谷氨酰胺合成酶活性的调节的制作方法

专利名称：：谷氨酰胺合成酶活性的调节的制作方法
技术领域：
：本发明涉及用于抑制谷氨酰胺合成酶活性的物质和方法，更具体地涉及通过氨对Y-谷氨酰酶酰基中间体进行亲核进攻的假设机理来抑制谷氨酰胺合成酶形成谷氨酰胺的第二催化反应的物质和方法，以及涉及用于设计和使用该抑制剂的物质和方法。
背景技术：
：谷氨酰胺合成酶(GS，EC6.3丄2)是参与氮代谢并催化L-谷氨酸、ATP和氨可逆转化为L-谷氨酰胺、ADP和无机磷酸的核心酶。该反应通过，谷氨酰磷酸中间体调节。该酶的每个亚基需要至少两个二价金属离子(Me2+);本文中，二价金属离子结合位点被称为nl和n2。GS通过如下反应催化谷氨酸生物合成为谷氨酰胺Me2+谷氨酸+NH4++ATP—谷氨酰胺+ADP+Pi+H20其中，M^+代表选自镁或锰的二价金属阳离子。该反应经常被称为"生物合成"反应或"正"反应，并且认为与谷氨酰胺合成酶催化的反应在生理学上最为相关。，谷氨酰磷酸是通过ATP的，磷酸转移到谷氨酸的，羧基而形成的。磷酰基在这两种负电基团之间的有效转移通过n2金属配位来实现。现已接受的机理假设认为在此之后，通过氨置换磷酸以得到无机磷酸和谷氨酰胺ATP+谷氨酸—ADP+"谷氨酸-P八0+"谷氨酸^+1^114+—ADP+谷氨酰胺+&。在结构上，来自大肠杆菌(五sc^r/c/n'flco//)的GS酶是大分子金属酶(-600,000Mr)，具有12个相同的亚基，这些亚基排列在两个面对面的六角环形内，两个单体间形成两个活性位点，总计12个活性位点。可将每个活性位点描绘成"双漏斗"，其中ATP与谷氨酸分别结合在相对的末端。因为ATP结合位点向谷氨酰胺合成酶分子的六个外表面(externalsixfoldsurface)敞开，所以它被称为双漏斗的顶部。在双漏斗的连接处发现两个二价阳离子结合位点nl和n2。n2离子参与磷酰基的转移，而nl离子使谷氨酰胺合成酶保持在其活性形式并对谷氨酸的结合发挥作用。朝向nl附近双漏斗下半部的较大负电荷使得nl位点处对金属离子的亲合力比n2位点处大50倍。nl金属离子有三个谷氨酸残基侧链131、212和220作为配体，而n2金属离子有两个谷氨酸残基配体129和357，以及组氨酸269(Abell，LM，JSchineller,PJKeck和JVillafranca(1995)Biochemistry34:16695-16702)。作为金属离子配体的氨基酸在各种来源的谷氨酰胺合成酶中高度保守(PesoleG，MPBozzetti，CLanave，GPreparata禾口CSaccone(1991)ProceedingsoftheNationalAcademyofSciences,USA88:522-526)。(除非另外特殊说明，本文鉴定的所有的GS氨基酸残基数是指大肠杆菌co//)GS的残基。如果给出细菌GS多肽序列之间的同源性，本领域技术人员就能利用例如同源性比对或分子模拟等方法确定其它种的GS所关注的相应残基。)对于浸在含有各种配体的溶液中的谷氨酰胺合成酶晶体的构象变化与侧链移动已经有所描述(LiawS-H，JJVillafranca和DEisenberg(1993b)Biochemistry33:7999-8003;LiawS腸H和DEisenberg(1994)Biochemistry33:675-681;LiawS-H，GJun和DEisenberg(1994)Biochemistry33:11184-11188)。这些残基在低级和高级生物的谷氨酰胺合成酶中均绝对保守，并且在生物合成反应机理中发挥重要作用(EisenbergD,HSGill，GMUPfluegl和SHRotstein(2000)BiochemicaetBiophysicaActa1477:122-145)。Eisenberg(2000)记载的谷氨酰胺合成酶十二聚体的结构被认为含有几个具有重要功能的环(EisenbergD，HSGill，GMUPfluegl和SHRotstein(2000)BiochemicaetBiophysicaActa1477:122-145)。这些带有对应于大肠杆菌残基的残基数的环如下由亲水性残基156-173组成的环，其伸入十二聚体的中心通道，并且是蛋白水解和ADP核糖基化的位点。另一已知为腺苷酰化环的环，其含有酪氨酸397，通过加入AMP被共价修饰。该环恰好位于双漏斗底部入口外。.谷氨酸327翼，由残基323-330构成，其保护谷氨酸进入活性位点。该"翼"包围活性位点，保护，谷氨酰磷酸中间体不被水解。当该翼关闭时，谷氨酸327羧酸酯形成部分铵位点。天冬氨酸50'使铵离子去质子化形成氨。于是，氨进攻，谷氨酰磷酸中间体由此形成过渡态的四面体中间体。谷氨酸327翼接受来自四面体中间体的S-氨基的质子获得谷氨酰胺。*含有天冬氨酸50'的环，其位于N端结构域(残基1-100)。每个活性位点形成于十二聚体环内一个亚基的C端结构域和相邻亚基的N端结构域之间的界面处，因此大多数活性位点通过C端结构域的残基形成。天冬氨酸50'在活性位点的N端部分，认为其与铵底物结合，然后接受来自铵的质子，结果形成其后能进攻磷酸化-谷氨酰中间体的氨。天冬氨酸50'的位置通过核苷酸结合来控制。ADP与ATP由双漏斗顶部进入活性位点且磷酸链指向双漏斗内。ADP诱导精氨酸359与天冬氨酸50'作用并激发精氨酸344与天冬氨酸64'作用，为环内亚基间的稳定化提供额外接触。天冬氨酸50'的移动有助于形成铵结合位点，而精氨酸339的移动可能有助于磷酰基转移以及磷酸结合。有人认为通过诱导精氨酸359向谷氨酸的Y-羧酸酯氧中的一个移动，ADP结合还能增加谷氨酸的亲合力。最后，ADP的P-磷酸向n2离子、组氨酸269和组氨酸271转移谷氨酸129。已经进行了通过定点突变由其它氨基酸残基，即天冬氨酸、天冬酰胺、谷氨酸和谷氨酰胺来取代金属离子配体组氨酸269的研究。所有的突变酶均显示几乎无构象变化，并且仍能结合两个金属离子。用中性配体例如天冬酰胺和谷氨酰胺来取代组氨酸269稍微改变解离常数(3-4倍)，而用谷氨酸取代则稍微减小了解离常数。除H269E夕卜，突变对底物Km'几乎无影响，H269E的km显示出比野生型增加IOOO倍(Abell，LM，JSchineller，PJKeck禾卩JVillafranca(1995)Biochemistry34:16695-16702)。'发现天冬酰胺264在双漏斗下端谷氨酸入口附近的柔性环(残基255-266)上，并且与谷氨酸327翼相邻。当谷氨酸结合时，侧链向赖氨酸176的e-氨基摆动，当丙氨酸、甘氨酸和谷氨酰胺与谷氨酰胺合成酶复合时，发现也同样出现该现象。对这些环进行以上阐述的结果是可将谷氨酰胺合成酶的酶反应机理描述为一系列环和侧链的移动。在所提出的反应机理中，atp结合于双漏斗的顶部，以使其末端的磷酸基结合到n2离子的附近。该atp结合的结果是天冬氨酸50'环向铵离子随后将要结合的位点移动。然后，精氨酸359向谷氨酸的？羧酸酯基随后将要结合的位点移动。这些移动均增加了谷氨酸与铵结合的亲合力。随后，谷氨酸从双漏斗底部进入并结合到谷氨酸327翼上，并使其，羧酸酯基结合到nl离子的附近。谷氨酸的氨基移动天冬酰胺264环，辅助天冬氨酸50'环上的丝氨酸52'使上述翼稳定。这时，活性位点被包围并且与水隔离，完成铵结合。atp的y-磷酸转移到谷氨酸的y-羧酸酯上，由此形成中间体。两个正电金属离子和精氨酸359通过极化atp的，磷酸基使y-磷的正电性更强来参与磷酰基转移。铵离子进入双漏斗并在负电口袋中结合，所述的负电口袋由谷氨酸327、天冬氨酸50'、酪氨酸19、谷氨酸212和丝氨酸53'形成。天冬氨酸50'的侧链使铵离子去质子化形成氨，然后该氨进攻，谷氨酰磷酸中间体的S-碳，因此释放出磷酸基。这时，在四面体加合物和谷氨酸327之间形成盐桥，然后该盐桥接受加合物的质子，由此使盐桥中和并形成谷氨酰胺。最后，谷氨酸327翼打开，释放出谷氨酰胺。存在三种不同形式的谷氨酰胺合成酶GSI、GSn和GSIII。GSI形式只存在于细菌(真细菌)和古菌(古细菌)中。GSII存在于真核细胞和某些土壤细菌，而只在少数菌种中发现GSin基因。有两个重要的GSI亚门GSI-ct和GSI-P。在嗜热菌、低G+C革兰氏阳性菌和广古菌(包括产甲烷菌类、嗜盐菌类和一些嗜热菌类)中发现GSI-a基因，而在所有其它细菌中发现GSI-P基因。GSI-P酶通过腺苷酰化/去腺苷酰化级联被调节，并且还含有在GSI-a形式中不存在的25个氨基酸插入序列。具有GSI-P基因的细菌包括白喉棒状杆菌、淋球菌、大肠杆菌、鼠伤寒沙门氏杆菌、伤寒沙门氏杆菌、肺炎克雷伯菌、粘质沙雷氏菌、普通变形杆菌、痢疾志贺菌、霍乱弧菌、铜绿假单孢菌、粪产碱杆菌、幽门螺杆菌、流感嗜血杆菌、百日咳杆菌、支气管炎博德特菌、脑膜炎奈瑟菌、羊布鲁氏菌、结核分枝杆菌、麻风分枝杆菌、梅毒密螺旋体、问号钩端螺旋体、衣氏放线菌、星形诺卡菌、氧化亚铁硫杆菌、巴西固氮螺菌、鱼腥藻、Fremyelladiplosiphon和天蓝色链霉菌。GSI-a亚门的生物例子包括蜡状芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、炭疽芽孢杆菌、肺炎链球菌、化脓链球菌、金黄色葡萄球菌、肉毒梭菌、破伤风梭菌和产气荚膜梭菌。在具有GSI-P基因的大肠杆菌和其它细菌中，通过l个和12个GS亚基之间的腺苷酰化来调节GS活性。所有原核细菌的腺苷酰化位点(相当于大肠杆菌中的Tyr397)均表现出高度保守，而腺苷酰化程度与培养基中氮能源和碳能源的可利用性有关。具有10-12个腺苷酰化亚基的谷氨酰胺合成酶产生于过量氮和限量碳存在下生长的细胞中。GS的腺苷酰化还改变了酶对二价金属离子从Mg"到M+的特异性。丝氨酸蛋白酶抑制剂的研发和治疗用途已经体现在包括乙型肝炎病毒(HCV)的疾病和与凝血级联障碍有关的疾病，例如心肌梗塞、中风和深度静脉血栓。已经研发凝血酶、凝血因子Xa和凝血因子VIIIa复合物的抑制剂用作对血栓障碍和预防静脉血栓和动脉血栓的生物有效的口服抗凝血药。因为这些酶均属于丝氨酸蛋白酶的胰蛋白酶家族，所以它们具有结构类似的活性位点。已经设计了很多种对这些丝氨酸蛋白酶具有特异靶向的抑制剂。其中包括肽基-精氨酸醛衍生物(peptidyl-argininealdehydederivative)(Bajusz，S.,等(1997)WO97/46576)、吡咯并吡啶烷衍生物(pyrrolopyrrrolidenederivative)(Cooke，S.H.等(1998)，WO99/12935)、喹啉酮(Dudley,D.A.和J.J.Edmunds(1999)，WO99〃50263以及PastorR.M,，Artis，D.R.和A.G.Olivem(2002)，WO02/22575)。凝血酶和凝血因子Xa的双重抑制剂包括含有使用4-(l-甲基-苯并咪唑-z-基)-甲基氨基-苄脒作为基本支架的1-甲基-苯并咪唑部分的化合物(Nar，H.等人(2001)Structure,9:29-37)。
发明内容本公开内容部分基于此发现，即谷氨酰胺合成酶使用依赖于其腺苷酰化状态的两个类丝氨酸蛋白酶催化三联体中的一个，催化氨与在第一酶催化步骤形成的"谷氨酰磷酸的反应。本文所用的形成谷氨酰胺的GS活性位点在本文是指谷氨酰胺形成位点。虽然任何理论均没有发现，但是本发明者认为一种机理(通过该机理酶的腺苷酰化状态或去腺苷酰化状态影响酶对MgATP/NH4+或Mn2ATP/NH3的催化特异性)是通过诱导两个假设的催化三联体之间的转换。依赖于该酶的腺苷酰化状态，两个三联体中的一个参与激活的丝氨酸对第一反应的羧基-磷酸酐中间体，即Y-谷氨酰磷酸的亲核进攻，从而形成酰基酶中间体。然后，谷氨酰酰基中间体经历NH3的亲核进攻，从酶表面释放谷氨酰胺。两个催化三联体的存在符合此事实，即来源于大肠杆菌的谷氨酰胺合成酶对氨具有两个亲合常数(MeekTD和JJVillafranca(1980)Biochemistry19:5513-5519)。由于在氮过量和碳限量条件下产生腺苷酰化酶，在氮限量和碳过量条件下产生去腺苷酰化酶，NH4+7NH3的溶液化学也影响GS的调节。在低铵盐浓度下，NH4+离解为NH3+H+。NH3是强亲核体，能对所提出的Y-谷氨酰酰基酶中间体进行亲核进攻。此外，如下所示，通过已知的丝氨酸蛋白酶抑制剂AEBSF和PMSF进行的定点突变实验和GS活性抑制，进一步证明了通过两个类丝氨酸蛋白酶催化三联体的存在可调节谷氨酰胺合成酶反应的最终步骤。因此，在设计对腺苷酰化和/或去腺苷酰化谷氨酰胺合成酶特异的抑制剂过程中，可将丝氨酸蛋白酶催化三联体的化学和反应机理的知识与GS结构包括GS谷氨酰胺形成活性位点结构的知识结合。因此，本文提供一种设计试验抑制剂化合物的计算机辅助方法，以及用于试验化合物抑制活性的体外和体内筛选的方法。如此设计或筛选的化合物可用于抑制腺苷酰化或去腺苷酰化GS活性，并且因此治疗、预防或改善哺乳动物的细菌感染。因为通过腺苷酰化/去腺苷酰化级联可调节细菌GSI-P酶，但却不能调节哺乳动物的GSII酶，因此对腺苷酰化GS有抑制作用、但对去腺苷酰化GS没有或仅有最小抑制作用的化合物可用于选择性地抑制GSI-P细菌细胞的生长，同时对哺乳动物细胞的负面影响也被最小化。本文还提供用于抑制GS活性，包括腺苷酰化和去腺苷酰化GS活性的化合物和组合物；用于抑制或预防体外和体内细菌生长的化合物和组合物；以及用于治疗、预防或改善哺乳动物细菌感染的化合物和组合物。因此，在一个实施方式中，提供了一种产生谷氨酰胺合成酶多肽的谷氨酰胺形成活性位点活性的试验抑制剂的计算机辅助方法。所述方法使用包括处理器和输入设备的程序式计算机，所述方法包括(a)向所述输入设备输入包括谷氨酰胺形成活性位点结构的数据；(b)使用所述处理器将试验抑制剂分子对接到所述谷氨酰胺形成活性位点内；以及(c)基于所述对接，确定所述试验抑制剂分子是否抑制所述谷氨酰胺形成活性位点的活性。所述方法还可包括将"谷氨酰磷酸部分对接到所述活性位点内，和/或生成由步骤(c)确定的试验抑制剂以抑制所述谷氨酰胺形成活性位点的活性并体外评价所述试验抑制剂对谷氨酰胺合成酶多肽的抑制活性。体外评价包括使用能测量ATP水解、ADP形成、AMP形成、谷氨酸利用或谷氨酰胺形成的分析法(assay)。在有些实施方式中，所述方法还可包括体外评价相对于去腺苷酰化的谷氨酰胺合成酶多肽，所述试验抑制剂对腺苷酰化的谷氨酰胺合成酶多肽有差别的抑制活性，和/或生成所述试验抑制剂并评价所述试验抑制剂对含有GSI-a或GSI-卩谷氨酰胺合成酶基因的细菌生长的抑制活性。GSI-I3细菌可选自白喉棒状杆菌、淋球菌、大肠杆菌、鼠伤寒沙门氏杆菌、伤寒沙门氏杆菌、肺炎克雷伯菌、粘质沙雷氏菌、普通变形杆菌、痢疾志贺菌、霍乱弧菌、铜绿假单孢菌、粪产碱杆菌、幽门螺杆菌、流感嗜血杆菌、百日咳杆菌、支气管炎博德特菌、脑膜炎奈瑟菌、羊布鲁氏菌、结核分枝杆菌、麻风分枝杆菌、梅毒密螺旋体、问号钩端螺旋体、衣氏放线菌、星形诺卡菌、氧化亚铁硫杆菌、巴西固氮螺菌、鱼腥藻、Fremyelladiplosiphon和天蓝色链霉菌，以及GSI-a细菌可选自蜡状芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、炭疽芽孢杆菌、肺炎链球菌、化脓链球菌、金黄色葡萄球菌、肉毒梭菌、破伤风梭菌和产气荚膜梭菌。在有些实施方式中，所述方法可包括评价所述试验抑制剂对真核细胞(例如哺乳动物(例如人)细胞)生长的抑制活性。另一方面，本文提供一种产生抑制谷氨酰胺合成酶多肽的谷氨酰胺形成活性位点活性的化合物的方法，所述方法包括(a)提供谷氨酰胺合成酶多肽的谷氨酰胺形成活性位点的三维结构；以及(b)基于所述三维结构，设计能抑制所述谷氨酰胺形成活性位点和，谷氨酰磷酸中间体之间相互作用的试验化合物。在有些实施方式中，所述试验化合物能抑制所述谷氨酰胺形成活性位点的腺苷酰化催化三联体位点和，谷氨酰磷酸中间体之间的相互作用，或者能抑制所述谷氨酰胺形成活性位点的去腺苷酰化催化三联体位点和"谷氨酰磷酸中间体之间的相互作用。在有些实施方式中，试验化合物能抑制在所述谷氨酰胺形成活性位点的腺苷酰化催化三联体位点中酰基-酶中间体的形成，或者能抑制在所述谷氨酰胺形成活性位点的去腺苷酰化催化三联体位点中酰基-酶中间体的形成。所述方法还可包括生成步骤(b)的所述试验化合物并体外评价所述试验化合物对谷氨酰胺合成酶多肽的抑制活性，和/或评价所述试验化合物对含有GSI-a或GSI-j3谷氨酰胺合成酶基因的细菌生长的抑制活性。在有些情况下，所述方法可包括评价所述试验化合物对真核细胞(例如哺乳动物的(例如人)细胞)生长的抑制活性。另一方面，本文提供一种产生抑制谷氨酰胺合成酶多肽的谷氨酰胺形成活性位点的催化三联体位点活性的试验化合物的方法。所述方法可包括(a)提供包括谷氨酰胺形成活性位点的催化三联体位点的三维结构；以及(b)基于所述三维结构，设计能形成带有所述催化三联体位点的残基的酰基-酶中间体的试验化合物。在有些实施方式中，所述试验化合物能形成带有对应于大肠杆菌的谷氨酰胺合成酶多肽的Ser52或Ser53的结构中的残基的酰基-酶中间体。在另一实施方式中，提供一种体外筛选试验蛋白酶抑制剂化合物以确定其是否抑制谷氨酰胺合成酶多肽的谷氨酰胺形成活性位点活性的方法，其中所述方法包括(a)使谷氨酰胺合成酶多肽与试验蛋白酶抑制剂化合物接触；以及(b)确定相对于还没有与所述试验丝氨酸蛋白酶抑制剂化合物接触过的谷氨酰胺合成酶多肽的活性，所述谷氨酰胺合成酶多肽的谷氨酰胺形成活性位点的活性是否有所降低。通过使用能测量ATP水解、ADP形成、AMP形成、谷氨酸利用或谷氨酰胺形成的分析法，可测量所述谷氨酰胺形成位点的活性。所述试验蛋白酶抑制剂化合物可以是试验丝氨酸蛋白酶抑制剂化合物。在有些实施方式中，试验蛋白酶抑制剂的文库(例如试验丝氨酸蛋白酶抑制剂的文库)逐一与谷氨酰胺合成酶多肽接触。在另一实施方式中，提供一种用于抑制GS多肽的谷氨酰胺形成活性位点活性的体外方法，所述方法包括使GS多肽与含有丝氨酸蛋白酶抑制剂的组合物接触。该丝氨酸蛋白酶抑制剂可以是肽基-精氨酸醛衍生物、吡咯并吡咯垸酮衍生物、喹啉酮衍生物或1-甲基苯并咪唑衍生物。还提供一种用于抑制含有GSI-a或GSI-卩基因的细菌生长的体外方法，所述方法包括使所述细菌与含有丝氨酸蛋白酶抑制剂的组合物接触。在又一实施方式中，提供一种用于治疗、预防或改善与哺乳动物细菌感染有关的一种或多种症状或障碍的方法，其中所述细菌感染由含有GSI-a或GSI-P基因的细菌引起。所述方法可包括将含有丝氨酸蛋白酶抑制剂的组合物给予所述哺乳动物。此外，还提供一种用于抑制谷氨酰胺合成酶多肽的谷氨酰胺形成位点活性的体内方法，其中所述方法包括将含有丝氨酸蛋白酶抑制剂的组合物给予怀疑遭受或正在遭受细菌感染的哺乳动物，其中所述细菌感染由含有GSI-a或GSI-P基因的细菌引起。除非另有定义，本文所用的所有技术术语和科学术语与本发明所属
技术领域：
的普通技术人员所普遍理解的意义相同。如有冲突，本文件包括定义将决定保护范围。尽管与本文记载的方法和材料类似或等同的方法和材料也可用于实施本发明或对本发明进行试验，但以下记载了优选的方法和材料。所有的出版物，专利申请、专利及其它参考文献均以整体引入本文。本文公开的材料、方法和实施例只用于说明而没有限制本发明的意图。从以下说明、附图和权利要求书中将明显看出本发明的其它特征和优点，例如抑制腺苷酰化GS的活性和由此用于治疗细菌感染的方法。图1示出了在高氨浓度条件下，腺苷酰化谷氨酰胺合成酶在谷氨酰胺形成活性位点处的假设反应机理，其中需要NHU+的去质子化。所述机理由左上方的非共价的米氏(Michaelis)复合物开始。接下来，形成第一四面体过渡态，随后形成酰基-酶中间体、释放磷酸和通过Asp50'或该酰基中间体对铵进行去质子化。然后发生氨对酰基中间体的亲核进攻并形成第二四面体过渡态，随后释放谷氨酰胺并回到非共价的米氏复合物。图2示出了在低氨浓度条件下，去腺苷酰化谷氨酰胺合成酶在谷氨酰胺形成活性位点处的假设反应机理。所述机理由左上方的非共价米氏复合物开始。接下来，形成第一四面体过渡态，随后形成酰基-酶中间体和释放磷酸。然后发生氨对阳碳离子的亲核进攻并形成第二四面体过渡态，随后释放谷氨酰胺并回到非共价米氏复合物。具体实施例方式定义除非另有说明，术语"GS多肽"和"谷氨酰胺合成酶多肽"在本文中可互换使用，是指例如来自GSI-a或GSI-P细菌的细菌GSI多肽。除非另有说明，该术语包括全长的多肽及其片段。此外，正如本领域技术人员将公认的那样，GS可作为体内十二聚体，GS活性位点可由来自于一个以上单体的氨基酸组成。因此，该术语还包括全长GS的多聚体(例如二聚体、三聚体、四聚体、五聚体、六聚体、七聚体、八聚体、九聚体、十聚体、十一聚体和十二聚体)、GS片段的多聚体、作为一个或多个GS活性位点一部分的一个或多个残基(例如一组残基，所述残基可能在GS的一级序列中不邻接和/或来自于不同单体，但却组成GS活性位点的至少一部分)以及这些组合的多聚体。"多肽"和"蛋白"可互换使用，是指无论长度或翻译后修饰，氨基酸的任意肽连接链(peptide-linkedchain)。术语"分离的"可指没有自然存在的对应物或已经从与之自然相伴的成分例如下列组织或体液中分离或纯化的多肽，所述组织例如是胰腺、肝、脾、卵巢、睾丸、肌肉、关节组织、神经组织、胃肠组织或肿瘤组织(例如乳腺癌或结肠癌组织)；所述体液例如是血液、血清或尿，或是从细菌或真菌培养液中分离或纯化的多肽。通常，当至少70%干重的多肽不含有与之自然相关联的蛋白和其它自然存在的有机分子时，认为多肽是"分离的"。优选地，多肽制剂是至少80%、更优选至少90%和最优选至少99%干重的多肽。因为化学合成的多肽其本身是从与之自然共存的成分中分离出来的，所以合成的多肽是"分离的"。分离的多肽可以例如通过从天然来源(例如从组织)提取、通过编码多肽的重组核酸的表达或通过化学合成来获得。因为必定不含有与之自然相伴的成分，因此在与自然产生多肽来源不同的细胞体系内产生的多肽是"分离的"。通过任何适合的方法，例如柱层析、聚丙烯酰胺凝胶电泳或HPLC分析可以测量分离或纯化的程度。在检测之前，通过本领域已知的方法和本文记载的方法可对任何多肽进行修饰，例如腺苷酰化、磷酸化或糖基化。本文使用的化合物的"药学上可接受的衍生物"包括盐、酯、烯醇醚、烯醇酯、縮醛、縮酮、原酸酯、半縮醛、半縮酮、酸、碱、溶剂合物、水合物或其前体药物。使用用于这些衍生的已知方法，本领域技术人员可以很容易地制备这些衍生物。将生成的化合物给予动物或人而没有实质性的毒性作用，并且该化合物具有药学活性或者为前体药物。药学上可接受的盐包括胺盐，例如N,N'-二节基乙二胺、氯普鲁卡因、胆碱、氨、二乙醇胺和其它羟垸基胺、乙二胺、N-甲基葡糖胺、普鲁卡因、N-苄基苯乙胺、l-对-氯苄基-2-吡咯垸-l'-基甲基-苯并咪唑、二乙胺和其它垸基胺、哌嗪和三(羟甲基)氨基甲垸，但不限于此；碱金属盐，例如锂盐、钾盐和钠盐，但不限于此；碱土金属盐，例如钡盐、f!盐和镁盐，但不限于此；过渡金属盐，例如锌盐，但不限于此；和其它金属盐，例如磷酸氢钠和磷酸二钠，但不限于此；还包括但不限于硝酸盐、硼酸盐、甲磺酸盐、苯磺酸盐、甲苯磺酸盐、无机酸盐(例如盐酸盐、氢溴酸盐、氢碘酸盐和硫酸盐，但不限于此)；以及有机酸盐，例如醋酸盐、三氟乙酸盐、马来酸盐、草酸盐、乳酸盐、苹果酸盐、酒石酸盐、柠檬酸盐、苯甲酸盐、水杨酸盐、抗坏血酸盐、琥珀酸盐、丁酸盐、戊酸盐和延胡索酸盐，但不限于此。药学上可接受的酯包括酸基的烷基酯、烯基酯、炔基酯、芳基酯、杂芳基酯、芳垸基酯、杂芳垸基酯、环烷基酯和杂环酯，但不限于此，其中所述酸基包括羧酸、磷酸、次磷酸、磺酸、亚磺酸和硼酸，但不限于此。药学上可接受的烯醇醚包括式C-C(OR)表示的衍生物，其中R为氢、垸基、烯基、炔基、芳基、杂芳基、芳烷基、杂芳烷基、环垸基或杂环基，但不限于此。药学上可接受的烯醇酯包括式C-C(OC(O)R)的衍生物，其中，R为氢、垸基、烯基、炔基、芳基、杂芳基、芳烷基、杂芳垸基、环烷基或杂环基，但不限于此。药学上可接受的溶剂合物和水合物为一个或多个溶剂或水分子与化合物的复合物，或1-约100个、或1-约10个、或1-约2个、1-约3个或1-约4个溶剂或水分子与化合物的复合物。本文使用的治疗意指以任何方式使细菌感染例如结核分枝杆菌感染的一种或多种症状得以改善或发生其它有利地改变。治疗还包括本文所述的组合物的任何药物用途，例如用于治疗与细菌感染有牵连的疾病、障碍或失调的用途。本文使用的通过给予特定化合物或药物组合物使特定障碍的症状得以改善是指任何可归因于组合物给予或与组合物给予有关的减轻，无论这种减轻是持久的或临时的、持续的或短暂的。本文所用的ICso是指在测量响应的方法中，对最大响应的抑制达到50%的特定试验化合物的量、浓度或剂量。本文所用的术语Ki代表酶/抑制剂复合物的解离常数。Ki理论上与被抑制剂试验的底物无关。使用方程式K产ICsZKm/(S+Km)由ICso可计算Ki，其中，S是底物浓度，Km是反应速度为最大值一半时的底物浓度(在没有抑制剂时)。用于抑制特定底物(固定Km)的抑制剂的Ki是常数。本文所用的ECso是指达到50%抑制时的药物浓度，以及CCso是指达到50%毒性时的药物浓度。本文所用的前体药物是经体内给予，通过一个或多个步骤或过程被代谢、或通过另外的方式被转化为该化合物在生物学上、药学上或治疗学上的活性形式。为生成前体药物，对药学上的活性化合物进行修饰以使该活性化合物通过代谢过程再生。可以设计前体药物以改变其代谢稳定性或药物转运特性、掩盖副作用或毒性、改善药物味道或改变药物的其它特性或性质。本领域技术人员一旦获知具有药学活性的化合物，可通过体内药物动力学过程和药物代谢的知识设计该化合物的前体药物(参见例如Nogrady(1985)MedicinalChemistryABiochemicalApproach,OxfordUniversityPress,NewYork,388-392)。本文所用的关于化合物"相当纯的"是指足够均一以至于当使用本领域技术人员评价纯度使用的标准分析方法，例如薄层层析法(TLC)、凝胶电泳法、高效液相色谱法(HPLC)和/或质谱法(MS)进行测定时，显示不含有容易检测的杂质，或足够纯以至于进一步纯化不会检测到物质的物理性质和化学性质(例如酶活性和生物活性)的改变。本领域技术人员已知用于对化合物进行纯化以产生化学上相当纯的化合物的方法。然而，化学上相当纯的化合物可以是立体异构体的混合物。在这种情况下，进一步纯化可增加化合物的比活性。除非另有说明，本文所用的任何保护基、氨基酸和其它化合物的縮写均符合它们的惯常用法、公认的縮写或IUPAC-IUB委员会对于生物化学命名的规定(参见(1972)Biochem.11:942-944)。GS活性位点的抑制剂的设计方法本文提供用于设计结合到和/或抑制GS(特别是来自GSI细菌的GS多肽)的谷氨酰胺形成活性位点的化合物的方法，包括基于计算机的方法。如本文进一步描述的，认为GS的谷氨酰胺形成活性位点催化氨对Y-谷氨酰酰基酶中间体的亲核进攻从而形成谷氨酰胺。该谷氨酰胺形成活性位点可包括一个或多个类丝氨酸催化三联体，例如本文所述的腺苷酰化和/或去腺苷酰化的GS催化三联体。本发明者已提出假设，依赖于腺苷酰化状态，谷氨酰胺合成酶利用两个类丝氨酸蛋白酶催化三联体中的一个来催化氨与在第一GS酶催化步骤中形成的"谷氨酰磷酸的反应。依赖于该酶的腺苷酰化状态，两个三联体中的一个参与激活的丝氨酸对第一反应的羧基-磷酸酐中间体，即"谷氨酰磷酸的亲核进攻，从而形成酰基酶中间体。然后，该谷氨酰酰基中间体经历NH3的亲核进攻，从酶表面释放谷氨酰胺。因此，通过分析一个或两个催化三联体，本领域技术人员会知道如何使用标准分子模拟或其它技术来鉴定肽、拟肽和小分子，所述肽、拟肽和小分子例如通过结合到和/或抑制GS的谷氨酰胺形成活性位点含有的一个或两个催化三联体的活性，可以结合到和/或抑制GS的谷氨酰胺形成活性位点，从而抑制亲核进攻活性。例如，小分子可以与位点中的某些氨基酸(例如催化三联体氨基酸)直接作用来抑制假设反应机理，或者可在变构位点作用，所述变构位点即不直接参与催化活性但化合物与其结合会导致(例如通过诱导分子中构象发生变化)活性抑制的分子区域。"分子模拟"是指基于三维结构信息和作用模型的物理作用的结构和功能的定量和/或定性分析。这包括常规的基于数字的分子动力学和能量最小化模型、交互式计算机图形模型、修饰分子力学模型、距离几何和基于其它结构的约束模型。通常使用计算机进行分子模拟以及可以使用已知方法进一步优化。设计特异性(例如以高的亲合力)结合到包括一个或两个催化三联体的谷氨酰胺形成活性位点的化合物的方法，通常也是基于计算机，并且涉及使用具有能产生原子模型的程序的计算机。使用X射线结晶数据的计算机程序对于设计这些化合物尤其有用。例如，程序(例如RasMol)可用于产生以下物质的三维模型，例如去腺苷酰化或腺苷酰化的GS、去腺苷酰化或腺苷酰化GS的片段、或构成去腺苷酰化或腺苷酰化GS的全部或部分谷氨酰胺形成活性位点的一组残基，例如构成去腺苷酰化或腺苷酰化GS的催化三联体活性位点的残基。计算机程序，例如INSIGHT(Accelrys，Burlington,MA)、Auto-Dock(Accelrys)和DiscoveryStudio1.5(Accelrys)允许进一步处理并且具备引入新结构的能力。可使用例如计算机硬件或软件或二者的组合设计化合物。然而，优选以一个或多个程序式计算机上执行的一个或多个计算机程序来实施设计，每个程序式计算机均包括处理器和至少一个输入设备。计算机优选还包括数据存储系统(包括非永久性和永久性的存储器和/或存储元件)以及至少一个输出设备。使用程序代码输入数据来实现上述功能并产生输出信息。以已知的方式将输出信息应用到一个或多个输出设备上。计算机例如可以是常规设计的个人计算机、微机或工作站。优选以高水平的过程化程序设计语言或面向对象的程序设计语言来执行每个程序从而与计算机系统进行交流。然而，若需要，可以汇编语言或机器语言来执行程序。在任何情况下，所述语言可以是编译型语言或解释型语言。优选将每个计算机程序存储使用通用的或专用的可编程计算机即可读取的存储介质或设备(例如ROM或磁盘)上。当程序被计算机读取时，该计算机程序的作用是设置和操作计算机执行本文所述的程序。还可通过设置计算机程序的计算机可读存储介质来实施本发明的方法，其中如此设置的所述存储介质使计算机以特定和预设的方式操作从而实现本文所述的功能。例如，在设计试验化合物的方法中需要计算机的步骤可包括(a)例如通过键盘、磁盘或磁带向输入设备输入数据，所述数据(例如原子坐标)限定结合到第二分子或复合物的第一分子或复合物的三维(3-D)结构，所述第一分子或复合物例如是腺苷酰化的GS、去腺苷酰化GS;去腺苷酰化GS或腺苷酰化GS的一部分(例如构成一些或全部谷氨酰胺形成活性位点的一组残基，例如构成一个或两个催化三联体的残基)，它们中的任一个可包括一个或多个结合的ATP、ADP、谷氨酰胺或谷氨酸分子，所述第二分子或复合物例如是ATP、ADP、谷氨酰胺、谷氨酸、"谷氨酰磷酸；以及(b)使用处理器测定参与结合到第二分子或复合物的第一分子或复合物上的位点的3-D结构(例如原子模型)。应该注意的是，尽管原始的GS3-D结构来自一个种，但是本领域技术人员可通过标准方法，例如同源性比对或分子模拟来确定其它种的GS所关注的相应残基。从由此方式获得的信息，本领域技术人员能设计和制造具有适合3-D结构的抑制性化合物(例如肽、非肽小分子、拟肽和适体(例如核酸适体))。例如，本领域技术人员可设计与第一分子或复合物的某些残基可相互作用的抑制性化合物。因此，在步骤(b)后，基于三维结构，可设计能抑制例如谷氨酰胺形成活性位点和Y-谷氨酰磷酸中间体之间相互作用的试验化合物，例如能抑制谷氨酰胺形成活性位点的腺苷酰化催化三联体位点和Y-谷氨酰磷酸中间体之间相互作用的试验化合物，或能抑制谷氨酰胺形成活性位点的去腺苷酰化催化三联体位点和Y-谷氨酰磷酸中间体之间相互作用的试验化合物。在有些实施方式中，可将试验化合物设计为能抑制谷氨酰胺形成活性位点的腺苷酰化催化三联体位点中酰基-酶中间体的形成，或能抑制谷氨酰胺形成活性位点的去腺苷酰化催化三联体位点中酰基-酶中间体的形成。此外，如果获得用于候选化合物的计算机可用的3-D数据(例如，X-射线结晶数据)，结合上述基于计算机的步骤(a)和(b)，可进行一个或多个以下基于计算机的步骤(c)例如通过键盘、磁盘或磁带向输入设备输入限定候选化合物三维(3-D)结构的数据(例如原子坐标)；(d)使用处理器测定所述候选化合物的3-D结构(例如原子模型)；(e)使用所述处理器确定候选化合物是否结合到第一分子或复合物上的位点；以及(f)将候选化合物鉴定为抑制第一和第二分子或复合物之间相互作用的化合物。该方法可包括另外的步骤，即向输出设备输出该化合物的3-D结构的模型。此外，可将候选化合物的3-D数据与例如在数据存储系统中存储的3-D结构的计算机数据库相比较。在有些实施方式中，产生谷氨酰胺合成酶多肽的谷氨酰胺形成活性位点(例如催化三联体活性)的试验抑制剂的计算机辅助方法可包括(a)向输入设备输入包括GS的谷氨酰胺形成活性位点的结构或亚结构(例如催化三联体)的数据；(b)使用处理器将试验抑制剂分子对接到该结构内；以及(c)基于所述对接，确定试验抑制剂分子是否抑制谷氨酰胺形成活性位点(例如催化三联体)的活性。使用其它基于结构的设计/模拟技术(参见例如Jackson(1997)Sem,"fl^s/"0"co/ow24:L164-172;和Jones等人(1996)丄A/ecf.C/zew.39:卯4-917)，由本文所述化合物的结构信息还可交互设计本发明的化合物。还可通过例如使用计算机模拟鉴定候选化合物以将本发明的化合物和多肽鉴定为在空间上且选择性地(即以高的亲合力)与谷氨酰胺形成活性位点相配合。然后，以本领域技术人员熟悉的标准的细胞抑制方法、或无细胞酶抑制方法、或酶抑制方法来检测上述鉴定的候选化合物。本文描述了示例性的方法。可由通过各种方法获得的数据来测定生物大分子(例如GS、腺苷酰化GS、核酸、碳水化合物和脂质)的3-D结构。已经最有效地用于评价蛋白3-D结构的这些方法包括(a)X射线晶体法；(b)核磁共振(NMR)光谱法；(c)大分子上确定位点之间形成的物理距离约束的分析，例如蛋白上残基之间的分子内化学交联(例如国际专利申请号PCT/US00/14667，其公开内容以整体引入本文作为参考)，以及(d)基于所关注蛋白的一级结构知识的分子模拟方法，例如使用计算机程序例如MONSSTER(ModelingOf^[ewStructuresfromSecondaryandIertiaryRestraints)(参见例如国际专利申请号PCT/US99/11913，其公开内容以整体引入本文作为参考)的同源建模技术、线程算法或从头开始结构建模。还可使用符合本发明的其它分子模拟技术(例如Cohen等人(19%)J.Med.Chem.33:883-894;Navia等人(1992)CurrentOpinionsinStructuralBiology,2，202-210，其公开内容以整体引入本文作为参考)。所有这些方法产生的数据均可受计算机分析的指导。还可用于本发明方法、但目前不提供有关生物分子原子水平结构详情的其它光谱法，包括圆二色谱法、荧光色谱法以及紫外/可见光吸收光谱法。优选的分析方法是X射线晶体法。下面对该方法和NMR光谱法进行描述。X射线晶体法X射线晶体法是在所关注区域的晶体中，通过围绕原子核的电子云，基于特征波长的X射线衍射。该技术使用纯化的生物大分子(但是这些生物大分子常常包括溶剂组分、辅因子、底物或其它配体)的晶体来测定构成特定生物大分子的原子的接近原子级的分辨率。通过X射线晶体法揭示大分子3-D结构的先决条件是能强烈衍射X射线的有序晶体。该方法将一束X射线照射到许多相同分子的有序、重复的阵列以使X射线由该阵列以可恢复单个分子结构的模式衍射。有序晶体，例如球蛋白分子的有序晶体是具有不规则表面的、大的、球形物或椭圆形物。在单个分子之间，晶体含有大孔道。这些通常占到晶体体积一半以上的孔道被无序的溶剂分子所填充，蛋白分子只在少数小区域处彼此接触。这就是为何晶体内蛋白结构通常与溶液中蛋白结构相同的一个原因。GS已被多次结晶化，例如来自鼠伤寒沙门氏杆菌的GS(Almassy，R.J.等人(1986)Nature(London)323:304-309，Liaw，S-H.等人(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)90:4996-5000);在活性位点中带有甘氨酸、丙氨酸和丝氨酸的GS(Liaw，S-H和D.Eisenberg(1994)J.Biol.Chem.33:675-681);在5个结构的活性位点中带有AMPPNP、谷氨酸、L-蛋氨酸-S-亚砜酰亚胺、谷氨酰胺和ADP的GS(Liaw，S-H.，Jun，G.和D,Eisenberg(1993)ProteinScience,2:470-471);以及在活性位点中带有ATP的GS(Liaw，S-H.，Jun，G和D.Eisenberg(1994)Biochemistry33:11184-11188)。以下描述或本领域技术人员己熟知获得GS或GS片段包括腺苷酰化的GS的方法。晶体的形成依赖于一些不同的参数，包括pH、温度、生物大分子浓度、溶剂和沉淀剂的性质、以及存在的添加离子或蛋白配体。需要许多常规结晶实验以筛选用于所有这些参数的组合，所述参数的组合可得到适于X射线衍射分析的晶体。结晶自动机械可以使结晶实验的大量再现性工作实现自动操作并得到加速(参见例如美国专利号5,790,421)。多肽结晶发生在多肽浓度超过其最大溶解度的溶液中(即，多肽溶液是过饱和的)。该溶液可通过降低多肽浓度恢复平衡，所述降低多肽浓度优选通过多肽晶体的沉淀。通常，通过添加改变多肽表面电荷或干扰多肽与本体水之间相互作用的试剂以促进引起结晶的缔合，诱导多肽从过饱和溶液中结晶。结晶通常在4。C到20。C之间进行。常常使用已知用作"沉淀剂"的物质，通过在多肽分子周围形成在能量上不利的沉淀耗尽层，来减小多肽在浓溶液中的溶解度(Weber(1991)AdvancesinProteinChemistry,41:1-36)。除沉淀剂之外，有时还向多肽结晶溶液添加其它物质。这些物质包括调节溶液pH的缓冲剂和降低多肽溶解度的盐。本领域已知有各种沉淀剂，包括以下所列乙醇、3-乙基-2,4戊二醇和许多聚乙二醇类例如聚乙二醇(PEG)。沉淀溶液可包括例如13-24%PEG4000、5-41%硫酸铵和1.0-1.5M氯化钠，并且pH在5-7.5范围。其它添加剂可包括O.IMHepes、2-4%丁醇、O.IM或20mM醋酸钠、50-70mM柠檬酸、120-130mM磷酸钠、ImM乙二胺四乙酸(EDTA)和ImM二硫苏糖醇(DTT)。将这些试剂在缓冲液中制备，并以各种组合逐滴添加到结晶缓冲液中。通常使用的多肽结晶方法包括以下技术间歇式结晶、悬滴式结晶、晶种引发式结晶以及透析。在上述每种方法中，重要的是通过保持溶液过饱和而形成晶核后促进连续结晶。在间歇式结晶方法中，多肽与沉淀剂混合以达到过饱和，将容器密封并搁置直至晶体出现。在透析方法中，将多肽保留在密封透析膜中，将所述密封透析膜置于含有沉淀剂的溶液中。膜的整体平衡增大了多肽和沉淀剂的浓度，由此使多肽达到过饱和水平。在优选的悬滴式结晶技术(McPhe醒(1976)J.Biol,Chem.，251:6300-6306)中，将沉淀剂添加到多肽浓溶液中生成初始多肽混合物。多肽和沉淀剂的浓度应为使多肽在此初始形式下不结晶。将一小滴该混合物置于载玻片上，将所述载玻片倒置并悬挂于第二溶液的贮液池上方。然后将系统密封。通常，第二溶液含有较高浓度的沉淀剂或其它脱水剂。沉淀剂浓度的差异使该蛋白溶液的蒸汽压比第二溶液高。因为含有两种溶液的系统是密封的，所以建立平衡，水由多肽混合物转移到第二溶液。该平衡使多肽溶液中的多肽和沉淀剂的浓度增大。在多肽和沉淀剂的临界浓度，可形成多肽的晶体。结晶的另一方法将晶核形成位点引进多肽浓溶液。通常，制备多肽浓溶液并将多肽晶种引入该溶液。如果多肽和任意沉淀剂的浓度适宜，晶种会提供晶核形成位点，较大晶体在此晶核形成位点周围形成。此外，结晶的另一方法是电结晶法，在该方法中，利用在电极邻近的Helmholtz层内自动排列(self-align)的蛋白大分子的偶极矩(参见美国专利号5,597,457)。有些蛋白可能抗拒结晶。然而，本领域技术人员可使用几种技术诱导结晶。例如，除去蛋白氨基或羧基端的柔性多肽部分可促进生成结晶蛋白样品。可使用分子生物学技术或使用蛋白酶例如胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶或枯草杆菌蛋白酶处理蛋白以除去这些部分。在衍射实验中，由X射线源获取窄且平行的X射线光束并照射到晶体上以产生衍射光束。入射主射束对大分子和溶剂分子均造成损害。因此，使晶体冷却(例如冷却到-220。C至-50。C)以延长其寿命。主射束必须从多个方向射击晶体以产生所有可能的衍射点，因此，在实验期间，晶体在光束内旋转。将衍射点记录在胶片上或通过电子检测器记录。必须将曝光的胶片在扫描设备内进行数字化和量化，而电子检测器将其检测到的信号直接输入计算机。电子区域检测器显著减少采集和测量衍射数据所需的时间。以胶片上的点得以记录的每束衍射光使用三种性质来定义振幅，根据点的强度来测量；波长，根据X射线源来设定；以及相位，其在X射线实验中损失。为了测定引起衍射光束的原子位置，所有衍射光束均需要所有这三种性质。测定相位的一种方式叫作多重同晶置换(MIR)，它需要将外源X射线散射体(例如金属原子等重原子)引入晶体的晶胞。关于MIR更为详细的描述，参见美国专利号6,093,573的第15栏。原子坐标是指由涉及数据傅立叶合成的数学方程式得到的笛卡尔坐标(x、y和z位置)，所述数据是由晶体形式的所关注的生物大分子的原子(散射中心)的单色X射线衍射而获得的图案得到的。衍射数据用于计算晶体内重复单元(晶胞)的电子密度图。电子密度图用于确定晶体的晶胞内各个原子的位置(原子坐标)。因为归属于原子坐标的绝对值可通过延x、y和/或z轴一起或分别转动和/或平移而改变，但却保持原子之间的相对空间关系不变，因此原子坐标的绝对值表示原子之间的空间关系。因此，生物大分子(例如蛋白)，其一组绝对原子坐标值可通过转动和/或平移调节为与另一样品分析的一组在先测定值相符，可认为该生物大分子的原子坐标与由该另一样品获得的原子坐标相同。由美国专利号6,093,573以及国际申请号PCT/US99/18441、PCT/US99/11913和PCT/US00/03745可获得有关X射线晶体法的进一步细节。NMR光谱法X射线晶体法需要所关注的大分子的单晶，但是NMR测量却在接近生理条件下的溶液中进行。然而，NMR得到的结构没有晶体得到的结构那样详细。虽然NMR光谱法的使用直至最近仍限于阐述相对小的分子(例如100-150个氨基酸残基的蛋白)的3-D结构，但包括对所关注的分子进行同位素标记以及横向弛豫-优化谱法(TROSY)的最新进展使得已将该方法扩展到分析更大的分子，例如110kDa分子量蛋白(Wider(2000)BioTechniques，29:1278-1294)。NMR使用射频辐射来检验由特定射频来脉冲的均一磁场内的磁性原子核的环境。该脉冲干扰具有非零自旋核的那些原子的核磁化。当系统恢复平衡时，检测瞬态时域信号。将该瞬态信号的傅立叶变化为频域获得一维NMR光谱。这些光谱的峰代表各种活性核的化学位移。原子的化学位移由其局部电子环境来决定。二维NMR实验可提供有关在结构和三维空间中各种原子接近程度的信息。通过进行一些二维(有时是三维或四维)NMR实验以及使用所得信息作为系列蛋白折叠模拟中的约束因素可测定蛋白结构。关于NMR光谱法的更多信息，包括关于如何将NMR实验获得的原始数据用于测定大分子3-D结构的详细描述可参见下列文献ProteinNMRSpectroscopy,PrinciplesandPractice,J.Cavanagh等人，AcademicPress,SanDiego，1996;Gronenborn等人(1990)Anal.Chem.62(1):2-15;和Wider(2000)，同上。使用上述计算机，由X射线结晶图的数据和/或NMR数据，可使用任何可用的方法构建所关注的GS区域的3-D模型。通过输入设备输入计算机的分析数据点和通过使用己知软件包的处理器可构建该模型，所述软件包例如CATALYST(Accelrys)、INSIGHT(Accelrys)和CeriusII、HKL、MOSFILM、XDS、CCP4、SHARP、PHASES、HEAVY、XPLOR、TNT、画RCOMPASS、画RPIPE、DIANA、画RDRAW、FELIX、VNMR、MADIGRAS、QUANTA、BUSTER、SOLVE、O、FRODO或CHAIN。通过计算机输出设备，使用可利用的系统，可使由这些数据构建的模型显示出来，所述可用的系统例如SiliconGraphics、EvansandSutherland、SUN、HewlettPackard、AppleMacintosh、DEC、IBM或Compaq。设计本发明的化合物一旦使用上述方法中的任一种建立了结合到和/或抑制所关注GS区域(例如腺苷酰化或去腺苷酰化的GS谷氨酰胺形成活性位点，包括腺苷酰化或去腺苷酰化的催化三联体位点)的化合物的3-D结构，就可制备具有与所鉴定的化合物基本相同的3-D结构(或包括结构基本相同的域)的化合物。在本文中，"具有基本相同的3-D结构"是指具有类似于所鉴定的化合物的氢键结合区域和疏水性特征的化合物。在有些情况下，具有与所鉴定的化合物基本相同的3-D结构的化合物可包括具有与"谷氨酰磷酸结构和电荷分布类似的氢键键合区域，或能与Ser52或Ser53(或除大肠杆菌之外的其它菌种得到的GS上的相应残基)形成酰基-酶中间体。具备上述的3-D结构数据并且知道所关注区域的化学结构(例如，对蛋白而言是氨基酸序列)，本领域技术人员会知道如何制造具有上述性质的化合物。这些方法包括化学合成法，对于蛋白而言是重组法(参照上文)。例如，可使用被适当置于化合物内以形成二硫键的半胱氨酸残基来将化合物或化合物的域约束为适当的3-D结构。此外，在本身是多肽或包括多肽域的化合物中，本领域技术人员会知道为了产生例如多肽骨架中的a-螺旋、p结构、或转角或弯曲，所述化合物包括何种氨基酸以及以何种序列来包含这些氨基酸。虽然基于计算机的方法不是必需的，但其可用于设计本发明的化合物。适合的计算机程序包括InsightII(Accelrys)、CATALYST(Accelrys)、LUDI(Accelrys.，SanDiego，CA)、Aladdin(DaylightChemicalInformationSystems,Irvine,CA);禾卩LEGEND[Nishibata等人(1985)J.Med.Chem.36(20):2921-2928]。本身是肽的本发明化合物也包括上述结构，但是经修饰后才可在体内使用，即通过在氨基和/或羧基端添加阻断剂以利于相关多肽在体内的存活。这对于那些在细胞摄入之前肽末端容易被蛋白酶降解的情形很有用。该阻断剂可以包括但不限于附加的相关的或不相关的肽序列，这些序列可被连接到将要给予的肽的氨基和/或羧基端残基上。这可在合成肽的过程中通过化学方式来完成，或者通过本领域普通技术人员熟悉的方法使用重组DNA技术来完成。或者，可将阻断剂(例如焦谷氨酸)或本领域已知的其它分子连接到氨基端残基和/或羧基端残基，或者可用不同部分来取代氨基端的氨基或羧基端的羧基。此外，在给予前，可将肽化合物共价或非共价偶联于药学上可接受的"载体"蛋白。另外所关注的是，基于本发明的肽化合物的氨基酸序列而设计的拟肽化合物。拟肽化合物是具有与所选肽的三维构象基本相同的三维构象(即"肽基序")的合成化合物。拟肽化合物可具有增强其体内效用的附加特性，例如增加细胞通透性和延长生物半衰期。拟肽通常具有部分非肽的骨架或完全非肽的骨架，但是具有与其所基于的肽内存在的氨基酸残基的侧基相同的侧基。在构建抗蛋白酶的拟肽中，本领域已知的几类化学键通常是有用的肽键取代物，这些化学键例如酯键、硫酯键、硫代酰胺键、逆酰胺(retroamide)键、还原羰基键、二亚甲基键和酮亚甲基(ketomethylene)键。假设依赖于GS腺苷酰化状态的催化三联体之间存在所认为的转换，则已知或假设为蛋白酶抑制剂，尤其是丝氨酸蛋白酶抑制剂，或该蛋白酶抑制剂的类似物的小分子、肽或拟肽化合物具有特殊意义。为了设计其它试验抑制剂分子，这些分子可用于本文所述的基于计算机的方法，例如作为分子对接到例如谷氨酰胺形成活性位点或催化三联体位点内，或者这些分子可用于下文所述的治疗方法、或体内或体外抑制方法。示例性化合物包括WO99/12935、WO02/22575、WO97/46576、WO99/50263、和WO99/50257中公开的那些化合物。已知的丝氨酸蛋白酶抑制剂包括肽基-精氨酸醛衍生物、吡咯并吡啶垸衍生物、喹啉酮衍生物或1-甲基苯并咪唑衍生物。筛选分析以下提供的是用于鉴定化合物的体外方法，所述化合物例如通过抑制腺苷酰化和/或去腺苷酰化GS的谷氨酰胺形成活性位点，和/或通过抑制腺苷酰化或去腺苷酰化催化三联体之一或两者的活性来抑制GS活性。因为活性催化三联体结构的差异，腺苷酰化GS的抑制特异性可与去腺苷酰化GS的抑制特异性不同。在筛选抑制GS的谷氨酰胺形成活性位点的化合物(所述化合物包括抑制催化三联体之一或两者的化合物)的方法中，可将方法设计成筛选以下化合物抑制氨对GS酶反应机理的第一步产生的"谷氨酰磷酸中间体进行亲核进攻的化合物；抑制在形成谷氨酰酰基-酶中间体过程中，催化三联体的活化丝氨酸对"谷氨酰磷酸进攻的化合物；或抑制氨对谷氨酰-酰基中间体进行亲核进攻的化合物。例如，在一个方法中，在对谷氨酰胺形成有效的特定分析条件下，可使GS多肽与试验化合物接触。通常使用抑制剂在下列条件下对谷氨酰胺合成酶多肽进行检测对于腺苷酰化形式的酶，在溶解于10mM咪唑-HCl缓冲溶液(pH6.3)中的浓度为0.6mMATP、1.8mMMnCl2、7.2mMNaHC03、4mM谷氨酸和4mMNH4Cl的溶液中进行；对于去腺苷酰化形式的酶，在溶解于10mM咪唑-HCl缓冲溶液(pH7.2)中的0.6mMATP、0.6mMMgCl2、4mM谷氨酸、4mMNH4C1的溶液进行。所有的分析在37。C下进行。对腺苷酰化GS的分析法与对去腺苷酰化GS的分析法不同。可在pH6.3和HC(V:Mn2+:ATP的浓度比为12:3:1的条件下分析腺苷酰化GS，而在pH7.2和Mg^:ATP的浓度比为1:1的条件下分析去腺苷酰化GS。腺苷酰化GS的典型分析条件为20mM咪唑缓冲液(pH6.3)、lmMATP、3mMMnCl2、12mMNaHC03和2mM谷氨酸钠；去腺苷酰化GS的典型分析条件为20mM咪唑缓冲液(pH7.2)、lmMATP、lmMMgCl2、12mMNaCl和2mM谷氨酸钠。上述分析可在37°C下进行。可在试验化合物存在和不存在的条件下测量ATP的水解、ADP的产生和/或谷氨酸的利用和谷氨酰胺的产生。例如，在一个实施方式中，一种体外筛选试验化合物以确定其是否抑制谷氨酰胺合成酶多肽的谷氨酰胺形成活性位点活性的方法，包括-(a)在对谷氨酰胺形成活性位点产生活性有效的条件下，使谷氨酰胺合成酶多肽(例如腺苷酰化的GS或去腺苷酰化的GS)与试验化合物接触；以及(b)确定相对于还没有与试验化合物接触过的谷氨酰胺合成酶多肽的活性，所述谷氨酰胺合成酶多肽的谷氨酰胺形成活性位点的活性是否有所降低。如本文所述，可通过谷氨酰酰基-酶中间体来调节谷氨酰胺形成活性位点的活性。如果使用腺苷酰化的GS多肽，可以使任何抑制活性与试验化合物抑制去腺苷酰化谷氨酰胺合成酶所获得的抑制相比较，反之亦然。化合物和药物组合物本文还提供化合物，例如，本文所述的药物组合物所包含的化合物和/或用于本文所述方法中的化合物。如本文和以下实施例中所示的那样，基于GS的谷氨酰胺形成活性位点的结构信息和机理信息，如上所述，可筛选已知的蛋白酶抑制剂包括已知的丝氨酸蛋白酶抑制剂的GS抑制活性。在有些实施方式中，可类似地筛选欲评价其蛋白酶抑制活性的化合物，也就是本文所指的"试验"蛋白酶抑制剂。例如，可筛选试验蛋白酶抑制剂的文库，例如试验丝氨酸蛋白酶抑制剂的文库。然后，具有适合抑制活性的化合物可用于治疗、预防或改善与哺乳动物的细菌感染有关的一种或多种症状。在WO99/12935、WO02/22575、WO97/46576、WO99/50263和WO99/50257中记载了有用的丝氨酸蛋白酶抑制剂。药物组合物的配制本文提供的药物组合物含有治疗有效量的一种或多种化合物以及药学上可接受的载体，所述化合物例如丝氨酸蛋白酶抑制剂用于治疗、预防或改善与细菌感染(例如含有GSI-P基因的细菌，例如结核分枝杆菌；或含有GSI-a基因的细菌，例如炭疽芽孢杆菌)有关的一种或多种症状，或与细菌感染有关的障碍、病症或失调。适于给予本文提供的化合物的药物载体包括本领域技术人员已知的适于特定给予方式的任何载体。此外，可将所述化合物作为单一药学活性成分而配制成的组合物或与其它活性成分组合。例如，所述化合物可以进行配制或与已知的抗菌化合物、抗炎症化合物、类固醇类和/或抗病毒剂类组合。在一个实施方式中，将所述化合物配制成合适的药物制剂，例如用于口服给药的溶液剂、混悬剂、片剂、分散片剂、丸剂、胶囊剂、粉剂、缓释剂或酏剂，或用于胃肠外给药的无菌溶液或混悬液形式，以及透皮贴剂和干粉吸入剂。在一个实施方式中，使用本领域熟知的技术和工艺，将上述化合物配制成药物组合物(参见例如AnselIntroductiontoPharmaceuticalDosageForms,第四版，1985，126)。在这些组合物中，将有效浓度的一种或多种化合物或其药学上可接受的衍生物与适当的药物载体混合。如上所述，在配制前，可将化合物衍生为相应的盐、酯、烯醇醚或烯醇酯、縮醛、縮酮、原酸酯、半縮醛、半縮酮、酸、碱、溶剂合物、水合物或前体药物。组合物中化合物的浓度为给予后的输送量对治疗、预防或改善一种或多种细菌感染症状有效。在一个实施方式中，将组合物配制为单剂量给予。为配制组合物，将重量分数的化合物以有效浓度溶解、混悬、分散于所选的载体中或以另外的方式混合于所选的载体中，使所治疗的病症得到缓解或一种或多种症状得到改善。活性化合物以充足的用量包含在药学上可接受的载体中，从而对治疗的患者在无不利副作用的条件下发挥治疗的有益作用。可通过体外系统、间接体内(exvivo)系统和体内系统测试该化合物，经验性地确定治疗有效浓度，然后由此推断用于人的剂量。药物组合物中活性化合物的浓度将取决于活性化合物的吸收率、失活率和排泄率、化合物的物化特性、剂量安排(dosageschedule)、给予量以及本领域技术人员已知的其它因素。制备药物的单元型制剂(dosageunitforms),使每单元型制剂含有约(O.Olmg、O.lmg或lmg)至约(500mg、lOOOmg或2000mg)的活性成分或基本成分的组合，在一个实施方式中，为约lOmg-约500mg。可一次性给予活性成分，或可分成多个小剂量在时间间隔内给予。可以理解的是，精确的剂量和治疗周期与所治疗的障碍有密切关系，并且可使用已知的试验技术或通过体内或体外试验数据进行推断来进行经验性地确定。应该注意的是浓度和剂量值还可随待减轻病症的严重程度而改变。还应该理解的是对于任何特定的受试者，根据个人需要以及给予组合物或监督组合物给予的人士的专业判断，应该随时间调整特定的剂量方案，并且本文提出的浓度范围只是示例性的并无意限制所要求保护的组合物的范围和实施。对于化合物显示溶解度不足的情况，可使用溶解化合物的方法。该方法是本领域技术人员已知的，包括使用助溶剂，例如二甲基亚砜(DMSO);使用表面活性剂，例如TWEEN85或溶于碳酸氢钠水溶液，但不限于此。还可使用化合物的衍生物，例如化合物的前体药物配制有效的药物组合物。化合物混合或添加后，所得混合物可以是溶液、混悬液、乳液等。所得混合物的形式依赖于一些因素，包括所期望的给予方式和化合物在所选载体或赋形剂中的溶解度。有效浓度足以改善疾病症状、障碍或治疗的病症，并且可经验性地确定该有效浓度。可以按照单元型制剂的形式向人和动物给予所述药物组合物，所述单元型制剂例如含有适量的化合物或其药学上可接受的衍生物的片剂、胶囊剂、丸剂、粉剂、颗粒剂、无菌的胃肠外溶液剂或混悬剂和口服液剂或混悬剂以及油-水乳液。在一个实施方式中，以单剂量形式(unit-dosageforms)或多剂量形式(multiple-dosageform)配制和给予药学上具有治疗活性的化合物及其衍生物。如本领域所知，本文所用的单剂量形式是指适于人和动物受试者并单独包装的物理离散单元。每个单剂量形式含有预定量的具有治疗活性的化合物，结合所需要的药物载体、赋形剂或稀释剂，足以产生所希望的治疗效果。单剂量形式的例子包括安瓿和注射器以及单独包装的片剂或胶囊剂。可部分或成倍地给予单剂量形式。多剂量形式是包装在单一容器内的多个相同的单剂量形式，从而以分隔的多剂量形式给予。多剂量形式的例子包括片剂或胶囊剂的瓶、小瓶或以品脱或加仑装的瓶。因此，多剂量形式是在包装中不分隔的多个单剂量形式。药学上可给予的液体组合物可以例如通过在载体中溶解、分散或以另外的方式混合如上定义的活性化合物和可选的药用辅料来制备，由此形成溶液剂或混悬剂，所述载体例如水、盐水、右旋糖水溶液、甘油、乙二醇、乙醇等。若需要，欲给予的药物组合物还可含有少量的无毒助剂，例如润湿剂、乳化剂、增溶剂、pH缓冲剂等，例如醋酸盐、柠檬酸钠、环糊精衍生物、失水山梨醇单月桂酸酯、三乙醇胺、醋酸钠、油酸合三乙醇胺以及其它此类试剂。制备该剂型的现行方法已为或将为本领域的技术人员所知；例如，参见Remington'sPharmaceuticalSciences,MackPublishingCompany,Easton，Pa.，第十五版，1975。可制备与无毒载体平衡的含有0.005%-100%的活性成分的剂型或组合物。本领域技术人员已知制备这些组合物的方法。预期的组合物可含有0.001%-100%的活性成分，或者在一个实施方式中为含有0.1-95%的活性成分。帝!j品可将化合物或药学上可接受的衍生物包装成制品(例如试剂盒)，所述制品含有包装材料、位于包装材料内的本文提供的化合物或其药学上可接受的衍生物以及标签，所述标签显示化合物或组合物、或其药学上可接受的衍生物用于治疗、预防或改善与细菌感染包括结核分枝杆菌感染有关的一种或多种症状或障碍。本文提供的制品含有包装材料。本领域的技术人员已熟知用于包装药品的包装材料。参见例如美国专利号5，323，907、5,052,558和5,033,252。药物包装材料的例子包括泡罩包装(blisterpacks)、瓶、管、吸入器、泵、袋、小瓶、容器、注射器和适于所选配方和希望的给予方式和治疗方式的任何包装材料，但不限于此。化合物的活性评价本文提供的作为GS活性(例如腺苷酰化GS的活性、去腺苷酰化GS的活性、谷氨酰胺形成活性位点的活性或一个或多个催化三联体的活性)抑制剂的化合物的活性，和/或作为治疗、预防或改善与细菌感染(例如结核分枝杆菌感染)有关的一种或多种症状、病症或障碍的化合物的活性，均可通过标准分析法来测量或评价。酶抑制法(例如，谷氨酰转移酶法、ATP水解法、ADP形成以及谷氨酸利用和谷氨酰胺形成法)、细菌例如结核分支杆菌的生长抑制和细胞的细胞保护、存活以及细胞毒性分析，所有这些均为本领域普通技术人员熟知和/或如下文所述。化合物和组合物的使用方法使用本文所述的化合物和组合物可以实施体外或体内方法。本发明化合物的体外应用可用于例如GS反应机理的基础科学研究、或用于治疗、预防、减弱或抑制细菌污染或感染、或用于抑制GS的谷氨酰胺形成活性位点的体外方法。该化合物还可用作体内治疗试剂以治疗细菌感染，包括病原菌或机会致病菌的感染。尤其是，该化合物可用作治疗试剂以治疗由GSI-p细菌引起的感染或由GSI-a细菌引起的感染，所述GSI-p细菌例如白喉棒状杆菌、淋球菌、大肠杆菌、鼠伤寒沙门氏杆菌、伤寒沙门氏杆菌、肺炎克雷伯菌、粘质沙雷氏菌、普通变形杆菌、痢疾志贺菌、霍乱弧菌、铜绿假单孢菌、粪产碱杆菌、幽门螺杆菌、流感嗜血杆菌、百日咳杆菌、支气管炎博德特菌、脑膜炎奈瑟菌、羊布鲁氏菌、结核分枝杆菌、麻风分枝杆菌、梅毒密螺旋体、问号钩端螺旋体、衣氏放线菌、星形诺卡菌、氧化亚铁硫杆菌、巴西固氮螺菌、鱼腥藻、Fremyelladiplosiphon和天蓝色链霉菌，所述GSI-a细菌例如蜡状芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、炭疽芽孢杆菌、肺炎链球菌、化脓链球菌、金黄色葡萄球菌、肉毒梭菌、破伤风梭菌和产气荚膜梭菌。该化合物可用于预防和/或治疗涉及细胞内微生物(即在细胞内复制的感染性因子)，例如细胞内细菌(例如结核分支杆菌)的疾病。本发明方法可用于范围的物种，例如哺乳动物例如人、非人灵长类例如猴子、马、牛、猪、绵羊、山羊、狗、猫、兔、豚鼠、仓鼠、大鼠和小鼠。因为细菌的GSI-l3酶通过腺苷酰化/去腺苷酰化级联调节，而哺乳动物的GSII酶却不是这样，并且本文的某些抑制剂被假设选择性地靶向腺苷酰化的GS，所以该化合物和组合物可用于选择性地抑制细菌细胞生长而最低限度地对哺乳动物细胞产生负面影响。在一种体内方法中，可将本文所述的化合物或药物组合物给予受试者，例如哺乳动物，例如怀疑遭受细菌感染或正在遭受细菌感染的哺乳动物。通常，将本发明化合物混悬于药学上可接受的载体(例如生理盐水)中，并经口服给予、或经皮给予、或进行静脉内、皮下、肌肉内、腹膜内、直肠内、叶鞘内、鼻内、胃内、气管内或肺内注射(或输注)。可将它们直接输送到适当的受疾病侵袭的组织。所用的抑制性化合物和辅助药剂的剂量依赖于给予途径的选择；制剂的性质；患者疾病的性质；受试者的体型、体重、表面积、年龄和性别；给予的其它药物；以及主治医师的判断。适合的剂量通常为0.0001-100.0mg/kg。考虑到可用的化合物和辅助药剂的种类以及各种给予途径的不同效率，预计所需剂量会有很大变化。例如，预计口服给予比静脉注射给予需要更大的剂量。这些剂量水平的变化可使用本领域熟知的用于优化的标准经验常规方式来调节。可以单剂型或多剂型(例如2倍、3倍、4倍、6倍、8倍、10倍、20倍、50倍、100倍、150倍或更多倍)的形式给予化合物和/或辅助药剂。实施例实施例l由结构和分子动力学研究鉴定催化三联体对来自大肠杆菌的谷氨酰胺合成酶活性位点的结构和分子动力学分析使两个类蛋白酶催化三联体得以鉴定。来源于GSI-a和GSI-p种的GS序列的DNAMAN序列比对显示构成催化三联体的假设的氨基酸残基在所有种中均是保守的。使用INSIGHTII成套软件的DISCOVER_3进行能量最小化，然后使用该能量最小化设法对构成每个活性位点的氨基酸进行分组并确认由定点突变获得的发现。对已变为二聚体的GS分子进行能量最小化以确保获得完整的活性位点，但却要减少原子总数以方便计算。原核微生物GS蛋白序列的高度保守促进了大肠杆菌谷氨酰胺合成酶的分子模拟操作。所用的晶体结构模型为由Brookhaven蛋白数据库获得的lf52.pdb(Gi11HS和DEisenberg(2001)Biochemistry7:1903-1912)。该二聚体还是手动腺苷酰化的。在两个亚基界面处存在的谷氨酰胺合成酶的活性位点内，发现一簇丝氨酸和组氨酸残基。这些残基是Ser52、Ser53、His210和His211(使用大肠杆菌残基编号)。使假设的催化三联体完整所需的一些酸性残基Asp50、Glul29、Glu327和Glu357也位于活性位点内。因此，认为所提出的催化三联体包括来自两个独立亚基(指定为A和B)的下列残基<table>tableseeoriginaldocumentpage37</column></row><table>正如本领域的技术人员将认识到的那样，可使用一些已知技术例如分子模拟和/或同源性比对，以及所提出的催化三联体机理的知识来测定来自大肠杆菌以外其它种的GS的相应残基。实施例2定点突变和突变基因的表达对来自大肠杆菌的谷氨酰胺合成酶活性位点的分子模拟使两个类蛋白酶催化三联体得以鉴定。为了考察这些残基对调节来自大肠杆菌的谷氨酰胺合成酶方面所起的作用，使用定点突变(SDM)特异性地耙向这些残基，随后评价改变这些残基对谷氨酰胺合成酶催化活性的影响。两个不同的系统用于SDM。第一个系统是Promega的AlteredSitesII体外突变系统，而第二个系统是来自于Stratagene的QuikChangeXL定点突变系统。因为AlteredSitesTM系统提供用于产生和选择寡核苷酸介导的突变株的高效步骤，所以使用该系统进行大多数的突变。该系统允许双链模板DNA的突变，并且无需亚克隆即允许连续多轮突变(sequentialroundsofmutagenesis)。该程序使用抗生素选择作为获得高频突变株的方式。载体含有两种抗生素抗性标记物有活性的四环素抗性标记物和无活性的氨节青霉素抗性标记物。试剂盒中提供了恢复和敲除两种标记物的寡核苷酸。在第一轮突变期间，四环素抗性基因失活而氨苄青霉素抗性恢复。倘若第二轮突变需要在第一轮突变产生的突变株上进行，那么氨苄青霉素抗性基因将又失去活性而四环素抗性恢复。因此，很容易进行多轮突变，而突变株的收率有所提高。因为少数突变不能使用该系统获得，所以使用Stratagene的QuikChange，系统，该系统基于聚合酶链反应的步骤，该步骤可用于将突变引入几乎所有的载体中。该基本步骤利用含有所关注的插入物的超螺旋双链载体以及含有所希望的突变的两种合成的互补寡核苷酸引物。每个互补于载体相反链的引物在使用户/"7W"60DNA聚合酶的温度循环期间延伸。寡核苷酸引物的引入产生了含有交错切口的突变质粒。温度循环以后，用Z^"I处理产物。该限制性内切酶对甲基化和半甲基化DNA特异并酶切亲代DNA模板，由此选择用于含有突变的合成DNA。然后，引入所希望突变的带切口的载体DNA转化到大肠杆菌宿主菌株中，随后可筛选单菌落用于突变。在设计的所有寡核苷酸引物中均发生沉默突变，允许引入限制性内切酶位点以利于筛选突变基因。因此无需进行一一测序即可简单、快速地为每个突变反应筛选所得的一些菌落。突变一经完成，就在大肠杆菌谷氨酰胺合成酶营养缺陷型菌株内表达每个突变基因。因为通过将AMP基共价添附到酶每个亚基中的酪氨酸残基上以调节谷氨酰胺合成酶的催化活性，所以提出为了生成人工合成的去腺苷酰化形式的酶，首先将酪氨酸397残基(腺苷酰化位点)改变为缬氨酸397。然后在腺苷酰化和去腺苷酰化形式的酶中检验每个突变。表1示出了其它靶向残基及变化的总结。表l.产生的氨基酸变化以显示催化三联体存在的总结<table>tableseeoriginaldocumentpage39</column></row><table>材料和方法除非另有说明，将所有大肠杆菌培养物保持在LM培养基(5g/lNaCl、10g/l酵母提取物、10g/l胰蛋白胨；pH7.2)上。若需要，则添加浓度为15g/l的琼脂。对于pAlter-l，用50fig/ml氨苄青霉素或12.5吗/ml四环素补充培养基，而对于pBluescriptlISK+,用100pg/ml氨苄青霉素补充。表2列出了本研究中所用的菌株和质粒。表2.使用的细菌菌株和质粒<table>tableseeoriginaldocumentpage40</column></row><table>使用QiaPrepSpinMiniprep试剂盒(Qiagen)或通过碱裂解法(Sambrook,J.，Fritsch,.E.F.和T.Maniatis(1989)In:MolecularCloning:ALaboratoryManual.,第二版.ColdSpringHaborLaboratoryLaboratoryPress)小规模分离DNA。使用QiagenMidiDNA分离试剂盒(Qiagen)来完成大规模DNA分离。使用购自AmershamBiosciences的限制性内切酶并按照厂商说明来进行DNA酶切。碱性磷酸酶来自AmershamBiosciences。T4DNA连接酶来自Promega并按照该酶提供的方案来使用。用于DNA电泳的琼脂糖为分子生物学级。7bg聚合酶(r7bg)来自TaKaRaBioInc.并用于一般筛选。高忠实性的ra《聚合酶(Ex7b《)也来自TaKaRaBioInc.并用于扩增用来克隆的基因。使用标准步骤(Sambrook，J.，Fritsch，E.F.和T.Maniatis(1989)In:MolecularCloning:ALaboratoryManual.,第二版.ColdSpringHaborLaboratoryPress1989)进行限制性酶切和琼脂糖凝胶电泳。lkbDNA梯状条带用于所有电泳。按照每个试剂盒提供的方案，使用来自Promega公司的AlteredSitesTM体外突变试剂盒，或来自Stratagene的QuikChangeXL定点突变试剂盒进行定点突变。所有的化学品为分析级或分子生物学级，并且无需进一步纯化即可使用。除非另有说明，所有化学品来自Merck或Sigma。大肠杆菌谷氨酰胺合成酶基因的克隆将引物设计到由Genbank(登录号X05173)获得的大肠杆菌glnA基因序列。将引物设计成在5'端带有Nsil限制酶切位点(黑体字示出的)。以下示出了该引物5'引物5'-GATATGCATCCGTCAAATGCG-S'(SEQIDNO:1)3'引物5'-GCGATGCATAAAGTTTCCACGG-3'(SEQIDNO:2)使用pGLn6的DNA为模板以及上述引物来进行PCR。PCR混合物含有1^1质粒DNA(50ng)、5pl每种引物(2.5pmol/nl)、化l2.5mMdNTP、含有20mMMgCl2的5^110X缓冲液和0.5^1高忠实性的化《聚合酶(2.5个单位)。按如下步骤进行PCR，即先对模板DNA在95°C下预变性5分钟，随后在95°C下变性5分钟、55。C下退火1分钟以及72°C下延伸2分钟，共进行30个这样的循环。将72°C下进行10分钟的最后延伸步骤也加入过程中。进行琼脂糖凝胶电泳以验证PCR产生的片段长度。使用高纯PCR纯化试剂盒(RocheDiagnostics)纯化PCR产物，并使用Nsil对该产物进行酶切。为构建使用AlteredSites系统进行SDM的模板，用尸Wl对pAlter-1线性化并在连接前去磷酸化。以插入物:载体比为3:1连接插入物和载体。按照厂商说明，使用Bio-Rad基因脉冲仪通过电穿孔将连接反应产物转化到大肠杆菌JM109中。在补充有12.5ng/ml四环素、80ng/mlX-Gal和ImMIPTG的LM琼脂培养基上筛选转化株。随后通过使用碱裂解法分离DNA、然后酶切并进行琼脂糖凝胶电泳来筛选由转化平板上获得的几种白色菌落。进行测序以确认大肠杆菌glnA基因的存在及其序列。除了使用M13/F和M13/R通用引物外，还由已知的基因序列设计基因特异性内引物。表3示出了这些引物。表3.对克隆的大肠杆菌glnA基因进行测序使用的序列特异性引物舰引物序列GlnSeq15'-GCTGAACACGTACTGACGATG-3'(SEQDDNO:3)GlnSeq25，-GTGGGAACCGGAGATAGATGATC-3'(SEQIDNO:4)GlnSeq35，-CGATGTTCGGTGATAACGGCTC-3'(SEQIDNO:5)GlnSeq45,-CGTACTTCGATACGACGTGCTTTC-3'(SEQIDNO:6)为使用QuikChange顶系统构建用于SDM的模板，由pAlter构建体亚克隆谷氨酰胺合成酶基因作为片段。用手术刀片将含有glnA基因的条带从凝胶上切下来，通过2ml的注射器推入Eppendorf管从而粉碎琼脂糖。将lml苯酚(平衡至pH8.0)加入该管，然后将混悬液涡旋1分钟。在-70。C下冷冻样品至少30分钟。样品一解冻，就将其在Eppendorf微量离心机中以13000rpm离心15分钟。将水相移至洁净管，然后用苯酚:氯仿:异戊醇(25:24:1)提取一次，接着用氯仿:异戊醇(24:1)提取一次。用乙醇将DNA沉淀并重悬于TE缓冲液。然后将该片段以插入物:载体比为3:1连接到pBluescriptIISK+中，再用Sacl和进行酶切。将该连接反应产物通过电穿孔转化到大肠杆菌XL1-Blue中，并在含有100pg/ml氨苄青霉素的LM琼脂平板上进行平板培养。通过碱裂解法分离质粒DNA、使用S"mHI酶切DNA以及随后使用琼脂糖凝胶电泳分析这些片段来筛选单转化体菌落(singletransformantcolonies)o定点突变(SDM)使用QiagenMidiPrep试剂盒由大肠杆菌JM109分离pAlter-1中的野生型glnA基因的DNA。表4列出了使用该系统进行glnA基因突变所设计的寡核苷酸。将引入限制酶切位点以利于突变初级筛选的沉默突变构建到SDM寡核苷酸中。这些也显示在表4中。表4.使用AlteredSitesTM系统进行的大肠杆菌glnA基因的突变。改变氨基酸残基的突变以黑体字示出，限制酶切位点以下划线标出。<table>tableseeoriginaldocumentpage43</column></row><table>突变发生后，为所选择的突变筛选单菌落，所述筛选通过从过夜培养液中分离DNA，并且使用所筛选的特定突变的酶进行限制酶切分析。突变基因的表达通过使用S"cl和进行酶切，由pAlter-l克隆体分离突变基因。然后对酶切下来的物质进行琼脂糖凝胶电泳以分离载体和插入物条带。如上所述，将含有基因的条带从凝胶上切下来并使用苯酚提取DNA。用Sad和///m/III酶切pBluescriptIISK+，然后以插入物:载体为3:1将每个突变基因连接到载体中。将连接反应产物通过电穿孔转化到谷氨酰胺合成酶营养缺陷株大肠杆菌YMC11中，并且在补充有50ng/ml氨苄青霉素的LM琼脂培养基上选择转化株。通过使用M13/F和M13/R通用引物的PCR，对在转化平板上获得的单菌落实施筛选步骤。在该步骤中，将单菌落重悬于20]al蒸馏水中。将1^1该菌落混悬液加入PCR反应体系中，所述的PCR反应体系含有2.5^1每种引物(2.5pmol/nl)、22.5mMdNTP、2.5nllOX缓冲液、2^125mMMgCl2和0.1pl7i^聚合酶(0.5u)。如上所述进行PCR循环。随后，通过琼脂糖凝胶电泳分离PCR产物，并且基于正确的条带大小选择阳性转化体。将阳性对照和阴性对照引入该步骤以验证获得的结果。突变的确认由外部机构进行测序以确认每个突变。为此目的，由已知的基因序列来设计正向和反向的基因特异性引物。这些示于表5中。表5.用于确认大肠杆菌glnA基因中各种突变的存在所使用的序列特异性引物QuikChangeTM突变<table>tableseeoriginaldocumentpage44</column></row><table>QuikChangeTM突变使用QiagenMidiPrep试剂盒将所选模板的DNA(pBluescript构建体)从大肠杆菌XL1-Blue中分离出来。表6列出了使用该系统进行SDM所设计的寡核苷酸。因为这是基于PCR的系统，所以每个反应需要两种寡核苷酸(正义的和反义的)。表6.使用QuikChangeTM系统进行的大肠杆菌glnA基因的突变。改变氨基酸残基的突变以黑体字示出，限制酶切位点以下划线标出。<table>tableseeoriginaldocumentpage45</column></row><table>突变发生后，为所选择的突变筛选单菌落，所述筛选通过从过夜培养液中分离DNA，并且使用所筛选的特定突变的酶进行限制酶切分析。使用QuikChange系统将获得的正突变株转化到大肠杆菌YMC11中用于表达。由外部机构进行测序以确认每个突变。使用GlnSeq5和GlnSeq6对D50A和E129A进行测序。使用GlnSeq9和GlnSeq10对E357A进行测序。结果大肠杆菌谷氨酰胺合成酶基因的克隆将大肠杆菌野生型glnA基因扩增为2.1kb片段，编码长度为471个氨基酸的蛋白。以插入物:载体为3:1将含有A^'i侧翼限制酶切位点的2124bp的PCR扩增的glnA基因连接到尸M酶切的SDM载体pAlter-l中。从一些转化体中分离DNA并使用5amHI和五coRI进行限制酶切分析。根据基因和载体的已知序列，用5"mHI对构建体(在所需的正确的5'端至3'端取向上带有该glnA基因)进行限制酶切，会产生6012bp和1797bp的片段。以这种方式鉴定了正确的构建体，并命名为pGln12。为构建使用QuikChange系统进行突变的野生型模板，将glnA基因从pGlnl2切下来作为SacI-iy/"dII片段，并以插入物:载体为3:1将其连接到经过类似酶切的pBluescriptIISK+中。将连接反应产物转化到大肠杆菌XL1-Blue中，并在补充有100ng/ml氨节青霉素、80吗/mlX-Gal和lmMIPTG的LM琼脂培养基上进行平板培养。为了鉴定出阳性亚克隆株，从一些白色菌落中分离DNA并用Sacl、///"JIII和5amHI对其进行限制酶切分析。以这种方式鉴定正确的构建体并将其命名为pBSK-ECgln。在进行任何SDM之前，对两个克隆体进行序列分析以验证野生型基因的完整性。定点突变(SDM)AlteredSites顶系统按照上述方案进行定点突变。使用对突变特异的酶对从突变体分离出来的DNA进行酶切，并且进行大小分级(size-fractionated)以确认存在突变。由于加入限制酶切位点，突变的存在通常产生额外的片段。在任何情况下，使用相同的酶对野生型构建体(pGlnl2)进行酶切作为对比对照。带有各自引入的限制酶切位点和所期望的片段长度的突变如表7所列。表7.使用AlteredSitesTM系统引入pGlnl2中的突变的列表，显示出所期望的限制性片段突变引入的限制酶切位点限制性片段(bp)有突变无突变Y397V591818917809S52Aa。i609517147809S53A601293586260121797S52AS53APvwl54201352103764571352'H210V443914781189703443918921478H211VPvmII3047225414931015304725082254E327V69268837809由于得到所期望的DNA片段长度，琼脂糖凝胶电泳确认存在突变。这9个单突变一经确认，就产生双突变体。在每种情况下，将Y397V突变体加入S52A、S53A、S52AS53A、H210V和H211V中的每一个中，分别产生S52AY397V、S53AY397V、S52AS53AY397V、H210VY397V和H211VY397V。带有各自引入的限制酶切位点和所期望的片段长度的突变如表8所列。<table>tableseeoriginaldocumentpage48</column></row><table>由于得到所期望的DNA片段长度，琼脂糖凝胶电泳确认存在突变。突变基因的表达将突变基因(来自pAlter)亚克隆到pBluescriptlISK+中，并转化到大肠杆菌YMCll中，以促进蛋白纯化和酶研究。通过PCR筛选确认亚克隆基因存在于载体中。经检测，含有突变glnA基因的转化株菌落为琼脂糖凝胶上的2170bp条带。PCR筛选中包括由转化到大肠杆菌YMCll中的载体组成的阴性对照，并且该阴性对照作为条带呈现于凝胶上，该条带具有载体多克隆位点的大小。PCR筛选还包括也在大肠杆菌YMC11中的pBSK-ECglnDNA的阳性对照。其作为条带呈现于凝胶上，与任何阳性突变亚克隆体的大小相同。然后用对突变特异的限制性内切酶对以这种方式鉴定的来自每个突变体的单亚克隆体的DNA进行酶切，以确认存在特异性突变。表9.突变glnA亚克隆体所期望的限制性片段的列表<table>tableseeoriginaldocumentpage50</column></row><table>由于得到期望的DNA片段长度，琼脂糖凝胶电泳确认亚克隆体内存在突变。QuikChange顶突变按照如上所述的方案，使用QuikChangeTM系统进行SDM。从可能的突变体中分离DNA,使用对突变特异的酶对DNA进行酶切，并且进行大小分级以确认存在突变。使用相同的酶对由亲代模板组成的对照进行酶切作为对比对照。带有各自的限制酶切位点和所期望的片段长度的突变如表10所列。pBSK-ECgln作为模板用于D50A、E129A、E327V和E357A突变。在pBSK-Y397V内产生双突变体D50AY397V、E129AY397V、E327VY397V和E357AY397V。表10.使用QuikChange系统引入到各模板中的突变的列表，显示所期望的限制性片段<table>tableseeoriginaldocumentpage52</column></row><table>由于得到所期望的DNA片段长度，琼脂糖凝胶电泳确认存在突变。结论使用所选择的定点突变系统能成功地产生所有希望的突变。所设计的用于突变发生的寡核苷酸中包括编码限制酶切位点的沉默突变。这就允许初级筛选而无需对每个潜在的突变进行测序。大肠杆菌谷氨酰胺合成酶基因中发生以下突变Y397V、S52A、S52AY397V、S53A、S53AY397V、S52AS53A、S52AS53AY397V、H210V、H210VY397V、H211V、H211VY397V、D50A、D50AY397V、E129A、E129AY397V、E327V、E327VY397V、E357A和E357AY397V。实施例3谷氨酰胺合成酶的补偿研究和纯化构建突变体以改变认为参与上述蛋白水解催化三联体的残基。这些残基是丝氨酸残基S52和S53、组氨酸残基H210和H211、以及D50、E129、E327和E357。通过大肠杆菌YMCll的谷氨酰胺合成酶营养缺陷型菌株的补偿作用来检测所有构建的突变体。组合使用硫酸链霉素沉淀、pH变化和硫酸铵沉淀来纯化各种重组突变体谷氨酰胺合成酶，直至获得纯酶制剂。还研发亲和柱层析法并用于纯化某些酶。使用两种酶分析法来评价谷氨酰胺合成酶活性。所用的第一分析法叫作"谷氨酰转移酶分析法，是谷氨酰胺合成酶催化反应的逆反应的变形，所述的谷氨酰胺合成酶的催化反应为谷氨酸+NH/+ATP—谷氨酰胺+ADP+Pi+H20在该逆反应中，在ADP、砷酸盐和锰或镁的存在下，羟胺和谷氨酰胺反应生成，谷氨酰羟肟酸和游禽氨(ShapiroBM和StadtmanER(1970)MethodsinEnzymol.17A:910-922)。这形成了谷氨酰胺合成酶活性分析法的基础。在测定酶等电点所得的正确pH下，谷氨酰胺合成酶的腺苷酰化和去腺苷酰化两种形式的转移酶活性相同。然而，这两种形式的酶可以得到区分，因为在等电点时，完全腺苷酰化的谷氨酰胺合成酶被60mMMgZ+完全抑制，而去腺苷酰化的酶则不受影响。此外，使用HPLC来评价由ATP、谷氨酸和氨转化为谷氨酰胺和ADP的转化率。这称为"正"反应或"生物合成"反应，并使用两种不同的分析法来分析一种是测量在ATP存在下，谷氨酰胺合成酶将谷氨酸转化为谷氨酰胺的能力，而第二种测定在相同的分析混合物中ATP向ADP和AMP的转化。方法和材料所有的化学品为分析级或分子生物学级，并且无需进一步纯化即可使用。除非另有说明，所有化学品均来自Merck或Sigma。Mn(HC03)-ATP由Na2ATP(来自Roche)自制得到，所述Na2ATP溶解于水中至浓度约为80mM。然后，通过使该溶液流过Dowex50WX2型强阳离子交换树脂，以从ATP中除去Na+离子。收集合并含有酸-ATP的所有样品并与相同摩尔浓度的Mn(HC03)反应。搅拌溶液直至所有的MnC03溶解。然后用NaHC03调节Mn(HC03)-ATP溶液的pH至7.0。根据标准方案(LaemmliUK(1970)Nature227:680-685)进行SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)。以40%丙烯酰胺:双丙烯酰胺混合物(19:1的比率)形式存在的丙烯酰胺购自Sigma。用于所有PAGE凝胶的宽分子量的蛋白标记物来自Fermentas。大肠杆菌YMCll中的谷氨酰胺营养缺陷的补偿作用将大肠杆菌营养缺陷型菌株YMCll中的pBluescripUISK+内的每个突变体重组谷氨酰胺合成酶构建体的单菌落平板培养于M9基本培养基中(Sambrook，J.，Fritsch，E.F.和T.Maniatis(1989)In:MolecularCloning:ALaboratoryManual,第二版.ColdSpringHaborLaboratoryPress.),以评价其补偿大肠杆菌YMC11营养缺陷性的能力。将浓度为250mg/1的谷氨酰胺添加到一个平板中，而重复的平板不含谷氨酰胺。将浓度为100吗/ml的氨苄青霉素添加到两个平板中。将用非重组pBluescriptIISK+转化的大肠杆菌YMC11用作阴性对照。将野生型重组构建体pBSK-ECgln用作阳性对照。在37。C下培养该平板，并在48小时内观察是否生长。大肠杆菌谷氨酰胺合成酶的纯化在补充有70mML-谷氨酸、5mML-谷氨酰胺和100吗/ml氨苄青霉素的2L修饰的M9培养基(6g/lNa2HP04、3g/lKH2P04、0.5g/lNaCl)中，培养用于分离GS的所有重组构建体。在37。C、转速为220rpm下对所有培养液振荡培养48小时。在4。C、10OOOrpm下离心，从培养基中收集细胞。然后立即使用该生物质或在-20。C下存储直至需要使用时。此外，由生物质纯化得到腺苷酰化和去腺苷酰化两种形式存在的野生型谷氨酰胺合成酶(来自pBSK-ECgln)，所述生物质从作为另一研究的一部分而进行连续培养获得。在氮限量和碳过量的条件下生成腺苷酰化酶，而在氮过量和碳限量条件下生成去腺苷酰化酶(SeniorPJ(1975)JournalofBacteriology123:407-418)。在4。C、10000rpm下离心10分钟收集获得的细胞，并在-20。C下存储直至需要使用时。用于纯化谷氨酰胺合成酶的方法由报道的方法(ShapiroBM和StadtmanER(1970)MethodsEnzymol.17A:910-922.)发展而来。将生物质重悬于10ml重悬缓冲剂A或RBA(10mM咪唑-HCl、2mM卩-巯基乙醇、10mMMnCl2'4H2O;pH7.0)中。将细胞在50%占空比(dutycycle)下超声10分钟。将该超声溶液在10OOOrpm下离心10分钟，并保留上清液。加入硫酸链霉素(10。/。w/v的10%)，并在4。C下搅拌混悬液10分钟。然后在10OOOrpm下离心10分钟，并保留上清液。用硫酸调节上清液pH至5.15。在4。C下搅拌该混合物15分钟，然后在13OOOrpm下离心IO分钟。再次保留上清液。添加饱和硫酸铵(体积的30%)并用硫酸调节pH至4.6。在4。C下搅拌混悬液15分钟，然后在13000rpm下离心10分钟。将获得的沉淀重悬于2-5mlRBA并用硫酸调节pH至5.7。在4。C下搅拌该混悬液过夜以使得谷氨酰胺合成酶得以重悬，然后在13OOOrpm下离心IO分钟。保留上清液并将混悬液pH调节至7.0。使用AKTAExplorer(AmershamBiosciences)利用亲和层析使野生型酶和Y397V酶得到进一步纯化。使用长度为10cm和内径为10mm的HR10/10柱以5'AMP琼脂糖树脂实现分离。将谷氨酰胺合成酶制剂(约为2ml)加样到制备柱上，所述制备柱用10mM咪唑(pH7.0)、150mMNaCl和10mMMnCV4H20来平衡。在整个线性梯度从150mM至500mM的40mlNaCl，使用2.5mMADP将结合的谷氨酰胺合成酶从柱上洗脱下来，并收集lml组分。然后收集合并含有纯谷氨酰胺合成酶的组分并用RBA透析过夜。按照标准方案，在7.5。/。SDS-PAGE凝胶上对每个蛋白混悬液的等分试样进行电泳。使用Lowry蛋白检测法测量蛋白浓度。对纯化的蛋白进行MALDI-TOF分析使用MALDI-TOF质谱分析每个突变蛋白。将所希望的蛋白条带从7.5。/。SDS-PAGE凝胶切下来(为获得足够蛋白，进行同一蛋白多条泳道操作)。将所希望的条带从凝胶上切下来并置于Eppendorf管中。将溶解于40%乙醇中的75mMNH4HC03溶液加入凝胶堵剂中并涡旋30分钟。取出液体并弃去。重复该脱色步骤直至凝胶堵剂中不含有的考马斯蓝。然后用乙腈浸没该凝胶堵剂，并在室温下培养15分钟，随后，从管中除去所有液体，保留凝胶堵剂。然后将足够体积的溶解于50mM碳酸氢铵的5mM二硫苏糖醇溶液加入管中以浸没凝胶堵剂，并在60。C下培养30分钟。然后将该混悬液在Eppendorf微量离心机中于13000rpm下离心5分钟，取出上清液并弃去。将10nl溶解于50mM碳酸氢铵的55mM碘代乙酰胺溶液添加到凝胶堵剂中，并在室温下于暗处培养60分钟。培养后，将混悬液在13000rpm下离心5分钟，取出上清液并弃去。用60^11乙腈浸没该凝胶堵剂，使该混悬液搁置10分钟。在13000rpm下离心5分钟后，弃去上清液，并在Speedvac中干燥该凝胶堵剂10分钟。然后添加溶解于50mMNH4HC03W、浓度为0.01pg/pl的新制备的牛胰蛋白酶(5-20pl)。添加量依赖于Eppendorf管中的凝胶量。将其在冰上培养60分钟。在简单离心后，取出上清液，并将10nl50mMNH4HCO3加入凝胶堵剂中。将其在37。C下培养过夜。然后将样品在超声浴中超声IO分钟，并在Eppendorf微量离心机中离心5分钟后收集上清液。加入10nl三氟乙酸(TFA)/乙腈溶液(50%的2%TFA和50%乙腈)，并将样品再超声10分钟。离心后，收集上清液。加入乙腈(l(Hil)，并使样品涡旋10分钟。将样品在13000rpm下离心5分钟并保留上清液。然后将制备蛋白样品和10mg/ml溶解于乙腈的处于0.1%TFA中的a-氰基羟基肉桂酸溶液进行等体积合并。将其剧烈混合，并将lpl该溶液用于样品培养板。然后通过MALDITOFMS分析蛋白。谷氨酰转移酶分析法测定谷氨酰胺合成酶活性因为在M^+存在下，在，谷氨酰转移酶分析法中腺苷酰化和去腺苷酰化形式的酶均有活性，所以该分析法用于测量存在的谷氨酰胺合成酶的总量。当向同一分析法中补充60mMMg^时，只能测定去腺苷酰化酶的活性。因此，以Mi^+或Mg^存在时的活性差异为基础，可将这两种形式的酶活性区分开来。分析混合物对ShapiroB.M.和StadtmanE.R.(1970)AnnualReviewsinMicrobiology24:501-524中记载的分析混合物进行了改变。在两种不同的分析混合物中测量谷氨酰胺合成酶活性一种只含有Mn，而第二种含有Mn和Mg。所有试剂在咪唑缓冲液(pH7.0)中制备。在总体积600pl中实施两种分析法。如下表ll所示，建立Mn分析法。表ll.基于Mn的谷氨酰转移酶分析法的分析混合物<table>tableseeoriginaldocumentpage57</column></row><table>如表12所示，建立组合(Mn和Mg)分析法。表12.基于Mn和Mg的谷氨酰转移酶分析法的分析混合物<table>tableseeoriginaldocumentpage57</column></row><table>以与Mn反应相同的方式制备空白反应物，但是用水替代ADP和砷酸盐溶液。在37°C下使分析混合物平衡5分钟，然后添加50^酶制剂开始反应。使该反应进行30分钟，然后添加900StopMix(1MFeCl3'6H20、0.2M三氯乙酸和7.1%v/vHC1)终止该反应。接下来，将样品在Eppendorf微量离心机中于13000rpm下离心2分钟以除去可能形成的任何沉淀，并在540nm下测量吸光度。所有吸光度读数输入电子数据表，结果表示为以pmole酶/min/mg蛋白表示的比活性。考虑亚基的数目，由去腺苷酰化Y-谷氨酰转移酶活性与总Y-谷氨酰转移酶活性(Mr^+反应)之比来计算腺苷酰化程度。通过HPLC测定谷氨酰胺合成酶活性按照正反应建立该分析法以测量谷氨酰胺合成酶活性，并测量在MnHC03-ATP(第一个反应的基础)和MgATP(第二个反应的基础)存在下，由4mmolL-谷氨酸形成的谷氨酰胺的量。此外，还可使用相同试剂，在单独的分析法中测量形成的ADP量。分析的设置如表13所示。表13.用于HPLC分析法以测定谷氨酸和ATP转化为谷氨酰胺和ADP的转化率的分析组分<table>tableseeoriginaldocumentpage58</column></row><table>将所有酶制剂调节为具有相同的蛋白浓度，并以5(Hil的体积加入分析混合物中。酶的加入启动了反应，然后使其反应l小时。通过加入6pl50%三氯乙酸溶液终止该反应。然后将每个分析物均分到4个HPLC小瓶(150nl/小瓶)进行分析，在Agilent100HPLC设备上使用PhenomenexLunaC18柱对其中的两个进行谷氨酸和谷氨酰胺分析。还使用Agilent100HPLC设备在ChromolithPerformanceRP-C18柱上进行ATP/ADP分析。因为有人认为，与丝氨酸蛋白酶内的催化三联体类似的两个假设的催化三联体参与了谷氨酰胺合成酶反应机理，因此为了评价丝氨酸蛋白酶抑制剂对酶的影响，在丝氨酸蛋白酶抑制剂AEBSF和PMSF存在下，还通过HPLC来分析某些突变体。被评价的酶是腺苷酰化野生型(WT)酶、去腺苷酰化WT酶和突变酶S52A、S52AY397V、S53A、S53AY397V、S52AS53A和S52AS53AY397V。在lmMPMSF或lmMAEBSF存在下，预培养该酶60分钟。为每种酶建立不含抑制剂的对照反应。然后将每种酶加入如上所述设置的分析法中。使该分析法进行60分钟，然后通过加入6ml50。/。TCA终止该分析，随后通过HPLC对其进行分析。所有分析重复进行三次。结果补偿作用研究在有或无谷氨酰胺的条件下，使突变谷氨酰胺合成酶基因构建体在M9琼脂基本培养基上生长，并评价其对大肠杆菌YMC11的glnA突变的补偿能力。在37。C下培养48小时后，观察到虽然阴性对照(YMC11中的pBluescriptIISK+)在无谷氨酰胺的条件下不能生长，但是阳性对照(pBSK-ECgln)能补偿YMC11中的营养缺陷性。常常遇到的问题是250mg/l谷氨酰胺显得不足以支持YMCll菌株的生长，因此YMC11中的载体独自抗争而生长。在阳性对照ECgln中，存在的功能性多拷贝谷氨酰胺合成酶基因显得能克服此问题。重组去腺苷酰化构建体pBSK-Y397V也能补偿YMC11的营养缺陷性。因此WT酶和Y397V酶均能是功能性的。S52A和S53A突变体以及双突变体S52AY397V和S53AY397V均能补偿大肠杆菌YMC11的营养缺陷性，因而显示其功能性。在双丝氨酸突变体S52AS53A及其对应物S52AS53AY397V中也发现相同情形。两种组氨酸突变体H210V和H211V在补充有谷氨酰胺的基本培养板上生长很好，但是在不含谷氨酰胺的培养板上生长很差，因而显示了该酶几乎没有功能性。另一方面，双组氨酸突变体H210VY397V和H211VY397V甚至在补充有谷氨酰胺的培养板上生长也很差，并且在不含谷氨酰胺的培养板上根本不生长。因此，认为这两种酶基本上不具有功能性，并且这些突变产生了营养缺陷性，因此它们完全需要谷氨酰胺。突变体D50A和D50AY397V显示在两种培养板上生长很好，均具有功能性。然而，E129A和E357A不能补偿YMC11的营养缺陷性，并且显示甚至在补充有谷氨酰胺的培养板上生长也很差。双突变体E129AY397V和E357AY397V也如此。E327V和E327VY397V显示在两种培养板上均生长很好，均具有功能性的谷氨酰胺合成酶。大肠杆菌GS的纯化对于突变蛋白的纯化，使每个突变体在补充有作为唯一氮源的谷氨酸的修饰的M9基本培养基上生长。因为YMC11菌株为谷氨酰胺营养缺陷体，添加少量谷氨酰胺以促进细胞生长。使所有培养液在37。C下生长48小时，然后检查是否受污染。通过分离质粒DNA、进行限制酶切分析、然后进行琼脂糖凝胶电泳来检査重组质粒的完整性。有人发现因为生长很差，对于一些双突变体，即H210VY397V、H211VY397V和E357AY397V，需要向基本培养基添加10mM谷氨酰胺以得到足够的生物质从而能进行酶纯化。从所有突变体，将谷氨酰胺合成酶成功纯化到至少90%的均一性。在任何情况下，在约55kDa处存在的单条带可证明存在纯化的谷氨酰胺合成酶。验证纯化的谷氨酰胺合成酶对所有纯化的突变体谷氨酰胺合成酶进行MALDITOF分析以验证该酶是谷氨酰胺合成酶。在7.5o/。SDS-PAGE凝胶上运行每种酶，将预计是谷氨酰胺合成酶的条带切下，并按照上述方法来纯化蛋白。将纯化的蛋白样品移液至样品板上，通过MALDITOF质谱进行分析。然后使用蛋白质组学和序列分析工具鉴定蛋白，并将获得的值输入SwissInstituteofBioinformatics(瑞士生物信息研究院)的ExPASy蛋白质组学服务器的数据库中。所有的分离蛋白均以此方式被鉴定为谷氨酰胺合成酶。谷氨酰转移酶分析法使用，谷氨酰转移酶或"逆"反应来评价每个突变体的活性。该方法在比色法分析中测定铁-异羟肟酸络合物的存在，在所述比色分析法中，于540nm下读取吸光度。该分析法测定了含M一+反应中的总酶活性。此外，因为腺苷酰化形式的酶在Mg^存在下受抑制，所以在含有Mn2+和Mg^两者的反应中，还可测定筛选的谷氨酰胺合成酶的腺苷酰化程度(ShapiroBM和StadtmanER(1970)AnnualReviewsinMicrobiology24:501-524;BenderRA，KAJanssen,ADResnick,MBlumberg,FFoor和BMagasanik(1977)JournalofBacteriology129:1001-1009)。以这种方式，可测定谷氨酰胺合成酶的腺苷酰化程度。分析结果如表14所示，以pmole/min/mg蛋白表示酶活性。表14.大肠杆菌WT和构建的突变体的谷氨酰转移酶分析结果。WT酶是指在修饰的M9培养基中生长的菌株，WT(AD)和WT(DD)分别是指连续培养产生的腺苷酰化酶和去腺苷酰化酶。所显示的值代表至少三次试验的平均值，其中活性偏差小于10%。<table>tableseeoriginaldocumentpage62</column></row><table>在Mg^存在的条件下，以与突变体相同的方式在修饰的M9培养基中生长的WT酶(表中的WT)，因其大部分活性受到抑制，由91pmole/min/mg蛋白到20nmole/min/mg蛋白，约为4倍的抑制，所以其基本上以腺苷酰化形式存在，腺苷酰化的百分数为78%。在N过量和C限量的连续培养条件下生长的WT菌株中，可观察到相同的腺苷酰化百分数，其中谷氨酰胺合成酶大部分被腺苷酰化(表中的WT(AD))。在N限量和C过量的连续培养中生长的WT酶应当是以去腺苷酰化形式(表中的WT(DD))存在，这反映在分析结果中。在只存在Mn2+(55.8)的条件下进行的分析中，该特定菌株的比活性几乎相同，而在Mi^+和Mg2+(56.1)均存在的条件下，正如所预计的那样，腺苷酰化的百分数为0。因为Tyr397已被缬氨酸残基取代，所以预计突变酶Y397V以去腺苷酰化形式存在。突变体显示出64.5nmole/min/mg蛋白这样非常高的总酶活性，但不显示是去腺苷酰化的；因为在Mi^+和Mg2+(5.1)均存在下的酶活性比只有Mn2+(64.5)存在下检测到的酶活性低得多，所以实际上显示腺苷酰化的百分数更高，结果是腺苷酰化的百分数为92%。这是因为腺苷转移酶不能使缬氨酸残基腺苷酰化或去腺苷酰化，因此产生不正确折叠的谷氨酰胺合成酶。有假设认为通过腺苷转移酶进行的腺苷酰化和去腺苷酰化需要通过腺苷转移酶进行谷氨酰胺合成酶环的特异性折叠，折叠成酶每种状态所需的两种构象中的任一种，并且腺嘌呤基的空间效应促使该酶折叠为正确的构象。因为腺苷转移酶不会将Y397环折叠为去腺苷酰化所需的"正确"构象，因此，Y397V突变体酶可能具有类似于腺苷酰化形式酶的环构象。因此，该腺苷酰化形式的酶可趋于成为默认结构。两种丝氨酸残基52和53在两种突变菌株内单独发生改变，并且这两种突变导致总Y-谷氨酰转移酶活性分别降至35.5和47.8fimole/min/mg蛋白，表明这些残基对于催化活性是必需的。将两种丝氨酸残基改变为丙氨酸，由此产生双突变体S52AS53A，该突变强化了上述结论。在该突变体中，，谷氨酰转移酶的活性急剧降至7.2pmole/min/mg蛋白。在Y397V突变的同时，分别改变各丝氨酸残基从而产生S52AY397V和S53AY397V，这导致了在两种单独的丝氨酸突变体中可观察到的Mn2+活性增加到与WT酶相当的水平(78.6和86.2nmole/min/mg蛋白)。S52A和S52AY397V中腺苷酰化的百分数与由WT获得的腺苷酰化的百分数类似(均在75-80%范围)。改变S53导致两种突变体(S53A和S53AY397V)中腺苷酰化的百分数降至60-65%，可能表明S53是去腺苷酰化的重要残基。同时改变两种丝氨酸残基产生S52AS53A，导致了r谷氨酰转移酶活性大幅降至7.2pmole/min/mg蛋白。当对三突变体S52AS53AY397V进行分析时，"谷氨酰转移酶的一些活性得以恢复(29.9^imole/min/mg蛋白)，但是该活性仍小于WT菌株获得的活性。这似乎表明，正如所怀疑的那样，这些丝氨酸残基在谷氨酰胺合成酶中发挥重要作用。如果这些丝氨酸残基发挥类似于在丝氨酸蛋白酶中构成催化三联体的丝氨酸残基的催化作用，那么可预计的是，双丝氨酸突变体(S52AS53A)将产生非功能性的酶，除非该酶使用其它反应机理或它们在"逆反应"或"谷氨酰转移酶反应中发挥的作用可能是纯结构性的而非催化性的，即在丝氨酸残基处，没有通过酰基中间体进行谷氨酰转移酶反应。经鉴定作为催化三联体潜在组成部分的两种组氨酸残基被证明对酶的催化活性至关重要。H210V显示出非常小的Mr^+依赖性，谷氨酰转移酶活性(2.8[imole/min/mg蛋白)，在双突变体H210VY397V中，这种依赖性减小至不存在。H211V突变体也根本不显示任何活性。H210V被完全腺苷酰化(腺苷酰化的百分数为100。/。)。当除去双突变体H210VY397V中使该酶发生腺苷酰化或去腺苷酰化的能力时，不能得到活性。经鉴定为催化三联体潜在的酸性残基的四个残基，即D50A、E129A、E328V和E357A，均显示不同大小的活性。D50A和D50AY397V显示总，谷氨酰转移酶活性很小(分别为1.28禾卩1.78pmole/min/mg蛋白)，但显示出不同程度的腺苷酰化。E129A显示活性很小(2.38^imole/min/mg蛋白)，但其在双突变体E129AY397V中增加到12.06pmole/min/mg蛋白。突变体E328V、E328VY397V、E357A和E357AY397V均没有显示大的，谷氨酰转移酶活性，最大活性是由E357A显示出的3.3[imole/min/mg蛋白。尽管不含有非常低活性的碱基，两种E357A突变体均显示出0%的腺苷酰化。正如在文献中观察到的，当在任何情况下引入突变导致活性降低时，这四个残基对于催化活性很重要(LiawS-H，CPan和DEisenberg(1993a)ProceedingsoftheNationalAcademyofSciences90:4996-5000;LiawS-H和DEisenberg(1994a)Biochemistry33:675-681;AlibhaiM和JJVillafranca(1994)Biochemistry33:682-686)。HPLC分析法除Y-谷氨酰转移酶分析法外，还研发了通过HPLC测量ATP和谷氨酸转化为ADP和谷氨酰胺的转化率的分析法。这些将建立成单一方法，但单独分析谷氨酸、谷氨酰胺、ATP和ADP。在Mn2lQMg^均存在的条件下，谷氨酸通过谷氨酰胺合成酶转化为谷氨酰胺的转化率被称为基于谷氨酰胺的比活性，并且表示为pmole/min/mg蛋白。在Mn"和Mg2+均存在的条件下，ATP通过谷氨酰胺合成酶转化为ADP的转化率被称为基于ADP的比活性，并且表示为pmole/min/mg蛋白。用基于谷氨酰胺的比活性除以基于ADP的比活性也可计算转化百分数，并且该值可解释为酶以相同水平的效率完成两个反应步骤的能力，该两个反应步骤即谷氨酸向谷氨酰胺以及ATP向ADP反应的步骤。在基本培养基中生长的WT酶显示出接近的基于谷氨酰胺的比活性和基于ADP的比活性(分别为1.3058和1.3651nmole/min/mg蛋白)，并且转化率为100%。在氮限量和碳过量条件下生长以进行腺苷酰化的WT酶在Mn和Mg两种分析法中显示了非常接近的活性水平，并且转化率为100%。在氮过量和碳限量条件下生长以进行去腺苷酰化的WT酶在Mg分析法中的活性(谷氨酰胺分析中为0.4412pmole/min/mg蛋白，而在ADP分析中为0.4537nmole/min/mg蛋白)比在Mn分析法中的活性(谷氨酰胺分析中为0.1425pmole/min/mg蛋白，而在ADP分析中为0.1409nmole/min/mg蛋白)更强。Mn分析法和Mg分析法均显示转化百分数接近于100%。因为去腺苷酰化酶比腺苷酰化酶应显示更大的Mg活性，所以该结果是所预期的。Y397V酶在Mi^+分析法中比在Mg^分析法中活性更强，转化率只有50%。该低转化效率可能是因为Tyr397柔性环的不正确折叠，所述Tyr397柔性环产生含有非结合水的活性位点。该水可作为亲核剂，与高度不稳定的谷氨酰磷酸中间体反应，将其转化为谷氨酸和P04，由此发生低效转化。此外，正如所假设的那样，通过腺苷转移酶进行的酶的腺苷酰化需要Tyr397柔性环的腺苷酰化，并且通过腺嘌呤基的空间效应诱导了该环的特异性构象，促使该酶折叠为正确的构象。S52A和S52AY397V均非常活泼，并且显示出比筛选的WT酶更强的谷氨酰胺合成酶活性。在基于谷氨酰胺和基于ADP的Mn和Mg分析法中，S52A产生了水平接近的活性(在2.0-2.8pmole/min/mg蛋白的范围内)，对Mn分析法的转化百分数为91%，对Mg分析法的转化百分数为85%。另一方面，S52AY397V比S52A活泼，产生基于谷氨酰胺的Mn比活性为5.366[imole/min/mg蛋白以及基于ADP的Mn比活性为6.241(Himole/min/mg蛋白。这相当于转化率为91%。Mg分析法得到基于谷氨酰胺的Mg比活性为5.3063pmole/min/mg蛋白以及基于ADP的Mg比活性为7.6781nmole/min/mg蛋白，代表转化百分数为69%。S53A产生的活性水平稍高于WT菌株产生的活性水平，即对于基于谷氨酰胺的Mi^+分析法，为5.80^imole/min/mg蛋白；对于基于ADP的Mi^+分析法，为6.36nmole/min/mg蛋白；对于基于谷氨酰胺的Mg2+分析法，为4.88pmole/min/mg蛋白以及对于基于ADP的Mg^分析法，为6.96jamole/min/mg蛋白。这些代表转化率分别为91%和70%。在S53AY397V中发现的活性水平显著高于在WT菌株中发现的活性水平。对于基于谷氨酰的分析，Mr^+活性增加到15.45pmole/min/mg蛋白，而对于基于ADP的分析，Mi^+活性增加到21.32^imole/min/mg蛋白。对于基于谷氨酰胺的分析，MgZ+活性为10.66pmole/min/mg蛋白，而对于基于ADP的分析，Mg2+活性为15.42nmole/min/mg蛋白。S52AS53A的活性不如两个S53A突变体的活性。对于谷氨酰胺分析，其产生的Mn活性为2.2873pmole/min/mg蛋白，而对于ADP分析，Mn活性为2.5904pmole/min/mg蛋白，转化百分数为88%。然而，该酶确实显示出在Mn存在下，将ATP直接转化为AMP的能力，对于ADP向AMP的转化，获得的比活性为0.3858^imole/min/mg蛋白。S52AS53A确实显示出很低的Mg活性水平，目卩，对于谷氨酰胺分析，Mg活性为0.卯9化mole/min/mg蛋白，而对于ADP分析，Mg活性为1.2676Hmole/min/mg蛋白。在归于腺苷酰化形式酶的活性位点内可产生该较低活性。能将ATP转化为AMP的酶可由ADP合成谷氨酰胺(数据未示出)。当S52AS53A突变与Y397V突变组合时，相比于S52AS53A突变，Mn活性水平增加(对于谷氨酰胺分析，Mn活性增加到3.095pmole/min/mg蛋白，而对于ADP分析，Mn活性增加到4.5381nmole/min/mg蛋白)。然而，对该三突变体，Mg基于谷氨酰胺和基于ADP的比活性非常显著地减小到0.1075和0.2986pmole/min/mg蛋白。此外，该酶在分析法中表现出生成AMP的能力，显示出比活性为0.3583pmole/min/mg蛋白。这些结果显示出两种丝氨酸残基对该酶的催化活性非常重要。正如所预计的那样，双突变S52AS53A在菌株中不产生营养缺陷。然而，如下事实可对此作出解释，即这些酶能由ADP以及ATP产生谷氨酰胺。当这些酶的转化效率受到严重损害时，将可能出现直接由Y-谷氨酰磷酸而不是酰基酶中间体发生反应，因为磷酸酐在H20存在下不稳定，使得，谷氨酰磷酸水解并发生低效转化。通常，认为形成部分催化三联体的两种组氨酸残基显示出非常低水平的活性。H210V是唯一显示出活性水平与WT酶相当的突变，并且只是在Mn分析法中(对于基于谷氨酰胺的分析，为0.1525nmole/min/mg蛋白，而对于基于ADP的分析，为0.1355pmole/min/mg蛋白)。在Mg分析法中产生的活性水平非常低，可认为相当于没有活性(对于基于谷氨酰胺的分析，为0.0348nmole/min/mg蛋白，而对于基于ADP的分析，为0.0173pmole/min/mg蛋白)。双突变体H210VY397V在任何分析中均显示非常小的活性，即，在基于谷氨酰胺的Mn分析法中，为0.007化mole/min/mg蛋白、在基于ADP的Mn分析法中，为0.0025pmole/min/mg蛋白、在基于谷氨酰胺的Mg分析法中，为0.0036nmole/min/mg蛋白以及在基于ADP的Mg分析法中，为0.0073nmole/min/mg蛋白。H211V或H211VY397V均显示在任何分析中没有多少活性，表明它们在谷氨酰胺合成酶活性位点中的重要性。这四种突变体在所有分析法中的比活性均少于0.1pmole/min/mg蛋白。然而，有趣的是，尽管比双丝氨酸突变体产生的AMP水平低，这四种突变体均可自始至终将ATP转化为AMP。在经鉴定为是假设的催化三联体中潜在的酸残基的残基中，即D50AE129A、E327V和E357A均显示活性水平降低并且转化率不同。D50A显示比WT克隆体活性小。当该突变与Y397V突变组合时，导致在所有分析法中相对于D50A活性增大。基于谷氨酰胺的M^+分析法的比活性和基于ADP的Mi^+分析法的比活性分别由D50A中的0.62nmole/min/mg蛋白和0.92pmole/min/mg蛋白增至D50AY397V中的2.82pmole/min/mg蛋白和4.90nmole/min/mg蛋白。Mg^活性显示出类似的趋势，分别由D50A中的0.29|imole/min/mg蛋白和0.85nmole/min/mg蛋白增至D50AY397V中的1.98nmole/min/mg蛋白和4.19pmole/min/mg蛋白。两种突变体的转化率均低，表明酶不是完全功能性的。E129A在任何分析法中均显示无活性。在双突变体E129AY397V中，有些活性可检测到。E327V在Mr^+分析法中显示出低比活性(在基于谷氨酰胺的分析中，为0.32^imole/min/mg蛋白，而在基于ADP的分析中，为0.42nmole/min/mg蛋白)，但该水平在Mg^分析法中均降低。另一方面，E327VY397V具有类似于在E327V中获得的基于谷氨酰胺的Mi^+的比活性和基于ADP的Mn"的比活性，但是Mg^活性显著高于E327V的Mg^活性。这可表明该残基在腺苷酰化形式的酶中很重要。E357A在Mi^+分析法中产生的比活性，对基于谷氨酰胺的活性为0.36pmole/min/mg蛋白，而对基于ADP的活性为0.21iimole/min/mg蛋白。在任一Mg&法分析中均检测不到活性。当E357A与Y397V组合时，双突变体显示出比E357A更低的Mr^+活性，但Mg^活性得到恢复(基于谷氨酰胺的活性为0.04nmole/min/mg蛋白，而基于ADP的活性为0.01nmole/min/mg蛋白)。表15.显示使用HPLC测定的ATP和谷氨酸转化为谷氨酰胺、ADP和Pi的转化率的HPLC分析结果。WT酶是指在修饰的M9培养基中生长的菌株，而WT(AD)和WT(DD)是指在连续培养中产生的腺苷酰化和去腺苷酰化酶。所示值代表三次不同分析的平均值，其中该值的偏差小于5%。比活性Mn分析法(pmole/niin/迈g蛋白)基于ADP的比活性Mn分析法(fimole/min/mg蛋白)转化百分数Mn分析法基于M跌胺的比活性Mg分析法(拜ole/min/mg蛋白)基于ADP的比活性Mg分析法(拜ole/min/mg蛋白)转化百分数Mg分析法基于AMP的比活性Mn2+分析法(limole/min/mg蛋白)WT98《264*21100-WT(AD)3,763.651003,023.1297WT(DD)4*984,6210014.5413.92100Y397V2.814.9S57(U20.23SO-工联休S52A2*082*30912.412.8585-S52AY397V5376.24865317.68诉SS3A5'抑914.886.9670-SS3AY397V15452132731(U615.4269-S52AS53A2,291S9880.911.27720.39S52ASS3AY397V3.014.54660.110,3036H210V0-150.14则0.030.06620.05H210VY297V0,010.001000.000.01490.01H211V0,020.021000.050.06870.08H211VY397V0,090.09W0.02O.OS40O.OSDSOA0.620.92670.290.8534-D50AY397V2,824.卯581.984.1947-E129A0.000.00-0.000.040-E129AY397V0,000.00"210370-E328V(U2(K42780.000.030-E328VY397V0.53861.71咖-E357A0360.211000.000.00■-E357AY397V0.040.060.040.01100丝氨酸蛋白酶抑制剂的实验结果如表16所示。表16.使用丝氨酸蛋白酶抑制剂PMSF和AEBSF在实验中获得的HPLC数据。数据表示为在无抑制剂的对照反应与在有抑制剂的反应之间比活性降低的百分数。正百分数的降低表示相对于无抑制剂的对照反应，活性增加。<table>tableseeoriginaldocumentpage70</column></row><table>ND=未检测DI-数据不准确；获得的活性水平极低，使得对该结果的解释不准确数值表示为在无抑制剂下获得的结果与在有抑制剂下获得的结果之间活性降低的百分数。还示出了反映酶转化效率的转化百分数。获得的正百分数的降低值表示与对照下所得活性水平相比，有抑制剂下所得活性提高。这在ATP水解反应中特别明显，表明作为"谷氨酰磷酸水解的结果，在有抑制剂存在时，反应的第一步以增大的速率发生，同时在ATP水解速率增大的任何情况下，伴随着转化效率的降低。±15%的降低百分数可解释为分析法中可变性的反映，因此，可认为蛋白酶抑制剂具有很小的影响或没有影响。在基于Mt^+和基于Mg"的分析法中，均发现PMSF抑制腺苷酰化WT酶、以及突变体Y397V、S52A、S52AY397V和S53A。AEBSF表现出在腺苷酰化WT酶、以及突变体Y397V、S52A、S52AY397V、S53A、S53AY397V、S52AS53A和S52AS53AY397V中产生抑制，抑制水平显著高于在ATP水解反应中的抑制水平。当AEBSF没有引起基于谷氨酰胺的比活性的显著降低时，其在活性位点中的存在确实表现出增加了基于ADP的比活性。PMSF没有显著抑制S52AS53A或S52AS53AY397V的活性。这正是所预计的那样，因为两种丝氨酸均已从活性位点除去。因为AEBSF确实抑制了这两种突变酶，因此，表现出不同的作用机理。发现PMSF和AEBSF均结合到活性位点，同时仍使ATP发生水解。这可解释为丝氨酸蛋白酶抑制剂与谷氨酸位点的竞争性结合，同时仍使ATP发生水解。尤为重要的是，在任何情况下，当发现发生抑制时，还伴随着转化效率的降低。已由SDM数据鉴定出来的组成各催化三联体的氨基酸对于腺苷酰化形式的酶是S52、H211和E327，而对于去腺苷酰化形式的酶是S53、H210和D50。为了分析在腺苷酰化时，酶在催化三联体间可能会如何转换，将由Brookhaven蛋白数据库获得的晶体结构模型lf52.pdb(GillHS和DEisenberg(2001)Biochemistry7:1卯3-1912)减少到4个亚基，指定为A、B、G和H，以分析在假设的基于催化三联体的反应机理中亚基之间的相互作用。亚基H的腺苷酰化Tyr397与亚基B上的Trp57'相对，处于丝氨酸柔性环中。有人认为在腺苷酰化时，在腺苷酰化Tyr397和Trp57'的芳族侧链之间发生相互作用，以及在Tyr397(亚基H)和Tyr397(亚基A)的腺嘌呤残基之间发生相互作用，这使酶"转换"催化三联体。有人认为，在亚基A的Tyr397腺苷酰化过程中，ADP腺嘌呤基和色氨酸残基的芳环之间的亚基G上的Trp57，使得亚基G上含有柔性环的丝氨酸旋转，从而将Ser52带到与亚基H上的Glu327更为邻近的区域。如果亚基H上的Tyr397也被腺苷酰化，则它与亚基A的Tyr397上的腺嘌呤环相互作用，将亚基H上的Glu327带到与活性位点更为邻近的区域。存在于亚基H和G之间的活性位点残基之间所得的该构象变化以及亚基A上Tyr397的腺苷酰化使得活性位点的内部结构发生足够的变化，使得His211移动到位。结论谷氨酰胺合成酶的结构和分子动力学分析提出酶的腺苷酰化/去腺苷酰化状态影响酶对MgATP或Mn2ATP和NH4+或NHs特异性的可能机制是通过使两个假设的催化三联体之间发生转换。如果催化三联体在催化中发挥作用，则反应应该经过Y-谷氨酰酰基酶中间体。经鉴定在这些催化三联体中发挥作用的一些残基的定点突变导致了以下的研究。Ser52和Ser53对酶的催化活性均很重要。测定发现Ser52表现出具有腺苷酰化功能，而Ser53具有去腺苷酰化功能。然而，有可能的是这些丝氨酸残基彼此相邻，在腺苷酰化和去腺苷酰化形式的酶中均能发挥作用。当两种丝氨酸残基均被除去时，导致谷氨酰胺合成酶活性降低，由此强化了这些残基在活性位点中的重要性。因为在抑制剂存在下酶活性受到抑制，所以在丝氨酸蛋白酶抑制剂AEBSF和PMSF的存在下评价这些丝氨酸突变酶而产生的结论是Ser52和Ser53确实显示出形成部分催化三联体。双丝氨酸突变体不受PMSF或AEBSF的显著抑制。AEBSF和PMSF均表现出使ATP水解率增大并伴随谷氨酰胺的形成和转化效率的降低。这可解释为丝氨酸蛋白酶抑制剂与谷氨酸位点竞争性结合，同时仍使得ATP发生水解。尤为重要的是，在任何情况下，当发现发生抑制时，也伴随着转化效率降低。发现His210和His211对酶的功能性同样重要，并且结合模型考虑该结果，产生的结论是His210具有去腺苷酰化活性而His211具有腺苷酰化活性。所有潜在的酸残基在被除去时均影响活性。此外，考虑模型产生的结论是填充各催化三联体中酸残基功能的两种酸残基，对于酶的腺苷酰化形式是Glul29，而对于酶的去腺苷酰化形式是Glu357。在谷氨酰胺合成酶两个亚基(指定为A和B)之间的界面处发现两个假设的催化三联体，并且认为包括以下残基(其中，给出了大肠杆菌的残基编号)<table>tableseeoriginaldocumentpage73</column></row><table>去腺苷酰化GS在氮限量和低NHg浓度下生成；将酶进行去腺苷酰化，转换为含有残基Ser53(亚基B)的催化三联体；在高NH3浓度下，将酶进行腺苷酰化，转换为含有残基Ser52的催化三联体。使用Ser52'的催化位点必须使NH4+去质子化以生成氨亲核体。有人提出可通过Asp50发生NH4+的去质子化(LiawS-H，IKuo和DEisenberg(1995)ProteinScience4:2358-2365)。然而，一旦形成酰基酶中间体，可通过阳碳离子发生该NH4+的去质子化。下面讨论提出的这两种反应机理，通过该两种机理，催化三联体机理促进了氨对"谷氨酰-酰基酶中间体的亲核进攻。在使用由绵羊脑分离的谷氨酰胺合成酶进行研究之前，已经对酰基酶中间体进行了假设，其中证明了"C-谷氨酸在没有NH3的条件下与谷氨酰胺合成酶结合(KrishnaswamyPR，VPamiljans和AMeister(1962)JournalofBiologicalChemistry.237:2932-2940)。如上所述，氨亲核进攻的反应动力学显示了两套动力学常数。所提出的一个催化三联体反应机理是通过对在反应第一步形成的谷氨酰磷酸的羧基-磷酸酐中的酯键的羰基碳上进行亲核进攻，使Ser52'或Ser53'的一个"氧与谷氨酸形成共价键。通过从各Ser0Y中除去质子，His210和His211可作为一般的碱催化剂。该结合NS的质子与SerC^和底物磷酸的氧形成氢键。可通过Arg339来稳定所得的四面体含氧阴离子中间体。在下一步中，His210和His211的NS-质子转移到桥氧底物，释放酸性磷酸，并伴随形成酰基酶中间体。这发生在形成Ser52'或Ser53'的第一酰基酶中间体之后，显示出在氨的亲核进攻和其后的酶的去酰作用以及谷氨酰胺的形成的这些反应机理之间存在基本差异。有人认为丝氨酸的"选择"受活性位点的腺苷酰化状态和由ATP向谷氨酸转移磷酸过程中Mg^或Mi^+的使用的调节。可通过经鉴定为n2金属离子配体的His269调节的磷酰基转移来进行磷酸向谷氨酸的转移(Abell，LM，JSchineller,PJKeck和JVillafranca(1995)Biochemistry34:16695-16702)。His269在磷酰基转移中的作用也已在通过His269进行的新的磷酰基转移酶反应中得到证明(Kenyon，C.P.，等人(2006)，标题为"ModulationofPhosphorylTransferaseActivity"的PCT申请，代理人案号(AttorneyDocketNumber)19690-004WO1,以此同时提出申请)。在转换机理中可发挥作用的另一个因素是因为ATP使用与N7构成腺嘌呤环的方法最接近的方法，在二元复合物内Mn"离子周围折叠，所以Mn2ATP具有不同于MgATP的结构。Mn2ATP和MgATP可使GluS羰基的不同氧发生磷酸化。在水溶液中，这些通常是相同的。然而，在活性位点内，作为酰基中间体的GluO"和GluO"本质上不对称，保持它们的立体化学性。这种不对称在确定亲核进攻性质中可能很重要。因此，可以想象的是，Glu(^或GluO。磷酸化产生的定向的结果是，可能发生Swl或Sw2亲核进攻。因此，图1示出了用于酶的腺苷酰化形式的可能的模型机理，该酶的腺苷酰化形式使用Ser52VHis211/Glul29催化三联体，在氮过量和碳限量条件下生长的细胞内形成。谷氨酸酰基中间体的Y-羧基可在NH4+的去质子化中发挥作用。在Y-谷氨酰磷酸去磷酸化过程中生成第一四面体过渡态。该质子在激活羧基的该两性离子形式中增加了其对亲核进攻的敏感性。发现腺苷酰化酶在Mn2ATP存在下的总活性通常低于去腺苷酰化酶的总活性。然而，可将腺苷酰化酶的高活化能与必须在高NH4+浓度下将NH/去质子化为NH3+H+的酶相联系以生成亲核体。图2示出了用于酶的去腺苷酰化形式可能的模型机理，该酶的去腺苷酰化形式使用Ser537His210/E357催化三联体，在氮限量和碳过量条件下生长的细胞内形成。在形成第一四面体过渡态后，以及在His210的N6质子已被转移到底物后，释放酸性磷酸，形成酰基酶中间体。可通过含氧阴离子穴中的Arg339来稳定酰基酶复合物。然后发生氨的亲核进攻。因为酶的去腺苷酰化形式由在氮限量条件下的细胞产生，所以认为NH4+完全离解为NH3+H+，是NH3而不是NH/被带到活性位点。已经显示出(NH4)2S04水溶液离解为2NH4+和S042+。然而，在稀释溶液中，因为浓度趋于无限稀释，所以认为2NH4+进一步离解为2NH3和2H+。因此，有可能发生可能的第三种机理，所述机理涉及促进氨对酰基酶的亲核进攻。这是"气相"或"无溶剂"的反应。涉及阴离子和极性分子的双分子亲核取代反应的速率从气相到极性介质(溶剂)改变20个数量级以上(Olmstead，W.N.和J.I.Brauman(1977)J.Am.Chem.Soc.99:4219-4228;Pellerite，M.J.和J.I.Brauman(1980)J.Am.Chem.Soc.102:5993-5999;Shaik，S.S.和A.Pross(1982)J,Am.Chem.Soc.104:2708-2719;Chandrasekhar，J.，Smith,S.F.和W.L.Jorgensen(1984)J.Am.Chem.Soc.106:3049-3050;Chandrasekhar,J.，Smith,S.F.和W.L.Jorgensen(1985)J.Am.Chem.Soc.107:154-163;Chandrasekhar,J.和W.L.Jorgensen(1985)J.Am.Chem.Soc.107:2974-2975)。有人认为这归因于氢键强度降低引起的水化导致活化能的提高。离子(亲核体)去溶剂化所需的能量消除了离子偶极力。水化产生的具有分散电荷分布的过渡态与溶剂形成较弱氢键。由此产生了具有显著大于气相的、大而窄的中心能垒的单峰能量图谱。因此有假设认为在氨浓度非常低的情况下，活性位点"关闭"，由此降低或消除了活性位点内的溶剂可接近区域，使得气相类型的反应发生。当酶去腺苷酰化并且以Mg"形式发挥作用时可能发生此现象。这也解释了在低底物浓度时，酶对氨具有非常低的Km的原因。因为ATP水解为生成的谷氨酰胺的转化效率低至36%，因此，在突变酶Y397V、S52AS53AY397V、H210VY397V和H211VY397V的酶反应中，H20的不利影响很明显。总之，数据显示谷氨酰胺合成酶在由第一步反应合成的Y-谷氨酰磷酸形成谷氨酰胺过程中使用的反应机理通过类似于丝氨酸蛋白酶使用的两个催化三联体而发生。对于腺苷酰化形式的大肠杆菌酶，这些催化三联体包括Ser52'、His211和Glul29，而对于去腺苷酰化形式的大肠杆菌酶包括Ser53'、His210和Glu357。本文已经描述了本发明的一些实施方式。然而，可以理解的是，在不偏离本发明精神和保护范围的条件下，可作出各种修改。因此，其它实施方式也落在以下权利要求书的范围内。权利要求1.一种产生谷氨酰胺合成酶多肽的谷氨酰胺形成活性位点活性的试验抑制剂的计算机辅助方法，所述方法使用包括处理器和输入设备的程序式计算机，所述方法包括(a)向所述输入设备输入包括谷氨酰胺形成活性位点结构的数据；(b)使用所述处理器将试验抑制剂分子对接到所述谷氨酰胺形成活性位点内；以及(c)基于所述对接，确定所述试验抑制剂分子是否抑制所述谷氨酰胺形成活性位点的活性。2.根据权利要求l所述的方法，进一步包括将，谷氨酰磷酸部分对接到所述活性位点内。3.根据权利要求1所述的方法，进一步包括生成由步骤(c)确定的试验抑制剂以抑制所述谷氨酰胺形成活性位点的活性并体外评价所述试验抑制剂对谷氨酰胺合成酶多肽的抑制活性。4.根据权利要求3所述的方法，其中所述体外评价包括使用能测量ATP水解、ADP形成、AMP形成、谷氨酸利用或谷氨酰胺形成的分析法。5.根据权利要求3所述的方法，进一步包括体外评价相对于去腺苷酰化的谷氨酰胺合成酶多肽，所述试验抑制剂对腺苷酰化的谷氨酰胺合成酶多肽有差别的抑制活性。6.根据权利要求l所述的方法，进一步包括生成所述试验抑制剂并评价所述试验抑制剂对含有GSI-a或GSI-p谷氨酰胺合成酶基因的细菌生长的抑制活性。7.根据权利要求6所述的方法，其中所述GSI-P细菌选自GSI-p细菌可选自白喉棒状杆菌、淋球菌、大肠杆菌、鼠伤寒沙门氏杆菌、伤寒沙门氏杆菌、肺炎克雷伯菌、粘质沙雷氏菌、普通变形杆菌、痢疾志贺菌、霍乱弧菌、铜绿假单孢菌、粪产碱杆菌、幽门螺杆菌、流感嗜血杆菌、百日咳杆菌、支气管炎博德特菌、脑膜炎奈瑟菌、羊布鲁氏菌、结核分枝杆菌、麻风分枝杆菌、梅毒密螺旋体、问号钩端螺旋体、衣氏放线菌、星形诺卡菌、氧化亚铁硫杆菌、巴西固氮螺菌、鱼腥藻、Fremyelladiplosiphon和天蓝色链霉菌，以及其中所述GSI-a细菌可选自蜡状芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、炭疽芽孢杆菌、肺炎链球菌、化脓链球菌、金黄色葡萄球菌、肉毒梭菌、破伤风梭菌和产气荚膜梭菌。8.根据权利要求7所述的方法，其中所述GSI-P细菌是结核分枝杆菌。9.根据权利要求6所述的方法，进一步包括评价所述试验抑制剂对真核细胞生长的抑制活性。10.根据权利要求9所述的方法，其中所述真核细胞是哺乳动物细胞。11.一种产生抑制谷氨酰胺合成酶多肽的谷氨酰胺形成活性位点活性的化合物的方法，所述方法包括(a)提供谷氨酰胺合成酶多肽的谷氨酰胺形成活性位点的三维结构；以及(b)基于所述三维结构，设计能抑制所述谷氨酰胺形成活性位点和"谷氨酰磷酸中间体之间相互作用的试验化合物。12.根据权利要求11所述的方法，其中所述试验化合物能抑制所述谷氨酰胺形成活性位点的腺苷酰化催化三联体位点和，谷氨酰磷酸中间体之间的相互作用，或者能抑制所述谷氨酰胺形成活性位点的去腺苷酰化催化三联体位点和，谷氨酰磷酸中间体之间的相互作用。13.根据权利要求ll所述的方法，其中所述试验化合物能抑制在所述谷氨酰胺形成活性位点的腺苷酰化催化三联体位点中酰基-酶中间体的形成，或者能抑制在所述谷氨酰胺形成活性位点的去腺苷酰化催化三联体位点中酰基-酶中间体的形成。14.根据权利要求12或13所述的方法，进一步包括生成步骤(b)的所述试验化合物并体外评价所述试验化合物对谷氨酰胺合成酶多肽的抑制活性。15.根据权利要求12或13所述的方法，进一步包括生成步骤(b)的所述试验化合物并评价所述试验化合物对含有GSI-a或GSI-卩谷氨酰胺合成酶基因的细菌生长的抑制活性。16.根据权利要求15所述的方法，其中含有GSI-P基因的所述细菌选自白喉棒状杆菌、淋球菌、大肠杆菌、鼠伤寒沙门氏杆菌、伤寒沙门氏杆菌、肺炎克雷伯菌、粘质沙雷氏菌、普通变形杆菌、痢疾志贺菌、霍乱弧菌、铜绿假单孢菌、粪产碱杆菌、幽门螺杆菌、流感嗜血杆菌、百曰咳杆菌、支气管炎博德特菌、脑膜炎奈瑟菌、羊布鲁氏菌、结核分枝杆菌、麻风分枝杆菌、梅毒密螺旋体、问号钩端螺旋体、衣氏放线菌、星形诺卡菌、氧化亚铁硫杆菌、巴西固氮螺菌、鱼腥藻、Fremydladiplosiphon和天蓝色链霉菌，其中含有GSI-a基因的所述细菌选自蜡状芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、炭疽芽孢杆菌、肺炎链球菌、化脓链球菌、金黄色葡萄球菌、肉毒梭菌、破伤风梭菌和产气荚膜梭菌。17.根据权利要求15所述的方法，进一步包括评价所述试验化合物对真核细胞生长的抑制活性。18.根据权利要求17所述的方法，其中所述真核细胞是哺乳动物细胞。19.一种产生抑制谷氨酰胺合成酶多肽的谷氨酰胺形成活性位点的催化三联体位点活性的试验化合物的方法，所述方法包括(a)提供包括谷氨酰胺形成活性位点的催化三联体位点的三维结构；以及(b)基于所述三维结构，设计能形成带有所述催化三联体位点的残基的酰基-酶中间体的试验化合物。20.根据权利要求19所述的方法，其中所述试验化合物能形成带有对应于大肠杆菌的谷氨酰胺合成酶多肽的Ser52或Ser53的所述结构中的残基的酰基-酶中间体。21.—种体外筛选试验蛋白酶抑制剂化合物以确定所述试验蛋白酶抑制剂化合物是否抑制谷氨酰胺合成酶多肽的谷氨酰胺形成活性位点活性的方法，所述方法包括(a)使谷氨酰胺合成酶多肽与试验蛋白酶抑制剂化合物接触；以及(b)确定相对于还没有与所述试验丝氨酸蛋白酶抑制剂化合物接触过的谷氨酰胺合成酶多肽的活性，所述谷氨酰胺合成酶多肽的谷氨酰胺形成活性位点的活性是否有所降低。22.根据权利要求21所述的方法，其中通过使用能测量ATP水解、ADP形成、AMP形成、谷氨酸利用或谷氨酰胺形成的分析法，测量所述谷氨酰胺形成位点的活性。23.根据权利要求21所述的方法，其中所述试验蛋白酶抑制剂化合物是试验丝氨酸蛋白酶抑制剂化合物。24.根据权利要求23所述的方法，其中在步骤(a)中，试验蛋白酶抑制剂化合物的文库逐一与所述谷氨酰胺合成酶多肽接触。25.根据权利要求24所述的方法，其中所述文库是试验丝氨酸蛋白酶抑制剂化合物的文库。26.—种用于抑制GS多肽的谷氨酰胺形成活性位点活性的体外方法，所述方法包括使GS多肽与含有丝氨酸蛋白酶抑制剂的组合物接触。27.根据权利要求26所述的方法，其中所述丝氨酸蛋白酶抑制剂是肽基-精氨酸醛衍生物、吡咯并吡啶垸衍生物、喹啉酮衍生物或1-甲基苯并咪唑衍生物。28.—种用于抑制含有GSI-a或GSI-p基因的细菌生长的体外方法，所述方法包括使所述细菌与含有丝氨酸蛋白酶抑制剂的组合物接触。29.—种用于治疗、预防或改善与哺乳动物细菌感染有关的一种或多种症状或障碍的方法，其中所述细菌感染由含有GSI-a或GSI-P基因的细菌引起，所述方法包括将含有丝氨酸蛋白酶抑制剂的组合物给予所述哺乳动物。30.—种用于抑制谷氨酰胺合成酶多肽的谷氨酰胺形成位点活性的体内方法，所述方法包括将含有丝氨酸蛋白酶抑制剂的组合物给予怀疑遭受或正在遭受细菌感染的哺乳动物，其中所述细菌感染由含有GSI-a或GSI-I3基因的细菌引起。31.根据权利要求28-30中任一项所述的方法，其中所述含有GSI-P基因的细菌选自白喉棒状杆菌、淋球菌、大肠杆菌、鼠伤寒沙门氏杆菌、伤寒沙门氏杆菌、肺炎克雷伯菌、粘质沙雷氏菌、普通变形杆菌、痢疾志贺菌、霍乱弧菌、铜绿假单孢菌、粪产碱杆菌、幽门螺杆菌、流感嗜血杆菌、百日咳杆菌、支气管炎博德特菌、脑膜炎奈瑟菌、羊布鲁氏菌、结核分枝杆菌、麻风分枝杆菌、梅毒密螺旋体、问号钩端螺旋体、衣氏放线菌、星形诺卡菌、氧化亚铁硫杆菌、巴西固氮螺菌、鱼腥藻、Fremyelladiplosiphon和天蓝色链霉菌。32.根据权利要求29或30所述的方法，其中所述哺乳动物是人。全文摘要本发明提供一种筛选和设计作为谷氨酰胺合成酶抑制剂的化合物的方法。本发明还提供对治疗、预防和/或改善包括结核分枝杆菌的细菌感染有用的化合物以及含有该化合物的组合物，所述化合物例如为丝氨酸蛋白酶抑制剂。文档编号G01N33/68GK101443353SQ200680054601公开日2009年5月27日申请日期2006年3月15日优先权日2006年3月15日发明者林登·凯里·奥德菲尔德,科林·彼得·凯尼恩申请人:Csir公司