专利名称：一株产acc脱氨酶并拮抗赤霉病菌的水稻内生固氮菌及其用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及一株产ACC脱氨酶并拮抗赤霉病菌的水稻内生固氮菌及其用途，特别涉及一株可以产生ACC脱氨酶、拮抗作物赤霉病菌，并具有在水稻体内进行高效固氮功能的细菌。
背景技术：
氮肥是农业生产中最重要的生产资料之一。生产化学氮肥消耗大量能源，占生产总成本的70% 80%。近年来能源日趋紧张，我国化肥生产用煤价格飚升导致化学氮肥价格上涨，农民难以承受，反响强烈。此外，化学氮肥在提高作物产量、保障我国粮食安全方面发挥了巨大作用，但是不合理施氮已经形成了严重的面源污染，造成一系列的严重危害，如太湖蓝藻事件令人触目惊心。城市地下水硝酸盐污染已经对饮用水安全造成了威胁。大气中含有78%的氮素，但其存在形式是分子态氮气，动植物不能直接利用，自然界只有某些原核微生物具有直接利用大气中氮气的能力，将其还原成氨，这就是生物固氮作用。选用高效固氮微生物菌种工厂化生产制成菌剂，或进一步与其它富含植物营养的物料复合加工成生物制品，应用于农业生产，可以提供作物氮素营养，改善作物根际生态环境，提高土壤生物肥力性状，这就是通常所说的固氮微生物菌剂或固氮微生物肥料。生物氮肥具有多种优势①生物氮肥由可再生的生化制剂和活体微生物组成，可以再生，不存在资源枯竭问题，是可持续发展农资产品。②生物氮肥是环境友好型肥料，其生产和使用过程均不产生三废等污染性物质，而且能改善土壤理化性质，提高土壤肥力，是生态农业农资产品。③生物氮肥生产耗能少、成本低，其成本仅为等效化学氮肥的20% 40%，可以为国家节省大量的煤炭和石油等能源战略物资。④使用生物氮肥可以显著降低农业生产成本，提高农产品品质，提升土壤肥力，使农民受益，促进社会和谐发展。作物赤霉病的病原菌为玉米赤霉菌(Gibberella zeae)无性世代为禾谷镰刀菌 (Fusarium graminearum)，是粮食作物的重要致病菌。我国小麦赤霉病有95%是麦类赤霉病菌引起的，是长江中下游冬麦区和东北春麦区的重要病害，发病时经常造成20% 30% 的产量损失。此外，该菌还侵染玉米、水稻、大麦等作物，引起苗枯、茎腐、基腐、穗腐等。目前对赤霉病的防治主要依靠化学农药，然而化学防治不仅成本高、污染环境，而且防效也不理想，同时食品的安全性也受到严重影响。菌种是微生物肥料生产应用的基础。目前，限制我国微生物肥料行业发展的瓶颈就是高效菌种的选育问题。农业生产迫切需求固氮效能高、拮抗病原真菌、抗逆性强、货架期长的微生物肥料生产用菌种。
发明内容
本发明的目的是提供一株具有1-氨基环丙烷-1-羧酸(ACC)脱氨酶活性，可以在水稻体内进行高效固氮，并且拮抗玉米赤霉菌(Gibberella zeae)的细菌。
本发明提供的细菌是伯克霍尔德氏菌(BurWiolderia sp.)⑶SD125，该菌株在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏编号为CGMCC No. 5038。本发明的另一个目的是提供一种菌剂，该菌剂的活性成分为所述的伯克霍尔德氏菌(Burkholderia sp.)GDSD125 CGMCC No. 5038。该菌剂除包含作为活性成分的伯克霍尔德氏菌(BurWiolderia sp.)⑶SD125 CGMCC No. 5038外，还可包括辅料，如草炭、动物的粪便、各类作物的秸秆、松壳、稻草、花生皮等。该菌剂可用于抑制病原真菌、防治植物真菌病害、固氮、促进植物生长、抑制植物产生乙烯、降低植物对逆境敏感性、提高植物抗逆性、产生1-氨基环丙烷-1-羧酸(ACC)脱氨酶及固氮酶等。所述伯克霍尔德氏菌(Burkholderia sp. )GDSD125 CGMCC No. 5038在制备下述 1)-9)中任一的菌剂中的应用也属于本发明的保护范围1)用于抑制病原真菌的菌剂；2)用于防治植物真菌病害的菌剂；3)用于固氮的菌剂；4)促进植物生长的菌剂；5)抑制植物产生乙烯的菌剂；6)降低植物对逆境敏感性的菌剂；7)提高植物抗逆性的菌剂；8)产生1-氨基环丙烷-1-羧酸(ACC)脱氨酶的菌剂；9)产生固氮酶的菌剂。所述病原真菌可为通过土壤、施入土壤中的肥料、和/或种子传播的真菌，具体可为引起赤霉病的真菌；所述植物真菌病害为赤霉病；所述逆境为干旱、淹水、高温、机械损伤、病虫害侵袭或重金属污染等。所述引起赤霉病的真菌具体可为玉米赤霉菌(Gibberella zeae) 0所述的伯克霍尔德氏菌(Burkholderia sp. )GDSD125 CGMCC No. 5038或以伯克霍尔德氏菌(Burkholderia sp. )GDSD125 CGMCC No. 5038为活性成分的菌剂在生产固氮酶或 1-氨基环丙烷-1-羧酸脱氨酶中应用以及在制备生物有机肥中的应用也属于本发明的保护范围。本发明的另一个目的是提供一种含有所述的伯克霍尔德氏菌(Buricholderia sp. )GDSD125 CGMCC No. 5038 或以所述的伯克霍尔德氏菌(Burkholderia sp. )GDSD125 CGMCC No. 5038为活性成分的菌剂的生物有机肥。本发明的又一目的是提供一种培养伯克霍尔德氏菌(Burkholderia sp.)⑶SD125 CGMCC No. 5038 的方法，包括将伯克霍尔德氏菌(Burkholderia sp.) GDSD125 CGMCC No. 5038在用于培养伯克霍尔德氏菌的培养基中培养的步骤。本发明的又一目的是提供一种制备所述菌剂的方法，该方法包括如下步骤将所述的伯克霍尔德氏菌(BurWiolderia sp.)⑶SD125 CGMCC No. 5038作为活性成分，得到所述菌齐LU实验证明，本发明是从水稻植株分离筛选出的高效固氮菌GDSD125，该菌株可产生1-氨基环丙烷-1-羧酸(ACC)脱氨酶，且固氮酶活性很高，能够拮抗作物赤霉病病原菌玉米赤霉菌(Gibberella zeae)，竞争适应能力强，接种效果好，在固氮微生物菌剂和生物有机肥生产中具有广阔的应用前景。保藏说明菌种名称伯克霍尔德氏菌拉丁名(Burkholderia sp.)菌株编号GDSD125保藏机构中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏机构简称CGMCC地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号保藏日期2011年7月6日保藏中心登记入册编号CGMCC No. 5038
图 1 为伯克霍尔德氏菌(Burkholderia sp. )GDSD125 CGMCC No. 5038 的固氮酶活性。图 2 为伯克霍尔德氏菌(Burkholderia sp. )GDSD125 CGMCC No. 5038 拮抗赤霉病菌玉米赤霉菌(Gibberella zeae)。左侦Ij菌落为赤霉病菌玉米赤霉菌(Gibberella zeae), 右侧菌落为伯克霍尔德氏菌(Burkholderia sp. )GDSD125 CGMCC No. 5038。图 3 为伯克霍尔德氏菌(Burkholderia sp. )GDSD125 CGMCC No. 5038 的 ACC 脱氨
酶活性。
具体实施例方式下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。多碳源低氮培养基(CCM)溶液I =KH2PO4 0. 2g，NaCl 0. lg, K2HPO4 0. 8g， Na2FeEDTA 28mg,钼酸钠25mg，酵母浸膏lOOmg，甘露醇5g，蔗糖5g，乳酸钠0. 5mL,蒸馏水 900mL。溶液 II =MgSO4 ·7Η20 0. 2g，CaCl2 · 2Η20 0. 06g，蒸馏水 IOOmL0 将溶液 I、II 分别灭菌，冷却至50°C左右混合，加入生物素(5 μ g/L)和维生素(10yg/L)各0. 5mL。无氮培养基蔗糖10g, NaCl 0. 12g，K2HPO4 · 3H20 0. 5g，CaCO3 lg, MgSO4 · 7H20 0. 2g，蒸馏水 lOOOmL，pH7. 2。DF 培养基=KH2PO4 4. Og, Na2HPO4 6. Og, MgSO4 · 7H20 0. 2g，葡萄糖 2. Og,葡萄糖酸钠 2. 0g，柠檬酸 2. 0g, (NH4)2SO4 2. 0g，组分一、组分二溶液各 0. lml, H2O IOOOmL, pH 7. 2 ； 其中组分一 =H3BO3 1 Omg，MnSO4 · H2O 11. 19mg，ZnSO4 · 7H20 124. 6mg，CuSO4 · 5H20 78. 22mg, MoO3 10mg，溶于IOOmL灭菌蒸馏水中；组分二 FeS04 ·7Η20 IOOmg溶于IOmL灭菌蒸馏水中。ADF培养基将ACC(1-氨基环丙烷羧酸)溶于超纯水，过滤灭菌，加到不含 (NH4) 2S04的灭菌DF培养基中，终浓度为3. OmM。改良固氮培养基蔗糖10g、K2HPO4 · 3H20 0. 5g、NaCl 0. 2g、CaCO3 lg、MgSO4 · 7H20 0. 2g、酵母膏 0. 5g、蒸馏水 1000ml、琼脂 1. 5% 2. 0%, pH 7. 0 7. 2。
圆褐固氮菌(Azotobacter chroococcum) ACCCl 1103 (参见“孙建光等.高效固氮芽孢杆菌筛选及其生物学特性.中国农业科学，2009，42 (6) :2043-2051”)。赤霉病菌-玉蜀黍赤霉菌(Gibberella zeae)(中国农业微生物菌种保藏管理中心，ACCC31053)。实施例1、水稻内生固氮菌⑶SD125的分离与鉴定一、水稻内生固氮菌的分离水稻内生固氮菌的分离的具体操作如下取新鲜水稻植株(采自中国黑龙江省)，首先用自来水冲洗干净，然后依次用70%乙醇浸泡lmin，2%次氯酸钠表面消毒灭菌 lOmin，无菌水冲洗3次。无菌操作条件下，准确称取样品10. 0g，在无菌研钵内磨成糊状，转移、定容至100ml，继续稀释制成系列稀释样品，分别从10-4、10_5、10-6稀释液中取0. Iml分别均勻涂布在上述CCM培养基和无氮培养基平板上，倒置培养，3 4d后，挑取单菌落划线纯化，得到水稻内生固氮菌。同时，将表面消毒时最后一次洗涤水涂布在牛肉膏蛋白胨培养基上检测确认植株样品消毒彻底。二、ACC脱氨酶阳性菌株筛选对步骤一所得的水稻内生固氮菌进行ACC脱氨酶阳性菌株筛选，具体方法如下所述把分离到的内生固氮菌，接入5mL液体无氮培养基中，30°C、200r/min振荡培养Mi ；吸取上述培养液0. ImL接种至5mL DF培养基振荡培养24h ；吸取上述培养液0. ImL接种至5mL ADF培养基中振荡培养M 48h ；将在ADF中生长的菌种重复转接、培养，并以ADF培养基作为阴性对照，能够以ACC为唯一氮源生长的菌株为ACC脱氨酶阳性菌株。将筛选所得的一株ACC脱氨酶阳性菌株命名为水稻内生固氮菌⑶SD125。三、水稻内生固氮菌⑶SD125的鉴定从以下几个方面鉴定步骤一和二分离纯化并筛选得到的水稻内生固氮菌 GDSD125 1、形态学鉴定将处于对数生长期，且菌落大小稳定，上述步骤一分离并纯化得到的固氮菌 GDSD125进行单菌落状态描述，主要包括菌落的大小、颜色、透明度、湿润度、菌落表面状态 (是否平坦、突起、褶皱、凹陷等)、菌落边缘状态(是否整齐、不规则、放射状等)。对于处于对数生长期的所述固氮菌⑶SD125，经涂片染色后采用光学显微镜观察菌体的形态。结果表明，上述步骤一分离并纯化得到的固氮菌GDSD125菌落圆形脐状凸起，乳白色，有光泽，表面光滑湿润，边缘整齐；菌体卵圆形，0.5X1. 0 μ m，革兰氏阴性。2、生理生化特征分析参考《常见细菌系统鉴定手册》(东秀珠，蔡妙英.常见细菌系统鉴定手册.北京科学出版社，2011.)和《微生物学实验》(沈萍，范秀容，李广武.微生物学实验(第三版).北京高等教育出版社，1999.)测定上述固氮菌⑶SD125的生理生化特征。所述固氮菌⑶SD125的生理生化特征测定结果如表1所示表1固氮菌⑶SD125的生理生化特征
权利要求
1.伯克霍尔德氏菌(BurWiolderiasp.)⑶SD125，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏编号为CGMCC No. 5038。
2.一种菌剂，它的活性成分为权利要求1所述的伯克霍尔德氏菌(Buricholderia sp.) GDSD125 CGMCC No. 5038。
3.根据权利要求2所述的菌剂，其特征在于所述菌剂为下述1)-9)中任一的菌剂1)用于抑制病原真菌的菌剂；2)用于防治植物真菌病害的菌剂；3)用于固氮的菌剂；4)促进植物生长的菌剂；5)抑制植物产生乙烯的菌剂；6)降低植物对逆境敏感性的菌剂；7)提高植物抗逆性的菌剂；8)产生1-氨基环丙烷-1-羧酸脱氨酶的菌剂；9)产生固氮酶的菌剂。
4.权利要求1所述的伯克霍尔德氏菌(Burkholderiasp. )GDSD125 CGMCC No. 5038在制备下述1)-9)中任一的菌剂中的应用1)用于抑制病原真菌的菌剂；2)用于防治植物真菌病害的菌剂；3)用于固氮的菌剂；4)促进植物生长的菌剂；5)抑制植物产生乙烯的菌剂；6)降低植物对逆境敏感性的菌剂；7)提高植物抗逆性的菌剂；8)产生1-氨基环丙烷-1-羧酸脱氨酶的菌剂；9)产生固氮酶的菌剂。
5.根据权利要求3所述的菌剂或权利要求4所述的应用，其特征在于所述病原真菌为引起赤霉病的真菌；所述植物真菌病害为赤霉病；所述逆境为干旱、淹水、高温、机械损伤、病虫害侵袭或重金属污染。
6.根据权利要求5所述的菌剂或应用，其特征在于所述引起赤霉病的真菌为玉米赤霄菌(Gibberella zeae)。
7.权利要求1所述的伯克霍尔德氏菌(Burkholderiasp. )GDSD125 CGMCC No. 5038 或权利要求2、3、5或6所述的菌剂在生产固氮酶或1-氨基环丙烷-1-羧酸脱氨酶中应用； 或，权利要求1所述的伯克霍尔德氏菌(BurWiolderia sp. )GDSD125 CGMCC No. 5038或权利要求2、3、5或6所述的菌剂在制备生物有机肥中的应用。
8.含有权利要求1所述伯克霍尔德氏菌(Burkholderiasp. )GDSD125 CGMCC No. 5038 或权利要求2、3、5或6所述的菌剂的生物有机肥。
9.培养权利要求1所述的伯克霍尔德氏菌(BurWiolderiasp.)⑶SD125 CGMCC No. 5038的方法，包括将伯克霍尔德氏菌(Burkholderia sp. )GDSD125 CGMCC No. 5038在用于培养伯克霍尔德氏菌的培养基中培养的步骤。
10.权利要求2、3、5或6所述菌剂的制备方法，包括如下步骤将权利要求ι所述的伯克霍尔德氏菌(Burkholderia sp.)GDSD125 CGMCC No. 5038作为活性成分，得到所述菌剂。
全文摘要
本发明公开了一株产ACC脱氨酶并拮抗赤霉病菌的水稻内生固氮菌及其用途。该水稻内生固氮菌是伯克霍尔德氏菌(Burkholderia sp.)GDSD125，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏号为CGMCC No.5038。本发明所提供的伯克霍尔德氏菌(Burkholderia sp.)GDSD125 CGMCC No.5038具有较高的固氮活性，具有ACC脱氨酶活性，可以有效拮抗玉米赤霉菌(Gibberella zeae)，在固氮微生物菌剂和生物有机肥生产中具有广阔的应用前景。
文档编号C12N9/88GK102286401SQ20111019765
公开日2011年12月21日 申请日期2011年7月15日 优先权日2011年7月15日
发明者孙建光, 徐晶, 胡海燕, 高淼 申请人:中国农业科学院农业资源与农业区划研究所