鉴定猪优良肉质基因和/或营养活性物质的方法

专利名称：鉴定猪优良肉质基因和/或营养活性物质的方法
技术领域：
本发明涉及一种鉴定影响猪肉质性状的营养活性物质或/和猪肉质调控基因的方法及组合物，特别涉及一种鉴定影响猪肉质性状的营养活性物质或/和调控猪优良肉质的基因的方法，及其由特异组合的细胞模型和肉质关键调控基因的引物对组成的组合物。
背景技术：
发展优质高产的养猪业是提高人民生活水平、增强我国猪肉产品在国际市场的竞争力和确保养猪业可持续发展的关键。过去30多年来随着科学技术的发展，我国猪肉供应 基本解决了吃肉难的问题。随着人民生活水平的提高，消费者对猪肉风味品质、营养和安全的要求越来越高，养猪业面临着从量变向质变转化的过程。然而，由于养殖业长期以来的努力目标为“高产”，特别是近年来主要以引进洋种猪、规模化饲料养殖为方式的猪肉产量高增长模式，导致了目前国内主要供应猪肉品种品质的显著下降。表现为猪肉主要品质指标明显降低，风味、口感和营养水平下降，不仅引起广大人民的生活质量下降，而且造成了巨大的经济损失。据统计，北京市场上洋种养殖猪肉价格仅为10-15元/500克，而肉质优良的土种猪北京黑猪的价格在25-35元/500克。此外，肉品质低也严重影响了国产猪肉的进出口贸易。因此，提高猪肉品质，成为满足人民日益增长的对优质猪肉的需求、增强我国猪肉产品在国际市场的竞争力和确保养猪业可持续发展的关键。经过我们的前期研究发现，猪肉的品质性状虽然包括通过很多指标，包括嫩度、肉色、风味、系水力和口感等，但从分子营养学和细胞生物学的角度来看，猪肉的品质主要由肌纤维的发育和肌内脂肪的沉积来决定。在猪的生长和肥育过程中，如果体内脂肪主要沉积到骨骼肌部位的细胞间或细胞内，将形成“大理石纹”或“雪花肉”，明显提高肉的品质；而如果脂肪沉积形成的皮下脂肪、内脏脂肪和腹脂是养猪生产中不想要的“废弃脂肪”。如何在不增加“废弃脂肪”沉积的同时(瘦肉型猪的“废弃脂肪”已很少)增加肌内脂肪是改善肉品质的理论和技术瓶颈。研究发现，不同部位脂肪沉积和肉质发育生理进程的差异收到内因(基因)和外因(营养)的综合作用和调控。已经报道的能够对体内脂肪沉积和肉质发育发挥调控的功能性基因包括FABP4 (脂肪酸结合蛋白)、LIPINl等，而较为公认的营养物质为甜菜碱等。然而，运用传统方法发现的这些基因和/或饲料添加剂，具有研究周期长、需要大规模动物实验反复验证、不能揭示作用机理和不能发掘综合性效应等缺点，已经不能满足当前猪肉肉质改良的要求。近年来，随着基因组测序计划的完成和芯片技术的发展，使用猪的Affymetrix(美国Affymetrix公司)寡核苷酸芯片，对不同肉质种猪进行高通量基因筛选的研究为肉质改良提供了新思路。然而，基于芯片技术的方法存在以下缺点(1)筛选结果多为海量数据，分析困难，无法进行应用推广；(2)其中存在大量假阳性基因，不能对调控肉质的关键基因进行鉴定；(3)不适用与研究调控猪优良肉质的营养活性物质(含饲料添加剂等)。因此，迫切的需要开发一种新型技术，可用于对芯片筛选方法获得的能够对猪的肉质发育发挥重要作用的功能性基因的鉴定方法，以及适用于对传统方法和多种猪的营养活性物质(含饲料添加剂等)对肉质影响作用进行筛选和鉴定的方法。该技术的创建，将为解决猪的肉质改良问题提供终极对策。

发明内容
本发明的目的是提供一种鉴定能够调控猪肉质的营养活性物质或/和功能基因的方法及组合物。本发明所提供的用于鉴定或辅助鉴定猪营养活性物质或/和猪肉质基因的组合物由3T3-L1细胞、C2C12细胞、特异于AMPK-α基因的引物对1，以及特异于PGC-I α基因的引物对2组成；所述特异于AMPK- α基因的引物对I由序列表中序列I和序列2所示的两条单链DNA组成；所述特异于PGC-I α基因的引物对2由序列表中序列3和序列4所不的两条单链DNA组成。
所述AMPK-α基因的GENBANK登陆号为ΝΜ_001013367. 3 ;所述PGC-I α基因的GENBANK登陆号为ΝΜ_008904. 2。序列I由18个核苷酸组成；序列2由18个核苷酸组成；序列3由18个核苷酸组成；序列4由18个核苷酸组成。含有上述组合物的试剂盒也属于本发明的保护范围。上述组合物的制备方法也属于本发明的保护范围。所述组合物的制备方法包括将上述组合物中各细胞分别单独包装，以及将各引物对的所述两条单链DNA分别单独包装的步骤。上述试剂盒的制备方法也属于本发明的保护范围。所述试剂盒的制备方法包括如下步骤将所述组合物中各细胞分别单独包装，以及将所述组合物中各引物对的所述两条单链DNA分别单独包装后，与下述物质中的至少一种包装在同一试剂盒内=PCR反应缓冲液、DNA聚合酶和4种dNTP。本发明所提供的用上述组合物鉴定或辅助鉴定待测物质是否为猪肉质改良的营养活性物质的方法，包括如下步骤将所述待测物质分别与C2C12细胞和经“IBMX+胰岛素+地塞米松”三联诱导的3T3-L1细胞共同孵育，检测所述待测物质是否抑制所述经“IBMX+胰岛素+地塞米松”三联诱导的3T3-L1细胞的成脂分化，检测所述待测物质是否促进所述C2C12细胞的成肌分化；若所述待测物质同时满足如下a)和b)对条件，则所述待测物质为猪肉质改良的营养活性物质或候选为猪肉质改良的营养活性物质，若所述待测物质不同时满足如下a)和b)对条件，则所述待测物质不为猪肉质改良的营养活性物质a)所述待测物质抑制所述经“IBMX+胰岛素+地塞米松”三联诱导的3T3-L1细胞的成脂分化；b)所述待测物质促进所述C2C12细胞的成肌分化。所述“IBMX+胰岛素+地塞米松”三联诱导的方法包括如下步骤先用含有IBMX、胰岛素和地塞米松的溶液I与待诱导细胞孵育2-4d，再用含有胰岛素但不含IBMX和地塞米松的溶液2与所述细胞孵育2-3d ;所述溶液I中所述IBMX的终浓度为5 μ Μ，所述溶液I中所述胰岛素的终浓度为O. I μ g/mL,所述溶液I中所述地塞米松的终浓度为I μ M ;所述溶液2中所述胰岛素的终浓度为O. I μ g/mL所述方法还包括如下步骤将所述待测物质分别与所述C2C12细胞和所述经“IBMX+胰岛素+地塞米松”三联诱导的3T3-L1细胞共同孵育后，利用所述引物对I检测所述3T3-L1细胞与所述待测物质孵育后AMPK- α基因相对于所述经“ IBMX+胰岛素+地塞米松”三联诱导的3T3-L1细胞的表达量变化，利用所述引物对2检测所述C2C12细胞与所述待测物质孵育后PGC-I α基因相对于所述C2C12细胞的表达量变化；若所述待测物质同时满足所述a)和b)的条件，以及如下c)和d)的条件，则所述待测物质可以确证为猪肉质改良的营养活性物质，若所述待测物质满足所述a)和b)的条件，但不满足如下c)和d)的条件，则所述待测物质可以候选为猪肉质改良的营养活性物质c)和所述经“IBMX+胰岛素+地塞米松”三联诱导下3T3-L1细胞(阳性对照组)相t匕，与所述待测物质孵育后所述3T3-L1细胞中所述AMPK-α基因的表达量降低； d)和所述C2C12细胞组(阴性对照组)比，与所述待测物质孵育后所述C2C12细胞中所述PGC-Ia基因的表达量提高。本发明所提供的用上述组合物鉴定或辅助鉴定待测基因是否为猪优良肉质基因的方法，包括如下步骤(I)将所述待测基因分别导入3T3-L1细胞和C2C12细胞使其表达；(2)对所述3T3-L1细胞进行“IBMX+胰岛素+地塞米松”三联诱导，所述C2C12细胞不做处理；(3)检测所述待测基因是否抑制所述3T3-L1细胞在“IBMX+胰岛素+地塞米松”三联诱导下的成脂分化，检测所述待测基因是否促进所述C2C12细胞的成肌分化；(4)按照如下方法确定所述待测基因是否为猪优良肉质基因若所述待测基因同时满足如下a)和b)的条件，则所述待测基因为猪优良肉质基因或候选为猪优良肉质基因，若所述待测基因不同时满足如下a)和b)的条件，则所述待测基因不为猪优良肉质基因a)所述待测基因抑制所述3T3-L1细胞在所述“ IBMX+胰岛素+地塞米松”三联诱导下的成脂分化；b)所述待测基因促进所述C2C12细胞的成肌分化。所述“IBMX+胰岛素+地塞米松”三联诱导的方法包括如下步骤先用含有IBMX、胰岛素和地塞米松的溶液I与待诱导细胞孵育2-4d，再用含有胰岛素但不含IBMX和地塞米松的溶液2与所述细胞孵育2-3d ;所述溶液I中所述IBMX的终浓度为5 μ Μ，所述溶液I中所述胰岛素的终浓度为O. I μ g/mL,所述溶液I中所述地塞米松的终浓度为I μ M ;所述溶液2中所述胰岛素的终浓度为O. I μ g/mL。所述方法还包括如下步骤在上述方法的步骤(2)之后，同时利用所述引物对I检测所述3T3-L1细胞中导入所述待测基因后AMPK-α基因相对于导入空质粒组的表达量变化，利用所述引物对2检测所述C2C12细胞中导入所述待测基因后PGC-I α基因相对于导入空质粒组的表达量变化；若所述待测基因同时满足所述a)和b)的条件，以及如下c)和d)的条件，则所述待测基因可以确证为猪优良肉质基因，若所述待测基因满足所述a)和b)的条件，但不满足如下c)和d)的条件，则所述待测基因可以候选为猪优良肉质基因c)和导入空质粒组相比，将所述待测基因导入所述3T3-L1细胞后所述ΑΜΡΚ-α基因的表达量降低；
d)和导入空质粒组相比，将所述待测基因导入所述C2C12细胞后所述PGC-I α基因的表达量提闻。在上述各方法中，所有步骤(I)中将所述待测基因分别导入3T3-L1细胞和C2C12细胞的方法，具体为通过重组表达载体将所述待测基因分别导入所述3T3-L1细胞和所述C2C12细胞。在本发明的一个实施例中，所述重组表达载体中启动所述待测基因转录的启动子具体为CMV启动子。更为具体的，所述重组表达载体为在真核表达质粒pcDNA3. I的CMV启动子下游正向插入所述待测基因得到的重组质粒。 在上述各方法中，所有将所述待测物质分别与3T3-L1细胞和C2C12细胞共同孵育的时间均可为24h-48h。在本发明的一个实施例中，具体为24h。在上述各方法中，所有所述检测所述待测物质(或所述待测基因)是否促进所述3T3-L1细胞的成脂分化的方法，均可包括如下(I)和(2)的步骤(I)对所述3T3-L1细胞先用油红O溶液(染脂肪)染色，再用苏木素(染细胞核)复染；(2)按照如下方法确定结果若所述3T3-L1细胞的细胞质中出现空泡，并且着红色(脂肪)，则判定所述待测物质(或所述待测基因)促进所述3T3-L1细胞的成脂分化；反之，则判定所述待测物质(或所述待测基因)不促进所述3T3-L1细胞的成脂分化。在上述各方法中，所有所述检测所述待测物质(或所述待测基因)是否促进所述C2C12细胞的成肌分化的方法，均可包括如下(I)和(2)的步骤(I)对所述C2C12细胞用吉姆萨溶液(染肌管)染色；(2)按照如下方法确定结果若所述C2C12细胞的形状变为长梭形，同时细胞质部分(肌管)被染成紫蓝色，则判定所述待测物质(或所述待测基因)促进所述C2C12细胞的成肌分化；反之，则判定所述待测物质(或所述待测基因)不促进所述C2C12细胞的成肌分化。在上述各方法中，所有所述利用所述引物对I检测所述3T3-L1细胞中导入所述待测基因前后ΑΜΡΚ-α基因的表达量变化的方法，以及所有所述利用所述引物对2检测所述C2C12细胞中导入所述待测基因前后PGC-Ια基因的表达量变化的方法，均具体为反转录PCR的方法，以18S rRNA作为内参。上述组合物，或试剂盒，或任一所述方法在如下任一中的应用也属于本发明的保护范围(a)研制能够改善猪肉质的饲料或饲料添加剂；(b)发掘能够改善猪肉质的基因；( c)培育肉质改善的猪品种。在实际应用中，可采用通过上述方法鉴定得到的猪营养活性物质作为改善猪肉质的饲料或饲料添加剂的原料。本发明开展了猪优良肉质的关键控制基因和营养调控模式的鉴定工作，与其他方法比，具有明显的技术优势体外无创、可以同时筛选和鉴定营养活性物质和/或优良肉质基因、成本低、推广性强等特点。本发明将有助于建立肌内脂肪高效沉积的优良肉质基因的核心猪群，同时引导规模化猪场和散养户采用促进肉质改良的饲料营养组分和饲喂模式，从而推动养猪业能够在短时间内，实现在高产的基础上，培育出高品质猪肉的“优质”目标。本发明对节约饲料成本，及我国地方猪种优良肉质基因资源的保护和开发具有重要作用。


图I为甜菜碱(营养活性物质)或DLKl (关键调控基因)诱导3T3-L1细胞成脂分化的油红O染色和苏木素复染结果。其中，A为阴性对照组(未经诱导的3T3-L1细胞);B为三联诱导阳性对照组 <为甜菜碱处理组山为空质粒pcDNA3. I组；E为质粒pcDNA3. I-DLKl组。(注C、D、E同时进行了三联诱导)。图2为甜菜碱(营养活性物质)或DLKl (关键调控基因)诱导C2C12细胞成肌分化的吉姆萨染色结果。其中，A为阴性对照组(未经诱导的C2C12 细胞)；B为马血清阳性对照组；C为甜菜碱处理组；D为空质粒pcDNA3. I组；E为质粒pcDNA3. I-DLKl组。图3为甜菜碱(营养活性物质)或DLKl (关键调控基因)诱导3T3-L1细胞成脂分化中ΑΜΡΚ-α或PGCl-α基因mRNA表达检测结果。其中，“对照组”为阴性对照组(未经诱导的3T3-L1细胞)；“三联诱导”为三联诱导阳性对照组；“P⑶B”为空质粒pcDNA3. I组；“DLK1”为质粒pcDNA3. I-DLKl组。(注甜菜碱、PCDB和DLKl均同时进行了三联诱导)图4为甜菜碱(营养活性物质)或DLKl (关键调控基因)诱导C2C12细胞成肌分化中ΑΜΡΚ-α或PGCl-α基因mRNA表达检测结果。其中，“对照组”为阴性对照组(未经诱导的3T3-L1细胞)；“马血清”为马血清诱导阳性对照组；“PCDB”为空质粒pcDNA3. I组；“DLK1”为质粒 pcDNA3. I-DLKl 组。
具体实施例方式下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。3T3-L1细胞(产品目录号为Prod#CL_173)和C2C12细胞(产品目录号为Prod#CRL-1772)购自美国ATCC公司。苏木素染色液以及脂肪分化试剂包括IBMX、胰岛素和地塞米松均购自Sigma公司。油红O和吉姆萨染料购自北京西美杰科技有限公司。DMEM/F-12不完全培养基(液体)购买自美国Hyclone公司，胎牛血清、马血清和胰酶购买自美国Gibco公司。甜菜碱购自力德士(北京)化学技术有限公司。实施例1、3T3-L1前纤维细胞成脂诱导分化细胞模型的建立I、试剂配制PBS 溶液称取 8. OOg NaCl、O. 20g KCl,3. 12g Na2HPO4 · 12H20 和 O. 20g KH2PO4 溶于800mL超纯水中，加超纯水定容至1L。以5. 6%的无菌NaHCO3调节pH值至7. 2，4°C贮存备用。4%多聚甲醛溶液称取4g多聚甲醛溶于80mL PBS溶液中，加入少量NaOH，加热；待完全溶解后定容至lOOmL。以HCl调节pH值至7. 2，4°C贮存备用。O. 5%油红O溶液称取O. 05g油红粉剂溶于IOmL异丙醇中，配成储存液。使用前将储存液6mL用蒸馏水稀释至10mL，配成使用液,过滤后使用。75%冷乙醇将750mL无水乙醇与250mL PBS混合均匀，并置于4°C 48h，至液体澄
清透明。分化试剂配制
IBMX 工作液(100 X，现用现配)11. 5mg ΙΒΜΧ+940 μ L ddH20+60 μ L lmol/LKOH,O. 22 μ m过滤除菌，终浓度为O. 5mmol/L ；胰岛素工作液(100X):lmg/mL HCl(O. 01mol/L HCl=O. 042mL浓HCl+50mLdd H2O),O. 22 μ m过滤除菌，终浓度为10 μ g/mL, _20°C贮存备用；地塞米松贮存液称取3. 925mg地塞米松溶入到ImL无水乙醇中，浓度为10mmol/L, _20°C贮存备用；工作液(1000 X ):用PBS稀释贮存液至终浓度为lmmol/L。2、细胞培养 将3T3-L1细胞接种到IOOmm培养皿内，培养液为含有10%胎牛血清的DMEM，置于370C，5%C02培养箱中培养。细胞长到80%汇合时传代，平均2 3d传代一次。取待传代细胞培养皿，轻弃培养液，预温PBS少许轻洗一遍，弃去PBS ;加少许0. 25%胰酶，置于培养箱约lmin，镜下观察细胞间隙扩大，细胞突起缩短；弃去消化液，加2 5mL新鲜培养液终止消化，轻轻吹打，待成单细胞悬液后转移至15mL尖底离心管，IOOOrpm 4°C离心5min，用ImL新鲜培养液重悬细胞，按一定比例接种至含有培养液的IOOmm培养皿中。3、3T3_L1前纤维细胞成脂诱导分化程序细胞接种密度为30%，当达到100%汇合时，继续培养2d，即接触抑制2d。经典“鸡尾酒”法诱导3d，即“ IBMX+胰岛素+地塞米松”三联诱导(步骤I中所述IBMX工作液和所述胰岛素工作液的加量均为培养液总体积的I/100 ;所述地塞米松工作液的加量为培养液总体积的1/1000 ;轻轻混匀后继续培养)。换液，胰岛素单独诱导2d (步骤I中所述胰岛素工作液的加量为培养液总体积的1/100 ;轻轻混匀后继续培养)，此时细胞贴壁不紧，易成片脱落，所以换液时动作要轻柔。此后，换入正常的含10%胎牛血清的高糖DMEM培养液培养，每2d换液。自诱导第6d (显微镜下观察开始出现又圆又亮的脂滴)后开始进行细胞染色，观察细胞的成脂诱导分化情况，并计算分化率。分化率=(油红着色细胞数/总细胞核数)X 100%4、油红染色步骤小心抽去6孔培养板内的培养液。每孔加入400 μ LPBS溶液，清洗生长中的细胞表面。小心抽去每孔里的PBS溶液。每孔加入400 μ L4%多聚甲醛溶液，覆盖整个细胞生长表面。室温下孵育lOmin。小心抽去多聚甲醛溶液。每孔加入400 μ L PBS溶液，清洗生长中的细胞表面。小心抽去PBS溶液，并重复操作一次。小心加入400 μ L75%冷乙醇，覆盖整个细胞生长表面，室温静置5min。小心抽去75%冷乙醇，重复此步骤一次。小心加入400 μ L0. 5%油红O溶液，覆盖整个细胞生长表面，室温下静置15分钟，可见部分细胞呈红色。小心抽去0. 5%油红O溶液，室温下加入400 μ LPBS溶液，并孵育2min。小心抽去PBS溶液。5、苏木素复染处理用PBS溶液清洗细胞生长表面数次，直至液体清亮，无明显红色。加入苏木素染色液，覆盖整个培养板，约lmin。小心抽去染液，并用PBS溶液清洗至液体清亮。6、显微镜下观察拍照使用Olympus细胞培养用显微镜(CK40型，Olympus公司，日本)，使用40倍物镜观察，选定代表性视野后，用彩色CCD进行拍照。结果如图I中B所示，部分3T3-L1细胞的细胞质中出现空泡，并且脂肪被油红O溶液染成红色，基本所有3T3-L1细胞的细胞核都被苏木素溶液染成了蓝色。另外，自诱导后第ClOd，可以达到80%或以上的分化率。实施例2、C2C12前肌肉细胞成肌诱导分化细胞模型的建立I、染液制备称取O. 5g吉姆萨粉和22ml甘油；取少量甘油与吉姆萨粉在研钵内充分混合，研磨至无颗粒；将剩余的甘油倒入研钵，于56°C保温2h ;加入33ml纯甲醇混匀，即为吉姆萨母液，将其保存于棕色试剂瓶内；取9份pH 6. 8-7. 3的PBS缓冲液和I份吉姆萨母液混合即得染色液。2、细胞培养将C2C12细胞按I X IO4细胞/cm2接种于6孔细胞培养板中，加入DMEM/F-12完全培养基(即DMEM/F-12不完全培养基中加入体积终浓度为10%的胎牛血清)，将细胞培养板放置于5%C02、37°C培养箱中培养，然后，每天换DMEM/F-12完全培养基一次。C2C12细胞在培养基中生长3飞d，待细胞8(Γ90%融合后，弃去DMEM/F-12完全培养基，加入细胞分化培养基(在液体DMEM/F-12不完全培养基中加入体积终浓度为2%的马血清)，每天换新鲜细胞分化培养基一次。自诱导第2-3d (C2C12细胞分化为肌管)后开始进行细胞染色，观察细胞的成肌诱导分化情况。3、贴壁细胞染色去除培养器皿内的培养液，用PBS溶液反复漂洗单层培养物2次；加入PBS溶液，再逐滴加入等体积甲醇，边加边混合，静置IOmin ;将50%体积的甲醇-PBS混合液丢弃，力口入新鲜的甲醇液浸泡固定细胞IOmin,然后用甲醇漂洗细胞I次；将瓶内细胞干燥后储存或直接染色；按2ml/cm2的比例滴加吉姆萨染液，覆盖细胞层，染色2min ;移除染液，用自来水冲洗掉粉红色背景后，再用去离子水冲洗细胞；用显微镜观察单层潮湿细胞。若细胞已干，可重新使细胞潮湿后再观察。结果如图2中B所示，C2C12细胞的形状变为长梭形，同时细胞质部分(肌管被染成紫蓝色。实施例3、脂肪和肌肉组织中脂质沉积的关键性基因的分子探针设计一般而言，北京黑猪的肌内脂肪沉积量约为3.0%_4.5%，约为瘦肉型猪的两倍。利用猪的Affymetrix寡核苷酸芯片(Porcine Genome Array,基因有限公司，产品目录号900623)，对北京黑猪和杜长大商品瘦肉型猪(北京超市里均有销售)的基因转录表达谱进行扫描，得到若干DNA片段备选。结合文献和本实验室前期研究结果，发现猪的肉品质决定是一个复杂的生理进程，主要涉及到的细胞生物学进程包括肌肉细胞的发生和脂质沉积、脂肪细胞的分化和脂质沉积等，但其中发挥主要调控作用的信号通路为PI3K和cGMP等。基于以上深入研究结果，对传统方法和芯片方法进行改进，本发明选定这两条关键信号通路的决定性基因 ΑΜΡΚ-α 和 PGCl-α (ΑΜΡΚ-α 基因的 GENBANK NM_001013367. 3 ；PGC-1 α 基因的GENBANK NM_008904. 2)，开发出组合分子引物探针，用于实时定量PCR检测方法检测收集的细胞标本中的AMPK- α和PGCI - α基因的mRNA表达水平。其中，特异于AMPK- α基因的引物序列为如下Al和Α2 ;特异于PGC-Ia基因的引物序列为如下Pl和Ρ2。Al和Α2扩增片段为138碱基；P1和P2扩增片段为158碱基。Al :5，-agttcctggagaaagatg-3，(序列 1，为 GENBANK NM_001013367. 3 的第 21-38位)A2:5，-tccggtcaactcgtgctt-3’(序列 2，为 GENBANK NM_001013367. 3 的第141-158位的反向互补序列)Pl :5，-catagagtgtgctgctct-3，(序列 3，为 GENBANK NM_008904. 2 的第 181-198位)P2 :5，-actggttggatatgattt-3，(序列 4，为 GENBANK NM_008904. 2 的第 321-338位的反向互补序列)实施例4、优良肉质影响因素鉴定模型和分子探针的实际应用举例一、用于鉴定猪营养活性物质或/和优良肉质基因的组合物本实施例中用于鉴定或辅助鉴定猪营养活性物质或/和优良肉质基因的组合物由实施例I中所述的3T3-L1细胞、实施例2中所述的C2C12细胞、以及实施例3中设计的特异于ΑΜΡΚ-α基因的引物对和特异于PGC-I α基因的引物对组成。二、鉴定或辅助鉴定待测物质是否为猪肉质改良的营养活性物质(一)操作方法及结果判断Α.操作方法具体如下I、参照实施例I的方法，用不同浓度的待测物质溶液与“ΙΒΜΧ+胰岛素+地塞米松”三联诱导成脂分化的3T3-L1细胞共孵育24h，其余步骤均与实施例I步骤相同。2、参照实施例2的方法，用不同浓度的待测物质替代细胞分化培养基中的“马血清”与C2C12细胞共孵育24h，进行成肌诱导分化，其余步骤均与实施例2步骤相同。
3、步骤I和步骤2细胞分化结束后，分别收集细胞，按照如下方法提取总RNA 为防止RNA降解，在液氮中将样品研磨至粉末，待液氮汽化后加入RNA提取试剂Trizol (每O. Ig样品加Iml Trizol )，室温放置5分钟，使组织和细胞充分裂解。12000转/分钟离心5分钟，弃沉淀。按每Iml Trizol加入200 μ I氯仿的比例加入氯仿，振荡混匀后室温静置15分钟。在4°C条件下12000转/分钟尚心15分钟,使油相与水相分尚，吸取上层水相(不要接触一点油相)至另一离心管中。按每Iml Trizol加入0.5ml异丙醇的比例加入异丙醇混匀，在室温下静置10分钟使RNA沉淀。在4°C条件下12000转/分钟离心10分钟，弃去上清液，只留沉于管底的RNA。按每Iml Trizol加入Iml乙醇的比例加入75%的乙醇，温和振荡离心管，使沉淀悬浮。在4°C条件下8000转/分钟离心5分钟后，在避免丢失RNA沉淀的前提下尽量多地弃去上清液，然后将沉淀干燥，得到样品RNA。4、mRNA反转录和荧光实时定量PCR :使用北京百泰克生物制品公司的2 X SYBRRT-PCR 试剂盒，按照使用说明书提示的操作方法，在冰上配置PCR反应液。主要组分为2 X Pr emi X IO μ I，上游引物(AI或PI)和下游引物(A2或P2 )各2 μ mo I，提取的总RNA模板O. lng，然后使用灭菌蒸馏水将总体积补充至20 μ I。使用BioTek荧光实时定量PCR仪，按照两步法进行RT-PCR反应程序。95°C起始模板变性2分钟，然后进行以下反应25个循环95°C模板变性15秒，65°C退火延伸40秒。根据实时定量PCR仪绘制的扩增曲线和溶解曲线，得出各个样品对应的mRNA含量的相对值。其中，以18S rRNA为内参对结果进行校正。每个实验重复三次，然后对结果进行统计分析。B.结果判断标准如下经步骤A中I和2的染色后，若所述待测物质同时满足如下a)和b)的条件，则初步判断所述待测物质为猪肉质改良的营养活性物质或候选为猪肉质改良的营养活性物质；接着进行步骤A中3和4的基因表达检测，若所述待测物质同时满足如下c)和d)的条件，则可以确定证实所述待测物质为猪肉质改良的营养活性物质；经步骤A中I和2的染色后，若所述待测物质不同时满足如下a)和b)的条件，则判断所述待测物质不为猪肉质改良的营养活性物质；经步骤A中I和2的染色后，若所述待测物质在满足如下a)和b)条件的前提下，进一步进行步骤A中3和4的基因表达检测，但不同时满足如下c)和d)的条件，则所述待测物质可以候选为猪肉质改良的营养活性物质。a)所述待测物质抑制经“IBMX+胰岛素+地塞米松”三联诱导的3T3-L1细胞的成脂分化；b)所述待测物质促进C2C12细胞的成肌分化；
c)和所述经“IBMX+胰岛素+地塞米松”三联诱导下3T3-L1细胞(阳性对照组)相t匕，与所述待测物质孵育后所述3T3-L1细胞中所述ΑΜΡΚ-α基因的表达量降低；d)和所述C2C12细胞(阴性对照组)比，与所述待测物质孵育后所述C2C12细胞中所述PGC-Ia基因的表达量提高。(二)实际应用甜菜碱是较为公认的猪营养活性物质，以下将以甜菜碱作为待测物质，验证步骤(一)所述方法的准确性。甜菜碱与3T3-L1细胞共孵育时的工作浓度梯度具体为4mmol/L ;甜菜碱与C2C12细胞共孵育时的工作浓度梯度具体为4mmol/L。其余操作步骤参见步骤(一)。同时，对于3T3-L1细胞的成脂诱导分化，以实施例I以三联诱导方法诱导的3T3-L1成脂分化细胞作为阳性对照；以未经诱导的3T3-L1细胞作为阴性对照。对于C2C12细胞的成肌诱导分化，以实施例2以马血清方法诱导的C2C12成肌分化细胞作为阳性对照；以未经诱导的C2C12细胞作为阴性对照。每组处理两个重复。诱导到时间后，其中一组执行实施例I中的油红O染色和苏木素复染(3T3-L1细胞成脂诱导分化)或实施例2中的吉姆萨染色(C2C12细胞成肌诱导分化)，然后在显微镜下采集代表性图片；另外一组收集诱导后的3T3-L1细胞或C2C12细胞，按照步骤(一)中方法对AMPK- α和PGCl- α基因mRNA表达进行检测，以阴性对照组AMPK- α或PGCl-α基因的表达量为I。3T3-L1细胞成脂诱导分化的油红O染色和苏木素复染结果如图I所示，与阳性对照组相比，甜菜碱处理组只有部分细胞被油红O着色，这表明甜菜碱相对于阳性对照组具有抑制前脂肪细胞成脂分化的作用。另外，AMPK-α或PGCl-α基因mRNA表达检测结果如图3所示，从图中可以看出，在三联诱导分化的3T3-L1细胞中，甜菜碱相对于阳性对照组，抑制AMPK-α基因的表达，而对PGCl-α基因的表达没有作用。C2C12细胞成肌诱导分化的吉姆萨染色结果如图2所示，与阳性对照组相类似，甜菜碱处理组细胞的形状变为长梭形，同时细胞质部分(肌管)被染成紫蓝色。这表明甜菜碱具有促进前成肌细胞成肌分化的作用。另外，ΑΜΡΚ-α或PGCl-a基因mRNA表达检测结果如图4所示，从图中可以看出，在分化的C2C12细胞中，甜菜碱促进PGCl-a基因的表达，而对AMPK-α基因的表达没有作用。结合以上两方面数据，可以看出一方面，甜菜碱可以通过激活成肌细胞中PGCl-a基因的表达，进而促进细胞的成肌分化；另一方面，甜菜碱可以通过抑制成脂细胞中ΑΜΡΚ-α基因的表达，进而抑制机体脂肪细胞的成脂分化。因此，甜菜碱具有促进动物肌内脂肪沉积的作用，因此可以鉴定甜菜碱为对猪的优良肉质具有调控作用的营养活性物质。三、鉴定或辅助鉴定待测基因是否为猪的优良肉质基因(一)操作方法及结果判断Α.操作方法具体如下I、参照实施例I的方法，用携带有待测基因的真核重组表达载体转染3T3-L1细胞(转染方法为使用BTX公司的ΒΤΧ-Τ820方波电转仪电转。具体操作为将3T3-L1细胞用无血清RPMI 1640细胞培养基稀释为调细胞密度为6-10 X 106/ml，取350 μ I/样品，加入IOyg质粒DNA混匀。电转条件为300V 5msο详细方法参照Ma X，et al. , CREBL2, interactingwith CREB，induces adipogenesis in 3T3-L1 adipocytes. Biochem J.2011 Oct I； 439 (I) :27-38),转染后培养24h，采用“IBMX+胰岛素+地塞米松”进行3T3-L1细胞的三联成脂诱导分化，其余步骤均与实施例I步骤相同。使用空质粒转染作为ΑΜΡΚ-α基因鉴定的阴性对照(记为P⑶B组)。2、参照实施例2的方法，用携带有待测基因的真核重组表达载体转染C2C12细胞(转染方法为使用BTX公司的ΒΤΧ-Τ820方波电转仪电转。具体操作为将C2C12细胞稀释为2 X IO6细胞/350 μ I不完全培养基，加入10 μ g质粒DNA混匀。电转条件为120V 20ms),转染后培养2-3d，观察C2C12细胞的成肌诱导分化，其余步骤均与实施例2步骤相同。使用空质粒转染作为PGC-I α基因鉴定的阴性对照(记为P⑶B组)。3、步骤I和步骤2细胞分化结束后，分别收集细胞，按照如下方法提取总RNA :为防止RNA降解，在液氮中将样品研磨至粉末，待液氮汽化后加入RNA提取试剂Trizol (每
O.Ig样品加Iml Trizol )，室温放置5分钟，使组织和细胞充分裂解。12000转/分钟离心5分钟，弃沉淀。按每Iml Trizol加入200 μ I氯仿的比例加入氯仿，振荡混匀后室温静置15分钟。在4°C条件下12000转/分钟尚心15分钟,使油相与水相分尚，吸取上层水相(不要接触一点油相)至另一离心管中。按每Iml Trizol加入O. 5ml异丙醇的比例加入异丙醇混匀，在室温下静置10分钟使RNA沉淀。在4°C条件下12000转/分钟离心10分钟，弃去上清液，只留沉于管底的RNA。按每Iml Trizol加入Iml乙醇的比例加入75%的乙醇，温和振荡离心管，使沉淀悬浮。在4°C条件下8000转/分钟离心5分钟后，在避免丢失RNA沉淀的前提下尽量多地弃去上清液，然后将沉淀干燥，得到样品RNA。4、mRNA反转录和荧光实时定量PCR :使用北京百泰克生物制品公司的2 X SYBRRT-PCR 试剂盒，按照使用说明书提示的操作方法，在冰上配置PCR反应液。主要组分为2 X Pr emi X IO μ I，上游引物(AI或PI)和下游引物(A2或P2 )各2 μ mo I，提取的总RNA模板
O.lng，然后使用灭菌蒸馏水将总体积补充至20 μ I。使用BioTek荧光实时定量PCR仪，按照两步法进行RT-PCR反应程序。95°C起始模板变性2分钟，然后进行以下反应25个循环95°C模板变性15秒，65°C退火延伸40秒。根据实时定量PCR仪绘制的扩增曲线和溶解曲线，得出各个样品对应的mRNA含量的相对值。其中，以18S rRNA为内参对结果进行校正。每个实验重复三次，然后对结果进行统计分析。B.结果判断标准如下经步骤A中I和2的染色后，若所述待测基因同时满足如下a)和b)的条件，则初步判断所述待测基因为猪优良肉质基因或候选为猪优良肉质基因；接着进行步骤A中3和4的基因表达检测，若所述待测基因同时满足如下c)和d)的条件，则可以确定证实所述待测基因为猪优良肉质基因。经步骤A中I和2的染色后，若所述待测基因不同时满足如下a)和b)的条件，则判断所述待测基因不为猪优良肉质基因；经步骤A中I和2的染色后，若所述待测基因在满足如下a)和b)条件的前提下，进一步进行步骤A中3和4的基因表达检测，但不同时满足如下c)和d)的条件，则判断所述待测基因可以候选为猪优良肉质基因。a)所述待测基因抑制所述3T3-L1细胞在所述“ IBMX+胰岛素+地塞米松”三联诱导下的成脂分化；b)所述待测基因促进所述C2C12细胞的成肌分化。
c)和导入空质粒组(P⑶B组)相比，将所述待测基因导入所述3T3-L1细胞后所述ΑΜΡΚ-α基因的表达量降低；d)和导入空质粒组(P⑶B组)相比，将所述待测基因导入所述C2C12细胞后所述PGC-I α基因的表达量提高。(二)实际应用DLKl 基因(pref-1 gene)是公认的猪优良肉质基因(Smas CM, KachinskasD, Liu CM,Xie X,Dircks LK, Sul HS. Transcriptional control of thepref-1 gene in 3T3-Lladipocyte differentiation. Sequence requirementfor differentiation-dependent suppression.J Biol Chem.1998 Nov27; 273 (48) :31751-8.)，以下将以DLKl基因作为待测基因，验证步骤(一)所述方法的准确性。携带有DLKl基因的真核重组表达载体具体为pcDNA3. I-DLKl (质粒构建过程详见Yin D, Xie D, Sakajiri S，Miller Cff, Zhu H, Popoviciu ML, Said JW, Black KL, KoefflerHP. DLKl: increased expression in gliomas and associated with oncogenicactivities. Oncogene. 2006 Mar 23; 25 (13) : 1852-61.)。在重组表达载体 pcDNA3. 1-DLK1中启动所述待测基因DLKl基因转录的启动子具体为CMV启动子。基本电转步骤为用胰酶+EDTA消化细胞，无血清RPMI 1640细胞培养基洗细胞3遍，调细胞密度为6-10 X106/ml，取350 μ I/样品。真核重组表达载体pcDNA3. I-DLKl的用量为10 μ g，采用2mm电转杯，3T3-L1细胞的转染条件为300v，5ms ；C2C12细胞的转染条件为120v，20ms。电击后，室温静置5_10分钟，重铺细胞于10%胎牛血清的RMPI 1640培养基中。其余操作步骤参见步骤(一)。同时，对于3T3-L1细胞的成脂诱导分化，以实施例I以三联诱导方法诱导的3T3-L1成脂分化细胞作为阳性对照；以未经诱导的3T3-L1细胞作为阴性对照。对于C2C12细胞的成肌诱导分化，以实施例2以马血清方法诱导的C2C12成肌分化细胞作为阳性对照；以未经诱导的C2C12细胞作为阴性对照。每组处理两个重复。诱导到时间后，其中一组执行实施例I中的油红O染色和苏木素复染(3T3-L1细胞成脂诱导分化)或实施例2中的吉姆萨染色(C2C12细胞成肌诱导分化)，然后在显微镜下采集代表性图片；另外一组收集诱导后的3T3-L1细胞或C2C12细胞，按照步骤(一)中方法对ΑΜΡΚ-α和PGCl-α基因mRNA表达进行检测，以阴性对照组AMPK-α或PGCl_a基因的表达量为I。
3T3-L1细胞成脂诱导分化的油红O染色和苏木素复染结果如图I所示，与阳性对照组相比，转入真核重组表达载体pcDNA3. I-DLKl的细胞被油红O着色比例明显降低，这表明DLKl基因相对于阳性对照组，具有抑制前脂肪细胞成脂分化的作用。另外，ΑΜΡΚ-α或PGCl-α基因mRNA表达检测结果如图3所示，从图中可以看出，在分化的3T3-L1细胞中，DLKl基因相对于阳性对照组，抑制ΑΜΡΚ-α基因的表达，而对PGCl-α基因的表达没有作用。C2C12细胞成肌诱导分化的吉姆萨染色结果如图2所示，与阳性对照组相类似，转入真核重组表达载体DLKl的C2C12细胞的形状变为长梭形，同时细胞质部分(肌管)被染成紫蓝色。这表明DLKl基因具有促进前成肌细胞成肌分化的作用。另外，ΑΜΡΚ-α或PGCl-a基因mRNA表达检测结果如图4所示，从图中可以看出，在分化的C 2C12细胞中，DLKI基因促进PGCl-α基因的表达，而对AMPK-α基因的表达没有作用。结合以上两方面数据，可以看出一方面，DLKl基因可以通过激活成肌细胞中PGCl-α基因的表达，进而促进细胞的成肌分化；另一方面，DLKl基因可以通过抑制成脂细胞中AMPK-α基因的表达，进而抑制机体脂肪细胞的成脂分化。因此，DLKl基因具有促进动物肌内脂肪沉积的作用，因此可以鉴定DLKl基因为对猪的优良肉质具有调控作用的基因。
权利要求
1.用于鉴定或辅助鉴定猪营养活性物质或/和猪肉质基因的组合物，其特征在于所述组合物由3T3-L1细胞、C2C12细胞、特异于AMPK-a基因的引物对1，以及特异于PGC-I a基因的引物对2组成； 所述特异于AMPK-a基因的引物对I由序列表中序列I和序列2所不的两条单链DNA组成；所述特异于PGC-I a基因的引物对2由序列表中序列3和序列4所示的两条单链DNA组成。
2.含有权利要求I所述组合物的试剂盒。
3.权利要求I所述组合物的制备方法，其特征在于所述制备方法包括将权利要求I所述组合物中各细胞分别单独包装，以及将各引物对的所述两条单链DNA分别单独包装的步骤。
4.权利要求3所述试剂盒的制备方法，包括如下步骤将权利要求I所述组合物中各细胞分别单独包装，以及将所述组合物中各引物对的所述两条单链DNA分别单独包装后，与下述物质中的至少一种包装在同一试剂盒内=PCR反应缓冲液、DNA聚合酶和4种dNTP。
5.用权利要求I所述组合物鉴定或辅助鉴定待测物质是否为猪肉质改良的营养活性物质的方法，包括如下步骤将所述待测物质分别与C2C12细胞和经“ IBMX+胰岛素+地塞米松”三联诱导的3T3-L1细胞共同孵育，检测所述待测物质是否抑制所述经“IBMX+胰岛素+地塞米松”三联诱导的3T3-L1细胞的成脂分化，检测所述待测物质是否促进所述C2C12细胞的成肌分化；若所述待测物质同时满足如下a)和b)对条件，则所述待测物质为猪肉质改良的营养活性物质或候选为猪肉质改良的营养活性物质，若所述待测物质不同时满足如下a)和b)对条件，则所述待测物质不为猪肉质改良的营养活性物质 a)所述待测物质抑制所述经“IBMX+胰岛素+地塞米松”三联诱导的3T3-L1细胞的成脂分化； b)所述待测物质促进所述C2C12细胞的成肌分化。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于所述方法还包括如下步骤将所述待测物质分别与所述C2C12细胞和所述经“IBMX+胰岛素+地塞米松”三联诱导的3T3-L1细胞共同孵育后，利用所述引物对I检测所述3T3-L1细胞与所述待测物质孵育后AMPK-a基因相对于所述经“IBMX+胰岛素+地塞米松”三联诱导的3T3-L1细胞的表达量变化，利用所述引物对2检测所述C2C12细胞与所述待测物质孵育后PGC-I a基因相对于所述C2C12细胞的表达量变化；若所述待测物质同时满足所述a)和b)的条件，以及如下c)和d)的条件，则所述待测物质为猪肉质改良的营养活性物质，若所述待测物质满足所述a)和b)的条件，但不满足如下c)和d)的条件，则所述待测物质候选为猪肉质改良的营养活性物质 c)和所述经“IBMX+胰岛素+地塞米松”三联诱导下3T3-L1细胞相比，与所述待测物质孵育后所述3T3-L1细胞中所述AMPK-a基因的表达量降低； d)和所述C2C12细胞比，与所述待测物质孵育后所述C2C12细胞中所述PGC-Ia基因的表达量提闻。
7.用权利要求I所述组合物鉴定或辅助鉴定待测基因是否为猪优良肉质基因的方法，包括如下步骤 (1)将所述待测基因分别导入3T3-L1细胞和C2C12细胞使其表达； (2)对所述3T3-L1细胞进行“IBMX+胰岛素+地塞米松”三联诱导；(3)检测所述待测基因是否抑制所述3T3-L1细胞在“IBMX+胰岛素+地塞米松”三联诱导下的成脂分化，检测所述待测基因是否促进所述C2C12细胞的成肌分化； (4)按照如下方法确定所述待测基因是否为猪优良肉质基因若所述待测基因同时满足如下a)和b)的条件，则所述待测基因为猪优良肉质基因或候选为猪优良肉质基因，若所述待测基因不同时满足如下a)和b)的条件，则所述待测基因不为猪优良肉质基因 a)所述待测基因抑制所述3T3-L1细胞在所述“IBMX+胰岛素+地塞米松”三联诱导下的成脂分化； b)所述待测基因促进所述C2C12细胞的成肌分化。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于所述方法还包括如下步骤在权利要求7步骤(2)之后，同时利用所述引物对I检测所述3T3-L1细胞中导入所述待测基因后AMPK- a基因相对于导入空质粒组的表达量变化，利用所述引物对2检测所述C2C12细胞中导入所述待测基因后PGC-I a基因相对于导入空质粒组的表达量变化；若所述待测基因同时满足所述a)和b)的条件，以及如下c)和d)的条件，则所述待测基因为猪优良肉质基因，若所述待测基因满足所述a)和b)的条件，但不满足如下c)和d)的条件，则所述待测基因候选为猪优良肉质基因 c)和导入空质粒组相比，将所述待测基因导入所述3T3-L1细胞后所述AMPK-a基因的表达量降低； d)和导入空质粒组相比，将所述待测基因导入所述C2C12细胞后所述PGC-Ia基因的表达量提高。
9.根据权利要求5-8中任一所述的方法，其特征在于将所述待测基因分别导入所述3T3-L1细胞和所述C2C12细胞的方法，为通过重组表达载体电转将所述待测基因分别导入所述3T3-L1细胞和所述C2C12细胞； 所述将所述待测物质分别与3T3-L1细胞和C2C12细胞共同孵育的时间为24_48h。
10.权利要求I所述组合物，或权利要求2所述试剂盒，或权利要求5-9中任一所述的方法在如下任一中的应用 (a)研制能够改善猪肉质的饲料或饲料添加剂； (b)发掘能够改善猪肉质的基因； (c)培育肉质改善的猪品种。
全文摘要
本发明公开了一种鉴定影响猪肉质性状的营养活性物质或/和猪肉质调控基因的方法及组合物。本发明所提供的组合物由3T3-L1细胞、C2C12细胞、特异于AMPK-α基因的引物对，以及特异于PGC-1α基因的引物对组成；所述特异于AMPK-α基因的引物对和所述特异于PGC-1α基因的引物对分别由序列1和序列2、序列3和序列4所示的两条单链DNA组成。本发明有助于建立肌内脂肪高效沉积、而腹部和皮下等部位脂肪显著降低的优良肉质基因的核心猪群，引导规模化猪场和散养户采用促进肉质改良的饲料营养组分、配方和饲喂模式，推动养猪业在短时间内，实现在高产基础上，培育出高品质猪肉的“优质”目标。本发明对节约饲料成本，及我国地方猪种优良肉质基因资源的保护和开发具有重要作用。
文档编号C12Q1/02GK102776280SQ201210194859
公开日2012年11月14日 申请日期2012年6月13日 优先权日2012年6月13日
发明者刘玫, 刘璐, 张倩, 李德发, 胡声迪, 马曦 申请人:中国农业大学