一种g6pd缺乏症基因检测膜条以及pcr引物的制作方法
【专利摘要】本发明涉及G6PD缺乏症用的基因检测膜条及相关引物，具体涉及一种G6PD缺乏症基因检测膜条以及PCR引物，共包括17个突变位点共20种突变类型进行检测，所述20种突变类型分别为：A95G、G392T、G487A、A493G、T517C、C519T、C519G、C592T、A835G、A835T、G871A、C1004T、C1004A、C1024T、C1311T、C1360T、G1376T、G1381A、C1387T、G1388A，所述PCR引物包括7对共14条引物，分别简写为G1F、G1R、G2F、G2R、G3F、G3R、G4F、G4R、G5F、G5R、G6F、G6R、G7F、G7R，本发明将大大降低患者漏检的频率，保护患者生命和健康，并且该检测膜条检测迅速准确，极少出现假阳性或假阴性。
【专利说明】—种G6PD缺乏症基因检测膜条以及PCR引物
【技术领域】
[0001]本发明涉及医学上葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(glucose-6-phosphatedehydrogenase, G6PD)缺乏症用的基因检测膜条及相关引物,具体涉及一种G6H)缺乏症基因检测膜条以及用于扩增待检样品基因片段的PCR引物。
【背景技术】
[0002]葡萄糖_6_ 憐酸脱氧酶(glucose-6-phosphate dehydrogenase, G6PD)缺乏症是全球最常见的一种X连锁不完全显性遗传病，估计全球有4亿人受累。该病的高发区包括地中海沿岸、非洲、东南亚及我国的南部省区。Gero缺乏症临床上表现为新生儿黄疸、蚕豆病、药物性溶血、感染性溶血和非球形细胞溶血性贫血等疾病，在儿童及婴幼儿期集中表现为蚕豆病和新生儿黄疸，往往病情较重，如不及时救治将危及患儿生命。
[0003]目前临床上常用的G6H)缺乏症检测方法包括高铁血红蛋白还原试验、G6PD活性试验、Gero定量比值法等，这些化学试验方法过程简单、价格低廉，适宜在基层医院开展，但准确性较差，存在假阳性或假阴性，特别对隐性携带者的孕妇易漏诊，从而造成未对出生的患儿进行应有的临床指导，危及患儿的健康或生命。
[0004]在本申请之前，已有用PCR-膜条杂交技术方法检测G6H)基因突变的技术方法，其中中国授权专利，专利号为:201110069362，公开了一种方法能检测12种突变类型，分别为:A95G、G392T、G487A、A493G、C592T、G871A、C1004T、C1024T、G1376T、G1381A、C1387T、G1388A。中国授权专利，专利号为:201210363243专利公开了一种方法能检测13种突变类型，分别为:A95G、G392A、A493G、C592T、G871A、C1004T、C1024T、C1311T、C1360T、G1376T、G1381A、C1387T、G1388A。这两个专利都未包括中国人群中较为重要的突变类型，因此，以上两个专利的产品都将造成较为严重的漏检，可导致影响部分患者的生命和健康的严重后果O
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【发明内容】
[0005]本发明的目的是针对现有技术中的不足，提供一种Gero缺乏症基因检测膜条，其检测范围为17个突变位点共20种突变类型(其中三个突变位点各有两种突变类型)，不仅包括了现有技术中的所有突变类型，而且增加了中国人群中较为重要的突变类型。因此，应用本申请产品进行检测，将大大降低患者漏检的频率，保护患者生命和健康，并且该检测膜条检测迅速准确，极少出现假阳性或假阴性。
[0006]本发明的另一发明目的是，提供用于扩增待检样品基因片段的PCR引物，该PCR引物针对17个突变位点共20种突变类型重新设计得出，完全根据中国人群突变频率较高的的突变基因型T517C、C519T、C519G、A835G、A835T、C1004A设计，准确率高，与探针的结合性能好，扩增速率快，对于临床检测具有很强的临床指导意义。
[0007]本发明的目的通过以下技术方案实现:
一种G6ro缺乏症的基因检测膜条，包括基底膜条以及在所述基底膜条上固定有特异性的突变探针和正常对照探针，共包括20条突变探针和13条正常对照探针，20个突变探针对应共17个突变位点，所述20条突变探针分别为:A95G、G392T、G487A、A493G、T517C、
C519T、C519G、C592T、A835G、A835T、G871A、C1004T、C1004A、C1024T、C1311T、C1360T、
G1376T、G1381A、C1387T、G1388A。
[0008]其中，所述突变探针的3’端或5’端带有氨基标记，所述突变探针的具体序列为:
【权利要求】
1.一种G6ro缺乏症的基因检测膜条，包括基底膜条以及在所述基底膜条上固定有特异性的突变探针和正常对照探针，其特征在于:共包括20条突变探针型和13条正常对照探针，所述 20 种突变探针分别为:A95G、G392T、G487A、A493G、T517C、C519T、C519G、C592T、A835G、A835T、G871A、C1004T、C1004A、C1024T、C1311T、C1360T、G1376T、G1381A、C1387T、G1388A。
2.根据权利要求1所述的一种G6H)缺乏症的基因检测膜条，其特征在于:所述突变探针和正常对照探针的3’端或5’端带有氨基标记，所述突变探针的具体序列为:
3.根据权利要求1所述的一种Gero缺乏症的基因检测膜条，其特征在于:所述基因检测膜条由以下方法制备而成: a.用打印机在基底膜条上打印位点阵列； b.用EDAC溶液浸泡打印后的膜条:将浸泡后的膜条置于水平摇床上轻摇浸泡30min，以活化膜条表面的羧基基团； c.分别用探针稀释液将33条探针稀释至5μ mol/L ； d.将探针点加在膜条相应位点上，探针上的氨基与膜条表面的羧基发生交联反应； e.待膜条干燥后，用0.lmol/L的NaOH溶液浸泡膜条5分钟，以封闭膜条表面未反应的竣基; f.纯水洗涤膜条，干燥后即可。
4.根据权利要求1所述的一种Gero缺乏症的基因检测膜条，其特征在于:所述检测膜条上的探针阵列具体从左至右包括4行8列依次排列，共30个探针位点，第一行的探针排列为:517N、1376N、1388N、487N、95N、392N、871N、92N ;第二行的探针排列为:835N、1376M、1388M、487M、95M、392M、871M、1004N ;第三行的探针排列为:1311N、1381M、1387M、493M、592M、1004M、1024M、1024N ;第四行的探针排列为:1360N、517M、519M、835M、1311M、360M。
5.用于扩增待检样品基因片段的PCR引物，其特征在于:所述PCR引物的扩增产物含有权利要求1所述的17个突变位点共20种突变类型，所述PCR引物包括7对共14条引物，分别简写为 GIF、G1R、G2F、G2R、G3F、G3R、G4F、G4R、G5F、G5R、G6F、G6R、G7F、G7R,相应的扩增产物分别包括如下位点:引物GlF和GlR扩增位点为cDNA392，G2F和G2R扩增位点为 cDNA487、cDNA493、cDNA517、cDNA519、cDNA592, G3F 和 G3R 扩增位点为 cDNA95，G4F 和G4R 扩增位点为 cDNA871、cDNA1004、cDNA1024，G5F 和 G5R 扩增位点为 cDNA1376、cDNA1381、cDNA1387、cDNA1388, G6F 和 G6R 扩增位点为 cDNA835, G7F 和 G7R 扩增位点为 cDNA1311、CDNA1360。
6.根据权利要求5所述的PCR引物，其特征在于:所述引物的5’端带有生物素标记。
7.根据权利要求6所述的PCR引物，其特征在于:所述14条引物序列为:
8.根据权利要求6所述的PCR引物，其特征在于:所述PCR引物由以下方法扩增而成:步骤1:合成14条引物，配制成25 μ L的PCR反应液，PCR反应液含有各成份及浓度分别为:14 条引物浓度为 0.2ymol/L、Taq 酶为 0.1U/μ LUXPCR Buffer^MgCl2 % 1.5mmol/L、UNG 酶(尿嘧啶-N-糖基化酶)为 0.01U/ μ L、dN (U)TP 为 0.2mmol/L、模板 DNA 约为 2ng/μ L ； 步骤2:将步骤I配制好的反应液经过以下程序反应:50°C 2分钟；95°C 10分钟；95°C45秒，53°C 45秒，72°C 30秒，循环`35次；最后72°C 5分钟即可。
【文档编号】C12Q1/68GK103695554SQ201310730702
【公开日】2014年4月2日 申请日期:2013年12月26日 优先权日:2013年12月26日
【发明者】陆小梅, 黎四平, 李文瑞, 彭琪 申请人:东莞市石龙博爱医院