附凝血酶，经洗脱后获得蛋白抗原mbFGF。
5.根据权利要求2所述的检测重组小鼠碱性成纤维细胞生长因子的免疫胶乳微球的制备方法，其特征在于将弗氏佐剂溶合抗原后免疫兔，经分离纯化得到兔抗mbFGF多克隆抗体的具体制备步骤如下(1)将mbFGF蛋白抗原与弗氏佐剂混合后，充分乳化。采用背部多点注射法免疫家兔。 每次免疫的抗原量约100 μ g，免疫三次。每次免疫两周后经耳动脉取血检测抗体效价。(2)以500μ g/ml浓度的抗原包被酶标板，100 μ 1/孔，4°C过夜；(3)洗涤后，加入待检的血清样品，100μ1/孔，37°C 1小时；设阴性对照孔；(4)洗涤后，加入HRP标记的羊抗兔IgG的抗体试剂，100μ 1/孔，37°C避光显色20分钟；用2. 5M H2SO4终止反应后，阅读各孔的A490值。
6.根据权利要求2所述的检测重组小鼠碱性成纤维细胞生长因子的免疫胶乳微球的制备方法，其特征在于兔抗mbFGF多克隆抗体通过羧基-氨基化学偶联法偶联活化微球，得到检测重组小鼠碱性成纤维细胞生长因子的免疫胶乳微球的具体制备步骤如下(1)将单分散羧基化聚苯乙烯微球用活化剂活化，然后加入保护剂 Sulfo-NHS使微球形成稳定的活泼酯中间体；(2)加入抗mbFGF多克隆抗体，温育1-2小时；(3)洗涤后，收集检测重组小鼠碱性成纤维细胞生长因子的免疫胶乳微球。
7.权利要求1所述所述的检测重组小鼠碱性成纤维细胞生长因子的免疫胶乳微球的应用，其特征在于通过酶标仪，采用酶联免疫吸附测定法，检测mbFGF样品的bFGF。
全文摘要
本发明涉及一种检测重组小鼠碱性成纤维细胞生长因子的免疫胶乳微球及其制备方法和应用。免疫胶乳微球由抗mbFGF蛋白多克隆抗体包被，微球颗粒50nm；制备方法是，根据原核细胞表达的优先密码子重新修饰并构建全长mbFGF基因表达序列，将基因序列通过限制酶切割插入谷胱甘肽-S-转移酶基因融合表达载体中并进行细菌表达，利用亲合层析柱纯化和凝血酶在线切割获得mbFGF蛋白，再将佐剂溶合抗原后免疫家兔，经分离纯化得到抗mbFGF多克隆抗体，将抗体通过化学偶联法偶联活化后的微球，得到检测mbFGF蛋白的免疫胶乳微球。应用是，通过酶联免疫吸附测定法，检测mbFGF蛋白样品，最低检测限为mbFGF蛋白60pg/ml，相关系数R2＝0.96；本发明检测灵敏度高、操作简单、重复性强。
文档编号C07K14/50GK102432685SQ20111033954
公开日2012年5月2日 申请日期2011年11月1日 优先权日2011年11月1日
发明者关潇, 吴刚, 李俊生, 潘卫东, 肖能文, 赵彩云, 陈法军 申请人:中国环境科学研究院