专利名称：红细胞g6pd缺乏症双酶比值检测法及其试剂盒和使用方法
技术领域：
本发明涉及血液检测技术，尤其是指一种红细胞G6PD缺乏症双酶比值检测法，本发明还涉及用于红细胞G6PD缺乏症检测试剂盒及该试剂盒的使用方法。
背景技术：
红细胞葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(G6PD)缺乏症患者是我国常见的遗传病，发病率在长江以南各省很高(约3～16％)，我国有约1亿G6PD缺乏症患者，该病特征是平时无症状，但患者的红细胞容易受到某些特定物质的破坏而发生溶血，导致溶血性贫血、药物溶血、蚕豆病等，最严重的是新生儿溶血，导致核黄疸从而发展为儿童终身智力低下或死亡。由于G6PD基因定位于X染色体上，男性只有一条X染色体，男性G6PD缺乏者的酶缺乏很明显，酶活性低下容易被测出；但是女性有两条X染色体，通常只有一条染色体发生病变，而另一条X染色体上有一个正常的G6PD基因，所以女性酶缺乏者不明显，以致病基因携带者(杂合子)普遍存在人群中；但是女性杂合子会将致病基因传给下一代，如在她们妊娠、生产、哺乳期发生急性溶血，会导致新生儿溶血、新生儿核黄疸或发育生长迟缓。
对红细胞G6PD定性定量测定，自50年代起已经建立了多种方法，经过40多年的筛选，现在只有紫外分光关度法、高铁学红蛋白还原试验(MetHB)和四氮唑蓝(NBT)定性定量法和手工双酶比值法得到应用。其中的紫外分光关度法的杂合子检出率为38.5％，高铁学红蛋白还原试验的杂合子检出率为50.8％；而手工双酶比值法是本申请的发明人经过近40年的研究提出的，它是利用人红细胞戊糖代谢的关键酶葡萄糖6磷酸脱氢酶(G6PD)催化葡萄糖6磷酸(G6P)转化为6磷酸葡萄糖酸(6PG)时，伴有氧化型辅酶II(NADP)转化成还原型辅酶(NADPH)，NADPH产生后，在酚嗪二甲酯硫酸盐(PMS)递氢的促进下，NADPH的H离子，将传递给氧化型硝基四氮唑蓝(黄色，NBT)，使之转变为还原型NBT(蓝色)，用分光光度计650nm光密度比色可以测出蓝色的深浅，即NADPH生成量(S1)由此间接反映G6PD活性；因人体内酶的活性在血标本内保存极不稳定，而且，外源性G6PD活性的质量控制品不易获得。如果仅测G6PD活性，就很难排除因其它原因引起的G6PD活性降低(如病人贫血、标本溶血、凝血、陈旧、污染等)，因而造成误诊。人红细胞戊糖代谢的另一同功酶6磷酸葡萄糖酸脱氢酶(6PGD)也有将NADP转化成NADPH的作用，当6PGD催化6PG转化为5磷酸核酮糖(5’PR)时，伴有NADP转化成NADPH，同样，NADPH产生后，在PMS递氢的促进下，NADPH的氢离子将传递给氧化型NBT(黄色)，使之转变为还原型NBT(蓝色)，用分光光度计650nm光密度比色可以测出蓝色的深浅，即NADPH生成量(S2)，由此间接反映了6PGD活性，目前，没有6PGD缺乏的个体，同时测定6PGD活性可以设置了内质控，通过两个酶的活性生成的产物NADPH，催化氧化型NBT再生成还原型NBT的光密度比值计算(S1/S2)，间接判断出G6PD活性，其杂合子检出率可达76.9％。但手工双酶比值法存在工艺流程长，对样品只能逐个检测，一天最大限量只可检测20～30个样品，每个样品反应量为2060μl×2等不足。
因此，提供一种检测更为直接、结果准确、快速、杂合子查出率高的G6PD缺乏症检测方法，是降低该病发病率和预防新生儿核黄疸的关键。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种检测更为直接，准确、操作简便、，成本低、易于推广的红细胞G6PD缺乏症双酶比值检测法。
本发明要解决的另一个技术问题是提供一种可实施上述方法的临床检测用试剂盒。
本发明要解决的再一个技术问题是提供一种更为快速的使用上述试剂盒的检测方法。
本发明的前一技术方案是这样的一种红细胞G6PD缺乏症双酶比值检测法，其特征是包括下述步骤(1)制备待检测人的抗凝全血溶血液；(2)测试溶血液的葡萄糖6磷酸脱氢酶促葡萄糖6磷酸转化6磷酸葡萄糖酸的反应中生成产物还原型辅酶II在340nm波长处的特征性光吸收，间接地测出葡萄糖6磷酸脱氢酶酶促反应中的活性A；(3)测试溶血液的6磷酸葡萄糖酸脱氢酶促6磷酸葡萄糖酸转化成5磷酸核酮糖的反应中生成产物还原型辅酶II在340nm波长处的特征性光吸收，间接地测出6磷酸葡萄糖酸脱氢酶酶促反应中的活性B；(4)计算A与B的比值，葡萄糖6磷酸脱氢酶缺乏症患者该比值小于1.0。
本发明的后一技术方案是这样的一种红细胞G6PD缺乏症双酶比值检测方法用试剂盒，是由葡萄糖-6-磷酸钠反应液、6-磷酸葡萄糖酸钠反应液和R1缓冲液组成，其中葡萄糖-6-磷酸钠反应液是由1～2份166uMol～500uMol葡萄糖-6-磷酸钠和1～3份0.2～0.5mMol三羟甲基氨基甲烷组成，pH 7.0～8.8；6-磷酸葡萄糖酸钠反应液是由1～2份140uMol～400uMol 6-磷酸葡萄糖酸钠和1～3份0.2mMol～0.5mMol三羟甲基氨基甲烷组成，pH 7.0～8.8；R1缓冲液是由1～2份84uMol～200uMol氧化型辅酶II、1～1.5份117mMol氯化镁和1～3份0.2～0.5mMol三羟甲基氨基甲烷组成，pH 7.0～8.8；上述摩尔浓度为溶质在双蒸水中的浓度，份数为体积份。
本发明的再一技术方案是这样的一种红细胞G6PD缺乏症双酶比值检测试剂盒的使用方法，包括下述步骤(1)取待测人抗凝全血50μl，加入纯净水1.20ml，放入一试管中，混匀，制成溶血液；(2)在双通道自动化生化仪上测试，方法是(a)第一通道R1缓冲液200μl加溶血液10μl混匀，37℃±1℃中保温2分钟后加入葡萄糖-6-磷酸钠反应液100μl，37℃±1℃中保温5分钟后，监测氧化型辅酶II在340nm吸光度中上升的速率A；(b)第二通道R1缓冲液200μl加溶血液10μl混匀，37℃±1℃中保温2分钟后加入6-磷酸葡萄糖酸钠反应液100μl，37℃±1℃中保温5分钟后，监测氧化型辅酶II在340nm吸光度中上升的速率B；(c)机器计算A与B的比值直接判断。
上述红细胞G6PD缺乏症双酶比值检测试剂盒的使用方法中步骤(1)所述的双通道自动化生化仪为日立HITACHI7160/7170/7080或贝克曼BECKMAN CX4/5/7/9 LX20或奥林巴斯Olympus 400/600/640/2700/5400中的其中一种。
本发明用全自动生化仪代替手工操作方法，全自动生化分析仪是应用吸收光谱的基本定律来检验各种溶液的浓度指标，辅以简单的控制和计算手段来实现医学检验目的。
全自动生化仪已用于其他酶学分析检测，其原理是，因为酶促反应的活性很难通过化学或物理的方法直接监测，故需在反应中加入一些能与酶作用但又不干扰这个酶促反应的底物试剂，使酶促反应的产物转变成易被监测的第二产物。通过这种反应，在特定的波长处有特征性光吸收，间接地测出酶促反应中的活力。
本发明在技术利用上述原理，通过监测G6PD在酶促反应中生成的第二产物还原型辅酶II(NADPH)。在特定的波长340nm处有特征性光吸收，间接地测出G6PD酶促反应中的活力A。通过监测6PGD在酶促反应中生成的第二产物还原型辅酶II(NADPH)，在特定的波长340nm处有特征性光吸收，间接地测出6PGD酶促反应中的活力B。仪器自动计算出A与B的比值，马上得出检测结果。
本发明与现有技术相比具有下述优点与手工双酶比值法相比，(1)可减少实验步骤，提高了检测准确性；(2)可减少试剂使用量，降低了成本；(3)便于实现自动检测，可批量检测，大大提高检测效率；(4)每个样品的反应量减少为300ul×2(前技术，每个样品反应量为2060ul×2)，废液量大大减少，利于降低成本和减小环境污染。
具体实施例方式
下面结合实施例对本发明作进一步地详细说明，但不构成对本发明的任何限制。
本发明方法的作用基理是人红细胞戊糖代谢的关键酶葡萄糖6磷酸脱氢酶(G6PD)催化葡萄糖6磷酸(G6P)转化为6磷酸葡萄糖酸(6PG)时，伴有氧化型辅酶II(NADP)转化成还原型辅酶(NADPH)，因此测试NADPH的量反映了G6PD的活性，但是单测G6PD活性不能排除因其他原因引起的G6PD活性降低(如病人贫血、标本溶血、凝血、陈旧、污染等)，造成误诊。本发明设计，同时测试红细胞戊糖代谢的另一同功酶6磷酸葡萄糖酸脱氢酶(6PGD)，它也有将NADP转化成NADPH的作用，因目前没有6PGD缺乏的个体，同时测定6PGD活性，设置了个体测试时的内质控参数；再通过两个酶的活性比值计算G6PD/6PGD，正确判断G6PD是否缺乏，可有效地提高了女性杂合子的检出率。
实施例1试剂盒组成之一组份葡萄糖-6-磷酸钠反应液(R2/G6P)由1份(体积份，下同)500uMol葡萄糖-6-磷酸钠(G6P)、3份0.2mMol三羟甲基氨基甲烷组成，pH 7.0。
6-磷酸葡萄糖酸钠反应液(R2/6PG)由1份400uMol 6-磷酸葡萄糖酸钠、3份0.5mMol三羟甲基氨基甲烷组成，pH 7.0。
R1缓冲液由1份200uMol氧化型辅酶II、1份117mMol氯化镁和3份0.2mMol三羟甲基氨基甲烷组成，pH 7.0。
实施例2试剂盒组成之二组份R2/G6P反应液由1.5份300uMol葡萄糖-6-磷酸钠(G6P)、2份0.3mMol三羟甲基氨基甲烷组成，pH 8.0。
R2/6PG反应液由1.5份270uMol 6-磷酸葡萄糖酸钠、2份0.3mMol三羟甲基氨基甲烷组成，pH 8.0。
R1缓冲液由1.5份120uMol氧化型辅酶II、1份117mMol氯化镁和2份0.3mMol三羟甲基氨基甲烷组成，pH 8.0。
实施例3试剂盒组成之三组份R2/G6P反应液由2份166uMol葡萄糖-6-磷酸钠(G6P)、1份0.5mMol三羟甲基氨基甲烷组成，pH 8.8。
R2/6PG反应液由2份140uMol 6-磷酸葡萄糖酸钠、1份0.2mMol三羟甲基氨基甲烷组成，pH 8.8。
R1缓冲液由2份84uMol氧化型辅酶II、1.5份117mMol氯化镁和1份0.5mMol三羟甲基氨基甲烷组成，pH 8.8。
实施例4G6PD缺乏症测试方法(1)取待测人抗凝全血50μl，加入纯净水1.20ml，放入一试管中，混匀，制成溶血液；(2)在日立7170双通道自动化生化仪上测试，方法是(a)第一通道R1缓冲液200μl加溶血液10μl混匀，37℃±1℃中保温2分钟后加入葡萄糖-6-磷酸钠反应液100μl，37℃±1℃中保温5分钟后，监测氧化型辅酶II在340nm吸光度中上升的速率A；(b)第二通道R1缓冲液200μl加溶血液10μl混匀，37℃±1℃中保温2分钟后加入6-磷酸葡萄糖酸钠反应液100μl，37℃±1℃中保温5分钟后，监测氧化型辅酶II在340nm吸光度中上升的速率B；(c)计算A与B的比值直接判断；A与B的比值正常人应在1.0～2.3内；新生儿应在1.1～2.5内；G6PD缺乏症患者应小于1.0。
实施例5本发明的方法与MetHB法的比较实验，结果见表1。
表1
实施例6本发明的方法与紫外分光光度法对肯定杂合子病例的检出率比较实验，结果见表2。
表2
权利要求
1.一种红细胞G6PD缺乏症双酶比值检测法，其特征是包括下述步骤(1)制备待检测人的抗凝全血溶血液；(2)测试溶血液的葡萄糖6磷酸脱氢酶促葡萄糖6磷酸转化6磷酸葡萄糖酸的反应中生成产物还原型辅酶II在340nm波长处的特征性光吸收，间接地测出葡萄糖6磷酸脱氢酶酶促反应中的活性A；(3)测试溶血液的6磷酸葡萄糖酸脱氢酶促6磷酸葡萄糖酸转化成5磷酸核酮糖的反应中生成产物还原型辅酶II在340nm波长处的特征性光吸收，间接地测出6磷酸葡萄糖酸脱氢酶酶促反应中的活性B；(4)计算A与B的比值，葡萄糖6磷酸脱氢酶缺乏症患者该比值小于1.0。
2.一种实现权利要求1所述红细胞G6PD缺乏症双酶比值检测方法的试剂盒，其特征是由葡萄糖-6-磷酸钠反应液、6-磷酸葡萄糖酸钠反应液和R1缓冲液组成，其中葡萄糖-6-磷酸钠反应液是由1～2份166uMol～500uMol葡萄糖-6-磷酸钠和1～3份0.2～0.5mMol三羟甲基氨基甲烷组成，pH 7.0～8.8；6-磷酸葡萄糖酸钠反应液是由1～2份140uMol～400uMol 6-磷酸葡萄糖酸钠和1～3份0.2mMol～0.5mMol三羟甲基氨基甲烷组成，pH 7.0～8.8；R1缓冲液是由1～2份84uMol～200uMol氧化型辅酶II、1～1.5份117mMol氯化镁和1～3份0.2～0.5mMol三羟甲基氨基甲烷组成，pH 7.0～8.8；上述摩尔浓度为溶质在双蒸水中的浓度，份数为体积份。
3.权利要求2所述红细胞G6PD缺乏症双酶比值检测试剂盒的使用方法，其特征是包括下述步骤(1)取待测人抗凝全血50μl，加入纯净水1.20ml，放入一试管中，混匀，制成溶血液；(2)在双通道自动化生化仪上测试，方法是(a)第一通道R1缓冲液200μl加溶血液10μl混匀，37℃±1℃中保温2分钟后加入葡萄糖-6-磷酸钠反应液100μl，37℃±1℃中保温5分钟后，监测还原型辅酶II在340nm吸光度中上升的速率A；(b)第二通道R1缓冲液200μl加溶血液10μl混匀，37℃±1℃中保温2分钟后加入6-磷酸葡萄糖酸钠反应液100μl，37℃±1℃中保温5分钟后，监测还原型辅酶II在340nm吸光度中上升的速率B；(c)计算A与B的比值直接判断。
4.根据权利要求的使用方法，其特征是步骤(1)所述的双通道自动化生化仪为日立HITACHI 7160/7170/7080或贝克曼BECKMAN CX4/5/7/9 LX20或奥林巴斯Olympus400/600/640/2700/5400中的其中一种。
全文摘要
本发明公开了一种红细胞G6PD缺乏症双酶比值检测法及其试剂盒和使用方法，属血液检测技术领域，其中检测法的关键是对同一样品分别测试其G6PD催化G6P和6PGD催化6PG在340nm吸光度中的上升速率A和B，根据A与B的比值直接判定；试剂盒是由R2/G6P、R2/6PG和R1缓冲液组成，使用方法是先制备待测样品的溶血液，然后直接在双通道自动生化仪上测试，机器直接计算出A与B的比值。本发明的方法具有检测准确、操作简便、快捷，成本低、易于推广的优点，用于G6PD缺乏症的检测。
文档编号G01N33/50GK101059421SQ20071002817
公开日2007年10月24日 申请日期2007年5月24日 优先权日2007年5月24日
发明者杜琴 申请人:杜传书, 杜琴