TMCO3基因在制备检测Fuchs角膜内皮营养不良制品中的应用的制作方法
【专利摘要】本发明的目的是提供一种TMCO3基因在制备检测Fuchs角膜内皮营养不良诊断制品中的应用，本发明提供了TMCO3基因的新的用途，从而提供了一种有效的进行先天性Fuchs角膜内皮营养不良疾病基因诊断、产前基因筛查及遗传咨询的途径，应用效果表明本发明所提供的基因的SNP位点及检测引物可以有效的用于临床患者及胎儿绒毛或羊水进行TMCO3基因突变位点的快速检测。
【专利说明】TMC03基因在制备检测Fuchs角膜内皮营养不良制品中的 应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于基因诊断制品【技术领域】，具体涉及一种跨膜与卷曲螺旋域3(TMC03) 在制备检测Fuchs角膜内皮营养不良（滴状角膜）基因诊断制品中的应用。
[0002] 发明背景
[0003] Fuchs角膜内皮营养不良又叫滴状角膜，Fuchs于1910年首先描述这一临床现象， 随后认识到它与原发性角膜内皮营养不良有关，角膜上皮和基质的改变为继发的。本病有 一定的遗传性，遗传方式尚不十分清楚，有些病例已证实为常染色体显性遗传。病因不明， 可能是多方面的一些尚未被认识到的因素干扰了角膜内皮细胞的结构与功能，最终导致了 内皮泵功能的失代偿。
[0004] Fuchs内皮营养不良开始表现为角膜滴状变性，最后导致角膜基质层及上皮层水 肿、混浊。上皮下出现水泡，形成所谓大泡性角膜病变。当水泡破裂后，出现眼疼、怕光、流 泪、异物感等症状，视力明显减退或丧失。组织学检查，可发现后弹力层变肥厚，内皮细胞变 薄，并伴有色素沉着。据统计显示，中国人的患病率约为0.7%，欧洲国家统计显示，在全部 角膜移植手术中，约10%系Fuchs角膜内皮营养不良，术后约80%移植片2年内保持清亮 但移植片长期存活率低。即使手术时机选择适当，移植片亦仅能在有限期间内保持清亮。由 于缺乏对本病的认识，在行眼内手术，如白内障摘除术，手术之前未行角膜内皮检查，术中 损伤角膜内皮细胞导致角膜水肿，丧失视力。
[0005] Fuchs角膜内皮营养不良的病因病理尚不清楚，目前世界上研究较少。国内外 的遗传学研究结果表明该病为常染色体显性遗传，也有散发病例的报道。迄今为止，科学 家们已经定位了 8个Fuchs角膜内皮营养不良疾病基因的位点：20ρ13,9ρ24. 1-ρ22. 1， 5q33.I_q35. 2,IOplL22,18q21. 2_q21. 3,13pter_ql2. 13,15q25. 3,1ρ34· 3。
[0006] 到目前为止对Fuchs角膜内皮营养不良的致病基因的了解仍然有限，迄今为止的 已知基因仅能解释一小部分的患者的发病。这已经成为Fuchs角膜内皮营养不良的发病机 制的研究以及针对病因的诊断和治疗研究的瓶颈。这种现状促使进一步去发现和了解该病 新的致病基因，为后续的基因诊断、广如诊断及基因治疗提供基础。
【发明内容】
[0007] 本发明的目的是提供一种TMC03基因在制备检测Fuchs角膜内皮营养不良诊断制 品中的应用，从而弥补现有技术的不足。
[0008] 申请人:从一个4代呈常染色体显性遗传的Fuchs角膜内皮营养不良家系中，对该 家系全部成员进行了全基因组连锁分析，寻找可能的连锁区域；同时，进一步对该家系的核 心成员进行了外显子组测序，结合连锁分析的结果，找到了该家系的致病基因跨膜与卷曲 螺旋域3 (TMC03)存在遗传上的致病突变，从而促成了本发明。
[0009] 本发明首先提供TMC03基因新的用途，是在制备用于检测Fuchs角膜内皮营养不 良诊断制品中的应用；
[0010] 上述的诊断制品，作为实施例的优选，是检测Fuchs角膜内皮营养不良的引物或 探针。
[0011] 上述的引物对，其引物信息如下：
[0012] TMC03-E1F：TCTGCGAGGGCCTTGGCTSEQIDNO: 1
[0013]TMC03-E1R：CCAGGGAGGGAGGGAAGGASEQIDNO:2
[0014]TMC03-E2F：CCCTTCACAAAGCACCATACAASEQIDNO:3
[0015]TMC03-E2R：CGTGTGGGCTGTCTCTAGGATSEQIDNO:4
[0016]TMC03-E3F：ACATATGAACAGGGACATTTSEQIDNO:5
[0017]TMC03-E3R：TACACGTGAACAATTTCAACSEQIDNO:6
[0018]TMC03-E4F：GCAGAAATCCTAAACCTATCSEQIDNO:7
[0019]TMC03-E4R：AAGATAAAGCTCGGTCATASEQIDNO:8
[0020]TMC03-E5F：CCCAGAATACACTCTTCATSEQIDNO:9
[0021] TMC03-E5R：GTTTATACGAAGCTGGTATCSEQIDNO: 10
[0022]TMC03-E6F：TCGAAGTACACTGTGTGATSEQIDNO: 11
[0023]TMC03-E6R：AACATCAAACCGAAATATCSEQIDNO: 12
[0024]TMC03-E7F：GTGAGGATTCACCATGTTSEQIDNO: 13
[0025]TMC03-E7R：TGGTTAGGAAAGTCCTAAGASEQIDNO: 14
[0026]TMC03-E8F：GTTGTCGTAGACCTGTCTTSEQIDNO: 15
[0027]TMC03-E8R：ACAGGACTGAGGAACTGTSEQIDNO: 16
[0028]TMC03-E9F：GCTCAACACAACTTAATTTCSEQIDNO: 17
[0029]TMC03-E9R：TTGATGGGTAGTATAAGAAAGSEQIDNO: 18
[0030]TMC03-E10F：CTAATAGCAGCCTCCACATSEQIDNO: 19
[0031]TMC03-E10R：GCTGGACAGAAGAAACAGTASEQIDNO:20
[0032]TMC03-E11F：TTCCTGTATTGAAGCAAGTSEQIDNO:21
[0033]TMC03-E11R：GCTCAATTCTGAAACAATCSEQIDNO:22
[0034]TMC03-E12F：TTTGCCTTATTGTTCAGTGSEQIDNO:23
[0035]TMC03-E12R：CTAACTGCAACTTTCCTCTGSEQIDNO:24
[0036]TMC03-E13-IF：GTGCTAGTCCTGACAGTCTCSEQIDNO:25
[0037]TMC03-E13-1R：AAACATAGGCTTTAAGAATCAASEQIDNO:26
[0038]TMC03-E13-2F：TGTGAGTTCATCAGTTCATAGTSEQIDNO:27
[0039]TMC03-E13-2R：TTTGGTGTCTTGGAGAATAGSEQIDNO:28
[0040] 本发明还提供一种用于检测Fuchs角膜内皮营养不良的试剂盒，包含有上述的引 物对中的任一种或几种。
[0041] 本发明还提供一种与Fuchs角膜内皮营养不良疾病相关的SNP位点，为TMC03基 因编码区域由起始密码子起第41位，其碱基为C或T。
[0042] 其中用于检测上述SNP位点的引物信息如下：
[0043]TMC03-E2F：CCCTTCACAAAGCACCATACAASEQIDNO:3
[0044]TMC03-E2R:CGTGTGGGCTGTCTCTAGGATSEQIDN0:4。
[0045] 本发明还提供另外一种与Fuchs角膜内皮营养不良疾病相关的SNP位点为TMC03 基因编码区域由起始密码子起上游第129位，其碱基为G或A。
[0046] 其中用于检测上述SNP位点的引物信息如下：
[0047]TMC03-E1F：TCTGCGAGGGCCTTGGCTSEQIDN0:1
[0048]TMC03-E1R:CCAGGGAGGGAGGGAAGGASEQIDN0:2。
[0049] 本发明还提供第三种与Fuchs角膜内皮营养不良疾病相关的SNP位点为TMC03基 因编码区域由终止密码子起下游第268位，其碱基为G或A。
[0050] 其中用于检测上述SNP位点的引物信息如下：
[0051]TMC03-E13-2F：TGTGAGTTCATCAGTTCATAGTSEQIDNO:27
[0052]TMC03-E13-2R：TTTGGTGTCTTGGAGAATAGSEQIDNO:28。
[0053] 本发明提供了TMC03基因的新的用途，从而提供了一种有效的进行Fuchs角膜内 皮营养不良疾病基因诊断、产前基因筛查及遗传咨询的途径，应用效果表明本发明所提供 的基因的SNP位点及检测引物可以有效的用于临床患者及胎儿绒毛或羊水进行TMC03基因 突变位点的快速检测。
【专利附图】
【附图说明】
[0054] 图1:实施例1的Fuchs角膜内皮营养不良家系内患者及正常人TMC03测序图，其 中A:患者；B:正常人。该家系中八名患者TMC03基因编码区域由起始密码子起第41位发 生了杂合突变，其碱基由C为突变为T。
[0055] 图2 :实施例2的Fuchs角膜内皮营养不良患者及其母亲TMC03测序图，其中A :患 者；B :母亲。该患者TMC03基因编码区域由起始密码子起上游第129个碱基发生了杂合突 变，由G突变为A。
[0056] 图3:实施例2的另一名Fuchs角膜内皮营养不良患者及其母亲TMC03测序图，其 中A:患者；B:母亲。该患者TMC03基因编码区域由终止密码子起下游第268个碱基发生了 杂合突变，由G突变为A。
【具体实施方式】
[0057] 申请人:在一个Fuchs角膜内皮营养不良家系中发现TMC03基因的突变位点，并证 实该基因的突变是该病的致病基因，从而促成了本发明。
[0058]TMC03基因位于染色体13q34,可转录成大约2034bp的mRNA(NCBI登录号为 NM_017905. 4)，直接翻译形成677个氨基酸组成的蛋白质。
[0059] 下面结合实施例对本发明进行详细的描述。
[0060] 实施例1:从Fuchs角膜内皮营养不良综合征家系中筛选TMC03基因的突变位点
[0061] 1、提取外周血基因组DNA:
[0062] 在符合国家相关政策规定，并在取样对象同意的基础上，抽取该家系成员外周静 脉血2-5ml，放入EDTA抗凝管内，-80°C冻存备用；冻存的EDTA抗凝血在室温融化后，取 500μL放于离心管，加入等体积TE(ρΗ8· 0)，混匀，4°C，IOOOOrpm离心10分钟，弃上清。
[0063]加入 180yLTE、20yLSDS(10%)、8yL蛋白酶K(10mg/ml)混匀，置于 37°C水浴过 夜。从水浴中取出样品，瞬时离心沉淀样本。在反应管中加入等体积的Tris-饱和酚（约 300μL)，充分混匀，室温下IOOOOrpm离心10分钟，吸取上清液（约300μL)至一新离心管 中。重复酚抽提一次，吸取上清液至一新离心管中。
[0064]加入等体积的Tris饱和酚：氯仿混合液（酚、氯仿各150yL)，混匀，室温 IOOOOrpm离心10分钟，转移上清液至一新离心管。
[0065] 加入等体积的Tris饱和酚：氯仿：异戊醇混合液（酚、氯仿、异戊醇各100μL)，混匀，室温IOOOOrpm离心10分钟，转移上清液至一新离心管。
[0066] 加入1/10体积3mol/L、pH5. 2醋酸钠（约30μL)，2倍体积预冷100%乙醇，轻轻 混合，可见白色絮状沉淀。室温IOOOOrpm离心10分钟，使DNA沉淀于管底，弃上清。
[0067] 向DNA沉淀加入70 %乙醇，漂洗一次，室温7000rpm离心5分钟，弃上清，置于室温 中挥发剩余乙醇，最后加入50μLTE(pH8. 0)，4°C过夜溶解DNA。
[0068] 对提取的DNA行琼脂糖胶电泳，并应用紫外分光光度计在260nm和280nm比色，检 测DNA纯度及浓度。
[0069] 2、连锁分析：由北京怡美通德科技发展有限公司通过0mniZhonghua8芯片对 该家系内成员进行连锁分析，显示可能连锁的区域为：Chrl:11060075-13954853,Chr 5:75590805-103478518,Chrll:122477025-128196675,Chrl3:112195456-115086044, Chr17:36975-1244992,Chr18:2335224-2634943,Chr19:56583279-56924761， Chrl9:57771883-58572500,Chrl9:56419263-58439306,Chr21:15493361-16958251〇
[0070] 3、外显子组测序：外显子组测序（ExomeSequencing)是一种新型的基因组分析 技术，只需针对全基因外显子（exon)区域的DNA即可，取该家系中3名患者的基因组DNA， 由北京贝瑞和康生物技术有限公司应用AgilentHumanAllExon50M芯片捕获人类基因 组的外显子区域，然后对富集的外显子文库进行高通量测序。将突变滤过4个正常人数据 库：单核苷酸多态性数据库ncbi.nih.gov/snp/database/)，千人基因组计划 (ftp://ftp-trace,ncbi.nih.gov/1000genomes/ftp/),Hapmap8 数据库（http://hapmap. ncbi.nlm.nih.gov/)，及炎黄数据库（http://yh.genomics,org.cn/)，进一步筛选出 5 名 患者共有的位于可能连锁区域的非同义突变位点4个，应用直接测序法在该家系内筛选到 与致病单倍体型共分离的致病基因TMC03,并在正常人群外周血基因组DNA样本中进行该 位点的突变筛查，未发现该突变。
[0071] 4、直接测序法验证该家系内患者TMC03基因的突变
[0072] PCR扩增目的片段：反应条件与反应体系：
[0073] (I)PCR反应条件：94°C3min;94°C40sec，55±3°C40se，72°C60sec， 3〇-35cycles；72°C10min〇
[0074](2)反应体系：（TAKARA LA Taq polymerase)
[0075] 2XGCbufferl或Il 25μ! 2.5mMdNTP 8μΙ TMCCB-F引物（IOpmol/μΙ) 2μ1 TMC03-R引物（10pmo_) 2μΙ LA Taq polymerase Ο.δμΙ 基因组DNA模板（80ng/ul) 1μΙ
[0076]
【权利要求】
1. 一种TMC03基因的应用，其特征在于，所述的应用是TMC03基因在制备用于检测 Fuchs角膜内皮营养不良诊断制品中的应用。
2. 如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的诊断制品为PCR检测引物或探针。
3. -种用于检测Fuchs角膜内皮营养不良的引物对，所述的引物对的信息如下： TMC03-E1F ：TCTGCGAGGGCCTTGGCT SEQ ID N0:1 TMC03-E1R ：CCAGGGAGGGAGGGAAGGA SEQ ID NO :2 TMC03-E2F ：CCCTTCACAAAGCACCATACAA SEQ ID NO :3 TMC03-E2R ：CGTGTGGGCTGTCTCTAGGAT SEQ ID NO :4 TMC03-E3F ：ACATATGAACAGGGACATTT SEQ ID NO :5 TMC03-E3R ：TACACGTGAACAATTTCAAC SEQ ID NO :6 TMC03-E4F ：GCAGAAATCCTAAACCTATC SEQ ID NO :7 TMC03-E4R ：AAGATAAAGCTCGGTCATA SEQ ID NO :8 TMC03-E5F ：CCCAGAATACACTCTTCAT SEQ ID NO :9 TMC03-E5R ：GTTTATACGAAGCTGGTATC SEQ ID NO:10 TMC03-E6F ：TCGAAGTACACTGTGTGAT SEQ ID NO: 11 TMC03-E6R ：AACATCAAACCGAAATATC SEQ ID NO: 12 TMC03-E7F ：GTGAGGATTCACCATGTT SEQ ID NO: 13 TMC03-E7R ：TGGTTAGGAAAGTCCTAAGA SEQ ID NO:14 TMC03-E8F ：GTTGTCGTAGACCTGTCTT SEQ ID NO: 15 TMC03-E8R ：ACAGGACTGAGGAACTGT SEQ ID NO: 16 TMC03-E9F ：GCTCAACACAACTTAATTTC SEQ ID NO:17 TMC03-E9R ：TTGATGGGTAGTATAAGAAAG SEQ ID NO:18 TMC03-E10F ：CTAATAGCAGCCTCCACAT SEQ ID NO:19 TMC03-E10R ：GCTGGACAGAAGAAACAGTA SEQ ID NO :20 TMC03-E11F ：TTCCTGTATTGAAGCAAGT SEQ ID NO:21 TMC03-E11R ：GCTCAATTCTGAAACAATC SEQ ID NO :22 TMC03-E12F ：TTTGCCTTATTGTTCAGTG SEQ ID NO :23 TMC03-E12R ：CTAACTGCAACTTTCCTCTG SEQ ID NO :24 TMC03-E13-1F ：GTGCTAGTCCTGACAGTCTC SEQ ID NO :25 TMC03-E13-1R ：AAACATAGGCTTTAAGAATCAA SEQ ID NO :26 TMC03-E13-2F ：TGTGAGTTCATCAGTTCATAGT SEQ ID NO :27 TMC03-E13-2R ：TTTGGTGTCTTGGAGAATAG SEQ ID NO:28。
4. 一种用于检测Fuchs角膜内皮营养不良的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒包含 有权利要求3所述的引物对中的任一种或几种。
5. -种与Fuchs角膜内皮营养不良疾病相关的SNP位点，所述的SNP位点为TMC03基 因编码区域由起始密码子起第41位，其碱基为C或T。
6. -种与Fuchs角膜内皮营养不良疾病相关的SNP位点，所述的SNP位点为TMC03基 因编码区域由起始密码子起上游第129位，其碱基为G或A。
7. -种与Fuchs角膜内皮营养不良疾病相关的SNP位点，所述的SNP位点为TMC03基 因编码区域由终止密码子起下游第268位，其碱基为G或A。
8. -种检测权利要求5所述的SNP位点的方法，其特征在于，是用核苷酸序列为SEQ ID N0:3和SEQ ID N0:4的引物检测的。
9. 一种检测权利要求6所述的SNP位点的方法，其特征在于，是用核苷酸序列为SEQ ID NO: 1和SEQ ID NO:2的引物检测的。
10. -种检测权利要求7所述的SNP位点的方法，其特征在于，是用核苷酸序列为SEQ ID N0:27和SEQ ID N0:28的引物检测的。
【文档编号】C12N15/11GK104357551SQ201410515739
【公开日】2015年2月18日 申请日期:2014年9月30日 优先权日:2014年9月30日
【发明者】黄钰森, 陈鹏, 王晔, 郝晓丹 申请人:山东省眼科研究所