肽基精氨酸脱亚胺酶1在制备肿瘤临床诊断试剂中的应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了肽基精氨酸脱亚胺酶1在制备诊断肿瘤的临床诊断试剂或检测物中的应用，所述肿瘤选自子宫癌、肝癌、胃癌、食管癌、卵巢癌、肺癌。具体应用时，以常规方法制备抗肽基精氨酸脱亚胺酶1抗体，建立检测肽基精氨酸脱亚胺酶1的定性或定量方法及配套试剂盒。本发明还公开了一种诊断肿瘤的血液诊断试剂，包括肽基精氨酸脱亚胺酶1抗体、HRP-IgG抗体，以及血液诊断试剂中的常规试剂。所述血液诊断试剂中的常规试剂包括碳酸盐缓冲液、PBST洗液、封闭液、显色液和终止液。本发明首次发现PAD1可以作为肿瘤血液标志物进行应用，经实验证明，PAD1作为肿瘤标志物具有可行性。
【专利说明】肽基精氨酸脱亚胺酶1在制备肿瘤临床诊断试剂中的应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及肽基精氨酸脱亚胺酶1作为肿瘤血液标志物在制备肿瘤临床血液诊 断试剂中的应用。
【背景技术】
[0002] 肽基精氨酸脱亚胺酶（Peptidylarginine deiminase, PAD或PADI)是在人体组 织中一种酶，目前，共发现了五种PAD酶（即PAD/PADI1、2、3、4和6)。这些酶由坐落在人 类染色体lp36区域上的一簇基因所编码，并具有不同的组织分布。它可以在钙离子存在 的情况下对其它一些组织蛋白进行后翻译修饰（post-translational modification)。这 个酶可将多肽链中的精氨酸（arginine)的氨基催化成羰基，从而使精氨酸转化成瓜氨酸 (citrulline)。瓜氨酸是一个非自然氨基酸。这个由PAD催化的多肽中精氨酸转化成瓜氨 酸的过程被称做瓜氨酸化（citrullination)。蛋白发生瓜氨酸化后由于结构发生变化，导 致其酶活性、代谢活性、调节功能和结构功能均发生改变。因此，瓜氨酸化是和磷酸化、乙酰 化、糖基化、甲基化、泛素化一样重要的蛋白翻译后修饰方式。
[0003] 近年来，通过免疫学、细胞生物化学和分子遗传学的研究，PAD4(肽基精氨酸脱亚 胺酶4, Peptidylarginine deiminase 4,或PADI4)被证明在人类类风湿性关节炎发病过 程中起着非常重要的作用，且可作为腺癌标志物，在制备腺癌临床诊断试剂中进行应用。 PADl (肽基精氨酸脱亚胺酶 1，Peptidylarginine deiminase 1，或 PADI1)和 PAD4 虽然同 为肽基精氨酸脱亚胺酶，但具有不同的组织分布，目前并未有关于PADl作为肿瘤血液标志 物的相关报道。
【发明内容】
[0004] 针对上述现有技术，本发明通过研究得到了一种新的肿瘤血液标志物一肽基精 氨酸脱亚胺酶I (PAD1/PADI1)，可用于肿瘤的临床诊断。
[0005] 本发明是通过以下技术方案实现的：
[0006] 本发明通过实验研究首次发现，与良性肿瘤患者血清、慢性炎症患者血清和正常 人血清相比，PADl在肝癌、结/直肠癌、乳腺癌、食管及贲门癌等恶性肿瘤患者血清中的表 达水平明显增高。PADl能同时在多种恶性肿瘤患者血清中表达，这在目前使用的肿瘤标 记物中是比较少的（目前肿瘤血液标记物敏感性和特异性不理想，临床现有肿瘤血清标记 物达20余种，但绝大多数往往只能用于检测一种肿瘤，敏感性和特异性差，通常只能采用 联合检测才能为临床诊断提供有意义的数据）。本发明将PADl在血液中的表达水平与已 知肿瘤标记物水平进行比较，发现PADl肿瘤检测阳性率和特异性不亚于CEA，广谱性高于 CA125、CA199、PSA、CA242 等。
[0007] 基于以上发现，PADl作为肿瘤血清标记物应用具有更高的特异性，为此，本发明研 发了诊断范围广、敏感性强、特异性高的肿瘤诊断试剂盒及检测方法，可广泛用于临床肿瘤 初步调查和健康普查，为临床诊断提供可靠依据。
[0008] 具体地，以常规方法制备抗肽基精氨酸脱亚胺酶1抗体，建立检测肽基精氨酸脱 亚胺酶1的定性或定量方法及配套试剂盒。
[0009] -种诊断肿瘤的血液诊断试剂，包括肽基精氨酸脱亚胺酶1抗体、HRP-IgG抗体， 以及血液诊断试剂中的常规试剂。
[0010] 所述血液诊断试剂中的常规试剂包括碳酸盐缓冲液、PBST洗液、封闭液、显色液和 终止液。
[0011] 进一步地，定性的检测方法为间接ELISA方法，其原理为利用酶标记的抗抗体（抗 人免疫球蛋白抗体）以检测与固相抗原结合的受检抗体，具体方式如下：
[0012] (1)将待检测血样用碳酸盐缓冲液（pH9. 6)稀释10倍后，加至空白酶标板中，37°C 温育2h ;
[0013] ⑵弃去孔内液体，PBST洗液洗板三次（所述PBST洗液是指PBS溶液加上 Tween-20, PBS溶液的pH为7. 4, Tween-20的浓度为0? 1 %，体积百分数）；
[0014] (3)每孔加封闭液（0? 5% BSA，质量百分数）200ii L/孔，37°C温育Ih ;
[0015] (4)弃去孔内液体，PBST洗液洗板三次；
[0016] (5)每组加PADl抗体稀释液（1:2000稀释）IOOii L/孔，37°C温育Ih ;
[0017] (6)弃去孔内液体，PBST洗液洗板三次；
[0018] (7)每孔加 HRP-IgG 抗体稀释液（1:3000 稀释）100ii L，37°C温育 Ih ;
[0019] (8)弃去孔内液体，PBST洗液洗板五次；
[0020] (9)每孔加显色液A、B【显色剂A (含过氧化氢）为供氢体（DH2)，底物B就是显 色剂B (含TMB，3, 3'，5, 5' -四甲基联苯胺）】各50 ii L，37°C显色lOmin。
[0021] (10)每孔加50 i! L终止液（2M H2SO4溶液）终止显色，振匀，用酶标仪检测OD45tol值；
[0022] (11)计算：以阴性血清（正常人血清）为对照，检测阴性血清OD45tlnm均值（是以 多份阴性血清为对照检测出来再平均的值）；将OD45tlnm值代入公式P/N值=待测血样OD45tol值/阴性血清OD45tlnm均值，计算得到待检测血样的P/N值；
[0023] (12)判断：若待检测血样的P/N值大于或等于2. 1，则该待检测血样的检测结果为 阳性，该待检测血样所属的患者有可能患有肿瘤，可作为临床诊断的依据之一。
[0024] 上述所涉及的抗体，为通过常规方法制备得到。上述所涉及的各种试剂，均为现有 技术中已有的常规试剂。
[0025] 同理，进行定量检测时，也采用上述检测原理，配制系列浓度的标准品，然后绘制 标准品浓度与OD45tlnm值或OD63tol值的标准曲线，并得到线性回归方程，然后将待检测血样的 OD45tol值或OD63tol值代入标准曲线，求得样品中的浓度。
[0026] 进一步地，定量检测时，采用双抗体夹心ELISA检测PAD1，步骤如下：
[0027] (1)包被：将PADl单克隆抗体1用包被液（pH9. 6的碳酸盐缓冲液）稀释成I ii g/ mL，加至空白酶标板中，100 ii L/孔，4°C饱和湿度下放置过夜；
[0028] (2)洗板：弃去孔内液体，每孔加入PBST洗液300 ii L (所述PBST洗液是指PBS溶 液加上Tween-20, PBS溶液的pH为7. 4, Tween-20的浓度0? 1 %，体积百分数），浸泡15秒， 甩弃液体。连续洗板三次；
[0029] (3)封闭：每孔加封闭液（0? 5% BSA，质量百分数）200ii L/孔，37°C温育Ih ;
[0030] (4)洗板三次，同步骤⑵；
[0031] (5)设定：留一孔作空白对照，暂不加任何液体；另设PADl标准品7孔，各加 100 y L标准品；
[0032] (6)加样：将待检测血样用PBST稀释10倍后，按顺序加至反应孔中，室温孵育 I. 5h ；
[0033] (7)洗板三次，同步骤（2);
[0034] (8)加酶：每个孔加入100 ii LHRP标记的PADl单克隆抗体稀释液（1/3000)(不包 括空白对照），室温孵育45min ;
[0035] (9)洗板三次，同步骤（2);
[0036] (10)显色：每孔依次加入显色液A、B【显色剂A(含过氧化氢）为供氢体（DH2)， 底物B就是显色剂B (含TMB，3, 3'，5, 5' -四甲基联苯胺）】各50 ii L (包括空白对照），震荡 混匀，室温避光显色10分钟；
[0037] (11)终止：每孔加入终止液各50 ii L (包括空白对照），震汤混勾终止反应；
[0038] (12)测定：用空白对照孔调零，并于30分钟内用酶标仪单波长450nm测定各孔OD 值；也可用双波长450nm/630nm测定各孔OD值；
[0039] (13)计算：以系列标准品浓度值的对数值为横坐标（X轴），以标准品OD值的对数 值为纵坐标（Y轴），建立（log-log)标准曲线，计算待测样本的PADl含量。
[0040] 另外，定性的检测方法也可为胶体金法，其检测原理为：采用双抗体夹心法和胶体 金免疫技术，在胶体金垫上预加入抗PADl抗体胶体金结合物，在硝酸纤维素膜的检测线和 对照线上分别包被有抗PADl抗体。当进行检测时，如为阳性样本，样本中的PADl可与金标 抗PADl抗体结合形成复合物，由于层析作用复合物沿试纸向前移动，再与检测线预包被的 抗体结合形成"金标抗体-PADl-抗体"复合物而凝集显色。硝酸纤维膜上同时包被有一条 质控线作为对照，故当出现一条红色质控线和一条红色反应线时判为阳性。当待检标本中 无PADl抗原时，只出现一条红色质控线判为阴性。作为质控，不管结果为阳性或阴性，都会 出现一条红色质控线。若无红线（或只有反应线）出现，则检测无效。具体的检测方法为：
[0041] (1)用洁净的容器收集少量样本（血清样本按常规方法静脉采集；采集的样本在 五天内检测，需放置4°C保存，五天以上需放置-20°C保存，避免反复冻融；如果样本出现浑 浊或沉淀，应离心或过滤澄清后再检测）；打开内包装，取出检测试纸。
[0042] (2)依据产品型号进行操作：
[0043] ①检测条：将检测条标有MX字样的一端浸入样本中30秒（注意：液面不要没过 MAX线）取出平放于台面上。
[0044] ②检测卡：在检测卡标有"S"字样的加样孔中，用滴管滴加4滴样本（约100 ill)。
[0045] (3)待检测条质控线（C线）出现后计时，20分钟内观察结果，20分钟以后观察结 果无效。
[0046] 检验结果的解释：
[0047] ⑴阴性结果：仅出现质控线（C线）。
[0048] (2)阳性结果：出现两条线，即质控线（C线）和检测线（T线）。
[0049] (3)无效结果：无线出现，或仅出现检测线（T线），须重新检测。
[0050] 本发明首次发现PADl可在子宫癌、肝癌、胃癌、食管癌、肺癌和卵巢癌等多种恶性 肿瘤的细胞中以及血液中高表达，因此，PADl可以作为肿瘤血液标志物进行应用，经实验证 明，其特异性不亚于CEA，广谱性高于CA242、CA125、PSA、CA199等。尽管PADl在多种肿瘤中 表达，达不到绝对的特异性，但是，所属领域技术人员公知，临床检测指标的特异性的非绝 对唯一并不能否定检测指标作为诊断相关疾病的手段之一的可行性，例如医生经常将几种 检测指标结合临床表现作出最后诊断。因此，PADl作为肿瘤标志物具有可行性；尽管PADl 具有非唯一的特异性，但将PADl作为肿瘤血液标志物结合其它检测指标及临床表现也足 以用于检测肿瘤（这种方式也是目前临床上的常见方式）。另外，本发明还发现，PADl还可 作为血液标志物应用于炎症等其他疾病的检测，如乙肝、普通炎症（具有白细胞、中性粒细 胞增多，淋巴细胞比率降低的症状）、肾病（包括肾病综合征、肾衰竭、肾炎）、尿毒症（包括 尿毒症和尿路感染），也可作为炎症等其它疾病的临床诊断依据之一。
【具体实施方式】
[0051] 下面结合实施例对本发明作进一步的说明。
[0052] 下述实施例中所涉及的试剂、方法等，若无特别说明，均为现有技术中的常规试 剂、方法。
[0053] 实施例I PADl作为肿瘤血液标志物的检测实例1
[0054] 以PADl作为肿瘤血液标志物，对肿瘤患者的血液进行检测，肿瘤患者的例数以及 所患肿瘤的种类详见表1。
[0055] 检测方法为：
[0056] (1)将待检测血样用碳酸盐缓冲液（pH9. 6)稀释10倍后，加至空白酶标板中，37°C 温育2h ;
[0057] (2)弃去孔内液体，PBST洗液洗板三次（所述PBST洗液是指PBS溶液加上 Tween-20, PBS溶液的pH为7. 4, Tween-20的浓度为0? 1 %，体积百分数）；
[0058] (3)每孔加封闭液（0? 5% BSA，质量百分数）200ii L/孔，37°C温育Ih ;
[0059] (4)弃去孔内液体，PBST洗液洗板三次；
[0060] (5)每组加PADl抗体稀释液（1:2000稀释）100 ii L/孔，37°C温育Ih ;
[0061] (6)弃去孔内液体，PBST洗液洗板三次；
[0062] (7)每孔加 HRP-IgG 抗体稀释液（1:3000 稀释）100 ii L，37°C温育 Ih ;
[0063] (8)弃去孔内液体，PBST洗液洗板五次；
[0064] (9)每孔加显色液A、B【显色剂A (含过氧化氢）为供氢体（DH2)，底物B就是显 色剂B (含TMB，3, 3'，5, 5' -四甲基联苯胺）】各50 ii L，37°C显色lOmin。
[0065] (10)每孔加50 ii L终止液（2M H2SO4溶液）终止显色，振匀，用酶标仪检测OD45tlnm 值；
[0066] (11)计算：以阴性血清（正常人血清）为对照，检测阴性血清OD45tlnm均值（是以 多份阴性血清为对照检测出来再平均的值）；将OD45tlnm值代入公式P/N值=待测血样OD45tol值/阴性血清OD45tlnm均值，计算得到待检测血样的P/N值；
[0067] (12)判断：若待检测血样的P/N值大于或等于2. 1，则该待检测血样的检测结果为 阳性。
[0068] 结果：阳性例数及阳性率见表1，其它肿瘤标志物的阳性率见表2(为现有技术中 能公开的数据），通过表1、表2可以看出，PADl作为肿瘤血液标志物，具有良好的特异性， 广谱性。
【权利要求】
1. 肽基精氨酸脱亚胺酶1在制备诊断肿瘤的临床诊断试剂或检测物中的应用。
2. 根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述肿瘤选自子宫癌、肝癌、胃癌、食管 癌、卵巢癌、肺癌。
3. 肽基精氨酸脱亚胺酶1在制备诊断炎症的临床诊断试剂或检测物中的应用，所述炎 症选自乙肝、普通炎症、肾病、尿毒症。
4. 根据权利要求1或2或3所述的应用，其特征在于：以常规方法制备抗肽基精氨酸 脱亚胺酶1抗体，建立检测肽基精氨酸脱亚胺酶1的定性或定量方法及配套试剂盒。
5. -种诊断肿瘤的血液诊断试剂，其特征在于：包括肽基精氨酸脱亚胺酶1抗体、 HRP-IgG抗体，以及血液诊断试剂中的常规试剂。
6. 根据权利要求5所述的诊断肿瘤的血液诊断试剂，其特征在于：所述肿瘤选自子宫 癌、肝癌、胃癌、食管癌、卵巢癌、肺癌。
7. 根据权利要求5或6所述的诊断肿瘤的血液诊断试剂，其特征在于：所述血液诊断 试剂中的常规试剂包括碳酸盐缓冲液、PBST洗液、封闭液、显色液和终止液。
8. -种诊断炎症的血液诊断试剂，其特征在于：包括肽基精氨酸脱亚胺酶1抗体、 HRP-IgG抗体，以及血液诊断试剂中的常规试剂；所述炎症选自乙肝、普通炎症、肾病、尿毒 症。
9. 根据权利要求8所述的诊断炎症的血液诊断试剂，其特征在于：所述血液诊断试剂 中的常规试剂包括碳酸盐缓冲液、PBST洗液、封闭液、显色液和终止液。
【文档编号】G01N33/573GK104360062SQ201410714949
【公开日】2015年2月18日 申请日期:2014年11月28日 优先权日:2014年11月28日
【发明者】常晓天, 邢艳秋, 马芳, 杨冬霞 申请人:山东创新药物研发有限公司