一种分泌能力提高的天冬酰胺酶突变体及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种分泌能力提高的天冬酰胺酶突变体及其应用，属于酶工程领域。
【背景技术】
[0002] L-天冬酰胺酶（EC3. 5. 1. 1)是一种有抗癌活性的蛋白酶，能专一催化L-天冬酰胺 水解成天冬氨酸和NH3。L-天冬酰胺酶的生理作用主要表现为对某些肿瘤的抑制作用，尤 其对急性白血病和恶性淋巴肿瘤有效。L-天冬酰胺酶已成为治疗白血病非常有效的药物， 对骨髓细胞没有抑制作用。
[0003]L-天冬酰胺酶有两种类型，L-天冬酰胺酶I和L-天冬酰胺酶II，Escherichia coli、Erwiniachrysanthemi、Β·subtilis等均包含这两种L-天冬酰胺酶，研究证实仅 L-天冬酰胺酶II具有抗癌作用，来自Escherichiacoli和ErwiniachrysanthemiL-天 冬酰胺酶II已被开发为治疗急性淋巴细胞白血病的有效药物，目前研究的大部分是具有 抗肿瘤效果的L-天冬酰胺酶II。
[0004] L-天冬酰胺酶可以减少食物中丙烯酰胺的生成。丙烯酰胺主要是由食品原料中 的还原糖和天冬酰胺在高温加热过程中通过美拉德反应生成，在食物中加入天冬酰胺酶可 以水解天冬酰胺，从源头上减少丙烯酰胺的生成。一些微生物、哺乳动物及植物被证实含 有L-天冬酰胺酶。因为动物血清中L-天冬酰胺酶含量低，且提取工艺复杂，微生物具有 易培养，成本低等优点，成学者研究的重点，目前研究的产L-天冬酰胺酶微生物主要包括 Escherichiacoli、Erwiniacarotovora、Erwiniachrysanthemi等，但野生菌株L-天冬酉先 胺酶产量低，近年来利用基因工程技术将L-天冬酰胺酶基因克隆到大肠杆菌中，获得L-天 冬酰胺酶的高效表达，利用工程菌产L-天冬酰胺酶已成为一个重要来源。
[0005] 如何在食品安全菌株中表达L-天冬酰胺酶并提高L-天冬酰胺酶分泌能力，是目 前亟待解决的问题。
【发明内容】
[0006] 为了克服上述问题，以高效分泌信号肽菌株为基础，通过构建p43强启动子菌株， 实现天冬酰胺酶在食品级安全菌株-枯草芽孢杆菌中的高效表达，通过缺失N端残基，进一 步提高天冬酰胺酶的表达强度，实现天冬酰胺酶在枯草芽孢杆菌中高效表达，得到了天冬 酰胺酶分泌能力提高的菌株。
[0007] 本发明的第一个目的是一种分泌能力提高的天冬酰胺酶突变体，所述突变体的氨 基酸序列是SEQIDNO. 1所示的序列。
[0008] 所述突变体的核苷酸序列是SEQID N0. 2所示的序列。
[0009] 所述天冬酰胺酶是L-天冬酰胺酶II。
[0010] 本研究中的突变体为使用了WapA外源信号肽的天冬酰胺酶的基础上做的改造， 也就是在天然的（NCBI上公布的NC-000964. 3)天冬酰胺酶的基础上先替换了信号肽，然后 再次基础上对天冬酰胺酶N端进行的缺失。
[0011] 本发明的第二个目的是提供一种重组枯草芽孢杆菌，所述重组枯草芽孢杆菌以 PP43NMK质粒为载体，表达含有WapA信号肽的L-天冬酰胺酶突变体基因。
[0012] 在本发明的一种实施方式中，所述重组枯草芽孢杆菌是以枯草芽孢杆菌WB600为 宿主构建的。
[0013] 在本发明的一种实施方式中，所述含有WapA信号肽的L-天冬酰胺酶突变体基因 的氨基酸序列是SEQIDN0. 1。
[0014] 在本发明的一种实施方式中，所述含有WapA信号肽的L-天冬酰胺酶突变体基因 的核苷酸序列是SEQIDN0. 2。
[0015] 在本发明的一种实施方式中，所述含有WapA信号肽的L-天冬酰胺酶突变体基因 是连接到PP43NMK质粒的ΚρηI，PstI酶切位点，然后转化到枯草芽孢杆菌WB600中进行 表达。
[0016] 本发明的第三个目的是提供一种发酵生产天冬酰胺酶的方法，是以所述重组枯草 芽孢杆菌为生产菌株，将种子液按照4 %的接种量转接于发酵培养基中，37°C发酵培养。
[0017] 在本发明的一种实施方式中，所述方法通过补加酸碱控制pH为7. 0,并控制发酵 液溶氧高于20%，发酵过程中补加蔗糖和蛋白胨进行高密度发酵。
[0018] 本发明还要求保护编码所述突变体的核苷酸序列、表达所述突变体的基因工程 菌。
[0019] 本发明还要求保护所述天冬酰胺酶突变体、所述的重组枯草芽孢杆菌在制备药物 方面的应用。
[0020] 本发明的有益效果：
[0021] 本发明通过对野生天冬酰胺酶的氨基酸序列的N端的进行氨基酸缺失突变，得到 了一种分泌能力提高的天冬酰胺酶突变体，并构建了表达该突变体的重组菌。与野生天冬 酰胺酶相比，本发明的突变体的胞外分泌能力提高了 3. 14倍。本发明构建的重组菌，发 酵生产天冬酰胺酶酶活达到407. 6U/mL，生产率达到9. 26lV(mL/h)，为目前报道的最高的 产量。其产量是含有野生型信号肽的枯草芽孢杆菌的4. 5倍（Cloning,expression,and characterizationofL-asparaginasefromanewlyisolatedBacillussubtilis B11-06)、重组大肠杆菌的 8. 71 倍（201510102732. 6)。
【附图说明】
[0022] 图1 :突变株发酵酶活；
[0023] 图 2 :SDS_PAGE分析；
[0024] 图3:补料分批发酵法WB43H-D30生产L-ASP。
【具体实施方式】[0025] 培养基：
[0026] LB培养基：胰蛋白胨 10g/L、酵母粉 5g/L、NaCl10g/L，ρΗ7· 0 ;
[0027] 发酵培养基：大豆蛋白胨10g/L，玉米浆5g/L，尿素lg/L，蔗糖35g/L，磷酸氢二钾 2. 3g/L，磷酸二氢钾L7g/L，硫酸镁 0· 75g/L，氯化钠 5g/L;调节ρΗ6· 8-7. 0。
[0028] 天冬酰胺酶酶活力的测定：
[0029] 采用分光光度法测定天冬酰胺酶酶活。1个单位天冬酰胺酶酶活定义为：酶活 定义：在37°C反应条件下，每分钟内能催化L-天冬酰胺释放Ιμπιο?NH3所需要的酶量 为一个酶活单位（U/ml)。酶活测定条件：37°C条件下，lml10mMΚ2ΗΡ04-ΚΗ2Ρ04(ΡΗ7. 5)， 0.lml189mM天冬酰胺，0.lml发酵上清液，保温30分钟，0. 5ml1. 5ΜTCA终止反应。利用 ShimadzuUV-1240在436nm处测定吸光值，通过硫酸铵绘制标准曲线，根据标准曲线计算酶 活。
[0030] 实施例1:强启动子高效表达菌株的构建
[0031] 设计L-ASP的上下游引物Pl、P2(如表1所示），以前期构建的 pMA0911-w