通过使用融合蛋白生产酰胺化肽的方法

专利名称：通过使用融合蛋白生产酰胺化肽的方法
技术领域：
本发明涉及通过重组方法、特别地但不仅仅进行羧基末端修饰如酰胺化作用生产肽的方法。
“肽”是不太准确地应用于通过氨基和羧基末端连接的氨基酸链，专指三到一百以上但也可能更多成分的序列的术语。有许多天然产生的肽的例子作用为激素、信使、生长因子、抗微生物剂、表面活性剂等，也可预期多种医药和其它用途。
目前，至少有三种肽的主要来源，从天然资源中提取、化学合成和来源于用重组DNA构建体转化的有机体。使用转化有机体途径的优点是其合成方法的生物保真性、合成化学上不适宜序列的能力、对化学方法的避免、使用溶剂等，以及特别地对于较长肽的成本-有效性。
通过重组技术制备肽的缺点是所用的有机体在合成以及如果需要分泌短序列氨基酸时显得不理想。所以，许多为工业应用考虑的方法利用了融合蛋白，其中短肽序列制成在另一蛋白上氨基或羧基末端的延伸。尽管这些融合蛋白可大量生产，并常通过采用简化融合蛋白纯化的特殊性质加以纯化，但在回收肽时会遇到困难。蛋白是化学稳定的分子并因此需要特异切割策略以回收具有确定的氨基和羧基末端的完整肽。
可看到一大系列的蛋白切割技术。它们从特异氨基酸处的化学切割到使用序列特异性酶进行酶切。化学切割的实施例包括在甲硫氨酸残基之后用溴化氰切割以及在天冬酰胺-甘氨酸的氨基酸对之间用羟胺切割。适于在特异蛋白序列切割的酶的例子包括可在(天冬氨酸)4-赖氨酸序列之后进行切割的肠激酶，以及在碱性氨基酸赖氨酸或精氨酸之后进行切割的凝血酶。
这两种切割策略的普遍问题是由于肽中内部位点存在和产生真正氨基末端的需要而发生的序列限制。例如，溴化氰只在肽中没有内部甲硫氨酸时有用，并且凝血酶可在碱性氨基酸后的大量不同位点切割。酶切割从加工经济学角度来看还有其它问题。酶必须来自可接受的有效来源(肠激酶的常见来源是小牛肠道内皮)并能获得经济上可接受的量。
羧基末端酰胺化是在许多具有潜在商业利益的生物活性肽中发现的常见翻译后修饰。例子包括降钙素、爪蟾抗菌肽等。在许多例子如降钙素中，天然酰胺化的肽的活性几乎是非酰胺化肽的二千倍。
有许多不同的化学和物理方法设计用来产生羧基末端酰胺化肽。然而，象任何其它加工步骤一样，每一步从增加终产物的总花费角度考虑都有缺点。
本发明描述了用于在重组系统中生产作为融合蛋白氨基末端延伸的肽的方法。我们提供新的方法，其中肽从融合蛋白上的切割和肽的修饰如羧基酰胺化可在单独的步骤中通过一系列相连接的反应完成。该方法从生物表达系统的低花费和合成保真性获益，没有由分离的切割步骤的需要带来的缺点。
因此，在第一方面，本发明提供了生产肽的方法，其中包括以下步骤表达作为融合蛋白一部分的肽，接下来通过酰基受体如含硫还原剂从融合蛋白上释放肽。适当地，至少部分融合蛋白是能催化肽作为酰基部分转移给适当受体如近端硫原子以形成硫代-酯的分子。
在更优选的实施方案中，肽经过化学修饰，例如在从融合蛋白释放出来之后在其羧基末端酰胺化。适当地，酰胺化步骤在适当pH、一定来源的铵离子参与下进行并且酰胺化步骤与肽释放同时发生。可用这些方法制备的酰胺化肽的例子包括鲑降钙素、人降钙素、促黄体生成素释放激素、催产素、胃泌素神经肽Y、血管升压素、促肾上腺皮质素释放激素，生长激素释放激素、人降钙素基因相关肽、胃泌素、D-tyr-trp-gly、phe-gly-phe-gly、gly-phe-gly、黑素细胞刺激素前体、Sectetin、促甲状腺素释放激素、糊精、P物质、胰多肽、缩胆囊素、胃泌素分泌因子、phe-his-ile、phe-tyr-tyr、蛙皮降压肽(Savagin)、肥大细胞脱粒肽M、雨蛙肽和FMRF酰胺。
然而，也可能在缺乏氨的情况下进行肽的简单水解，导致自由羧酸末端基团的形成。这使得本发明的方法适于进行用于医药或其它用途的带有自由羧基末端的肽的商业生产。这些肽的例子包括Hirulog、爪蟾抗菌肽、胸腺素α-1、脑肽(brain naturetic peptide)、心房肽(atrialnaturetic peptide)或杀菌/通透性-增加蛋白。
本发明的方法例如可利用设计用来制备作为融合蛋白的蛋白的、商业上可获得的表达载体。该载体包含修饰的自剪切蛋白即intein，使得可能通过简单的化学反应将蛋白从融合伴侣上释放出来。本发明利用修饰的化学条件/步骤以导致融合蛋白的切割从而释放所需要的能通过如羧基末端的酰胺化作用而得到修饰的肽。
Inteins是在氨基和羧基末端表达的侧翼蛋白序列。氨基和羧基末端序列已命名为exteins以符合外显子和内含子的DNA命名法。一个看来典型的inteins新兴家族的成员是来自酵母的VMA1基因产物。它的分子量约为50kDa并在氨基末端(半胱氨酸)和羧基末端(组氨酸和天冬酰胺)包含必需氨基酸。并且，羧基末端exteins必须以半胱氨酸开始。在释放完成后的一些点，氨基末端的肽键断裂并且extein转移到邻近半胱氨酸的硫原子上以形成硫代-酯。然后该键在羧基末端extein的起始与半胱氨酸互换，然后在邻近天冬酰胺的参与下在intein的该末端与肽键互换。这些协同反应的总效应是两个exteins无缝隙地连接并释放intein。
对其中intein的任一末端的必需基团和exteins的近端已经过系统性替换的一系列突变体进行分析之后将呈现对这些反应的详尽理解。该认识使得其中氨基末端extein可由任何其它蛋白替换并且自剪切功能已丧失的突变inteins的设计成为可行。但是，最终融合蛋白的切割仍可能通过加入外部化学试剂如还原剂二硫苏糖醇完成。融合蛋白通过加入的逐渐在溶液中水解为游离酸的还原剂释放为硫代-酯。
降钙素是适于用本发明描述的方法制备的在医学和商业上重要的肽的例子。它包含32个氨基酸并在羧基末端酰胺化。其功能活性和氨基酸序列在物种之间高度保守。因此原先主要从天然来源获得但现在通过直接合成制备的鲑降钙素广泛应用于临床。过去，治疗集中于乳腺派杰病和低钙血中风症。然而，最近有治疗绝经后妇女骨质疏松症的更大量物质的需要。该应用需要大量物质，使生产花费成为日益重要的因素。
为使用intein载体制备降钙素，需要制备编码降钙素序列的互补寡核苷酸，它的侧翼是设计用来在修饰的intein的适当5’位点进行插入的限制性位点。这些位点必须经过选择以使肽的编码序列与表达蛋白的剩余部分在同一编码框中。适当的寡核苷酸能通过为那些本领域技术人员所熟知的任一方法制备，包括最明显的直接合成和用设计为包含方便的限制性位点的引物从天然序列进行聚合酶链式反应扩增。之后将该DNA构建体转化入适当的表达系统并收获最终的融合蛋白。
在进一步改良的系统中融合蛋白还包含一个标记，可通过亲和或其它层析方法对融合蛋白并因此对肽进行鉴定和/或纯化。适当标记的例子包括特异几丁质结合区或其部分、酸性或碱性氨基酸的重复，多聚组氨酸序列、谷胱甘肽S转移酰和溶菌酶。例如，intein的羧基末端可与特异几丁质结合区融合。该物质紧密结合到装有几丁质珠的填充柱上并可用于完整融合蛋白的亲和纯化。大量洗涤之后，柱子用适当的切割剂处理并洗脱释放的靶肽。
尽管上述基于intein的载体是设计用于大肠杆菌中的，但任何能在商业范围内运作的表达系统都是合适的。其它载体可设计在特定表达系统中最佳使用。例如，如果选择哺乳动物表达系统，其蛋白编码区应有针对该特定系统的最佳密码子选择。表达也可通过使用较小亲和标记如上述的酸性或碱性氨基酸重复进行鉴定和/或纯化而得到改进，以使污染蛋白可通过离子交换层析或在金属螯合介质中包埋多聚组氨酸序列纯化而得以消除。可改善从哺乳动物系统(目前的大肠杆菌载体是设计用于细胞内蛋白合成)分泌的进一步修饰将是在降钙素上添加分泌前导序列以促进向介质中或转基因动物的乳中的分泌。适当地，该前导序列应在分泌过程中由天然的加工酶去除。
可用于表达肽融合蛋白的表达系统的实施例包括细菌(大肠杆菌、枯草杆菌等)、酵母(酿酒酵母、P.pastoralis等)、昆虫细胞(草地夜蛾)、哺乳动物表达系统(中国仓鼠卵巢，幼仓鼠肾等)、于乳或其它体液中的转基因哺乳动物表达(优选地猪、母牛、绵羊、山羊、兔等)和植物(马铃薯、玉米等)。在大肠杆菌的表达系统中，起始甲硫氨酸会留在表达产物里。因此，当所感兴趣的肽是在其序列中不包含多余的甲硫氨酸时，该起始甲硫氨酸可用溴化氰去除。这样的肽的一个例子是降钙素。
对于这些系统中的任何一个以及细胞内或细胞外合成，表达可通过适当选择前导序列、密码子使用、intein或其突变体和纯化策略而得以优化。技术人员会认识到本发明并不依赖intein的任何特别的表现形式或任何物种作为来源。例如，使用整个intein分子并不是必需的，大量序列可能与所需的方法并不相关并且可能分子的大部分在功能上都是不需要的。确实，“intein”定义之外的其它蛋白也可能将位于靶肽羧基末端的肽键转移给适当的硫醇基团从而建立有伴随酰胺化作用的切割所需的硫代-酯基团。
硫代-酯与肽键或氧-酯键相比是相对具有反应活性的化学基团，并因此易于在温和的反应条件下转变为酰胺。在融合肽可转变为羧基末端酰胺的正常切割和释放途径中有两个点。第一点并可能是最适当的点是在肽通过添加硫醇试剂已从融合伴侣上释放出来之后。优选的试剂是二硫苏糖醇但任何含硫还原剂也能有效发挥作用。该反应本质上是硫醇-交换反应，其中在肽的羧基末端之间形成的硫醇-酯并将intein半胱氨酸的硫转移给二硫苏糖醇的硫原子之一。象任何化学反应一样，在位于intein氨基末端的半胱氨酸胺和相同氨基酸残基的硫之间的酰基移动反应是一个平衡。相对于上述的酵母intein，该平衡在利于胺集团时移动并且硫代-酯是次要成分。
加入的硫醇试剂去除该硫代-酯并因此而驱动反应向产生更多硫代-酯的方向进行直至所有肽均有效释放为自由的硫代-酯。释放硫代-酯对于水的水解(将会产生不需要的游离酸)是相对稳定的并因此适于通过任何利于增加酰胺形成的化学条件而进行的切割。
其中肽显示为硫代-酯的第二点是intein本身，但如上所述，该物质是次要成分。但是，还是可能设计化学条件使得同时释放作为酰胺化物质的肽。
预期可有利于伴随酰胺化作用的硫代-酯切割的条件很多并且下列内容仅是为了说明可能的试剂和反应的代表性选择。在化学上，酰胺可通过用氨和相关化合物裂解硫代-酯形成。这需要羰基的正电荷增强(这是相邻硫原子的效应)的条件并需要氨中氮的弧对电子。在水溶液中，由盐例如磷酸铵或硫酸铵提供的正电荷铵离子与不带电荷的氨即反应性物质产生平衡，并且在氢离子浓度降低时游离氨的浓度升高。因此可以预期提高酰胺产物形成的反应尽管可能在相对低的pH值如pH4.0到6.0开始，但会在pH在6.0到9.0或甚至10.0的范围内增加时反应得更快，其中平衡向利于氨形成的方向显著移动。
最佳的范围将在肽底物自身所能耐受的最高pH和反应仍能以可接受的速率继续进行的最低pH之间进行折衰。该最佳范围将由肽本身的序列和其它融合伴侣特性的相关因素以及与加工过程相关的问题特别是纯化所决定。相似的条件和限制因素可能使用，看切割/酰胺化反应是同时还是相继发生。本领域技术人员可预期有许多其它化学条件，无论是在水溶还是非水溶系统中，都能实现所需反应。以上仅表示对适当方法的说明并不意味着排除其它可能的方法。
本发明现在以下列实施例加以描述，这将不应在任何方面对本发明构成限制。实施例1甘氨酸延伸的鲑降钙素1.1.克隆策略载体pCYB1，从New England Biolabs获得，含有用于翻译起始的NdeI位点和直接与intein相邻的SapI位点，用于克隆和表达甘氨酸延伸的鲑降钙素(sCT-G)。sCFG的编码序列合成为103碱基和104碱基的两个互补单链寡核苷酸。优化密码子以在大肠杆菌中表达。两链的退火产生与NdeI(5’末端)和SapI位点(3’末端)互补的突出端。双链寡核苷酸插入到以NdeI和SapI消化的pCYB1中。融合基因的表达受控于Plac启动子并且由于载体上lacq基因的存在通过IPTG进行调节。1.2.融合蛋白的表达和分析将含有sCFG的pCYB1载体转化至DH5α中，让细胞生长，用IPTG诱导，收获并通过超声裂解。表达的融合蛋白从几丁质琼脂糖中获得并经洗涤然后在SDS-PAGE样品缓冲液中煮沸。上清在16％的SDS-PAGE胶中电泳并且蛋白通过考马斯染色目测或电印迹到PVDF膜上用于N-末端测序。序列分析显示SCT-G N-末端在Ser 2和Thr 6两个位置被截短。1.3.融合蛋白的切割和肽酰胺化几丁质琼脂糖结合的融合蛋白用20mM Hepes pH8.0，40mMDTT(切割缓冲液A)或加有3.0M碳酸氢铵的切割缓冲液A(切割缓冲液B)进行洗涤并于4℃放置过夜。释放的sCT-G从柱上洗下来并结合到阳离子交换树脂上再用盐梯度洗脱而获得。用胰蛋白酶消化后C18RP-高效液相层析的分析显示用切割缓冲液B形成的产物包含大于90％的酰胺化C-末端而用切割缓冲液A获得的产物是羧基C-末端和假定来自于intein N-末端的由单独Cys残基延伸的加合物的混合物(

图1)。实施例2促黄体生成素释放激素(LHRH)2.1克隆策略克隆除了包含LHRH编码序列的寡核苷酸外，准确按照SCT-G中所描述的进行(Tan，L.和Rousseau，P.，Biochem.Biophys.Res.Com.1091061-1071(1982))。2.2融合蛋白表达及分析如sCT-G中所述。N-末端测序证明LHRH在N-末端通过从大肠杆菌起始信号中保留的单独的Met残基而延伸。2.3.融合蛋白切割和肽酰胺化LHRH融合蛋白用与sCT-G融合蛋白相同的方式处理直至最终的阳离子捕获步骤。柱洗涤直接应用于电喷射质量分光计并且重建数据以给出母离子的质量(图2)。来自于切割缓冲液B的LHRH(如实施例1所述)导致质量1331Da伴随Met延伸的、酰胺化的分子的母离子。来自于切割缓冲液A的LHRH(如实施例1所述)给出质量1332Da伴随Met延伸的游离酸的母离子。1Da的不同预计是酰胺和羧酸之间的质量差异。实施例3人糊精的克隆来自New England BioLabs(NEB)的IMPACTI(Intein介导的以亲和几丁质结合标记进行的纯化)蛋白纯化系统提供4个大肠杆菌表达载体，它们之间可用的克隆位点有所不同。人糊精用NEB载体pCYB1克隆，它包含NdeI位点用于翻译起始和直接与intein相邻的SapI位点。
人糊精序列合成为分别是115和116碱基的两条互补单链寡核苷酸。优化密码子以在大肠杆菌中表达。两条链的退火产生与NdeI(5’末端)和SapI位点(3’末端)互补的突出端。双链寡核苷酸可直接插入到事先用NdeI和SapI消化的pCYB1中。
PCYB15’CAT ATG GCT AGC...........................GGC TCT TCC TGC TTT 3’3’GTA TAC CGA TCG...........................CCG AGA AGG AGC AAA 5’NdeISapI人糊精NdeI BspMICATATGAAATGCAACACCGCGACCTGCGCGACCCAGCGCCTGGCGGTATACTTTACGTTGTGGCGCTGGACGCGCTGGGTCGCGGACCGCMboI DdeIAACTTCCTGGTGCATAGCAGCAACAACTTCGGCGCGATCCTGAGCTTGAAGGACCACGTATCGTCGTTGTTGAAGCCGCGCTAGGACTCGAGCACCAACTGGGCAGCAACACCTATTGCTTTTCGTGGTTGACCCGTCGTTGTGGATAACGAAA实施例4在大肠杆菌中表达融合蛋白及融合蛋白纯化和释放肽的基本方法在细菌中表达需要用表达构建体使用一系列标准方法的任一方法转化细胞(Maniatis等，同上)。细胞生长之后，常常用诱导启动子如β-半乳糖苷酶启动子和小分子诱导剂如IPTG的结合来诱导靶融合蛋白的表达。融合蛋白经细胞收获和裂解后回收并用亲和层析进行纯化。最经常地，该过程包括使澄清的细胞裂解物通过具有展现与融合蛋白结合的配体的适当亲和介质的柱。污染物在融合蛋白特异洗脱或原位结合融合蛋白切割之前从介质中洗去。例如，用实施例2和3所述的Impact载体，含有溶菌酶的融合蛋白将通过阳离子交换层析进行纯化。在这种情况下，原位的切割可能不是选择，除非可以发现切割条件并不提高融合蛋白的洗脱。在这些情况下，在溶液相中切割是需要的。对与介质结合的融合蛋白的切割可简化肽的随后纯化。
切割融合蛋白可通过直接加入硫醇酰基-受体如10mM DTT完成以获得硫代-酯中间产物，该中间物接下来通过用pH高于6.0的氨盐处理转变为酰胺。通过添加适当的受体硫醇和氨盐的混合物，切割和转变为酰胺的同时进行也是可能的。
然后对释放的肽进一步纯化，如果需要，可使用传统的技术如溶剂分配和高效液相层析。
权利要求
1.用于生产肽的方法，包括以下步骤表达作为融合蛋白一部分的肽，然后通过酰基受体如含硫还原剂从融合蛋白上释放肽。
2.如权利要求1所述的方法，其中至少部分融合蛋白是能催化肽作为酰基部分转移给适当受体如近端硫原子以形成硫代-酯的分子
3.如权利要求1或权利要求2所述的方法，其中肽从融合蛋白释放出来后在其羧基末端酰胺化。
4.如权利要求3所述的方法，其中酰胺化步骤在适当pH、一定来源的铵离子参与下进行。
5.如权利要求3或权利要求4所述的方法，其中酰胺化步骤与肽的释放同时发生。
6.如权利要求1至5中任一项所述的方法，其中肽是鲑降钙素、人降钙素、促黄体生成素释放激素、催产素、胃泌素神经肽Y、血管升压集、促肾上腺皮质素释放激素、生长激素释放激素、人降钙素基因相关肽、胃泌素、D-tyr-trp-gly、phe-gly-phe-gly、gly-phe-gly、黑素细胞刺激激素前体、Sectetin、促甲状腺素释放激素、糊精、P物质、胰多肽、缩胆囊素、胃泌素分泌因子、phe-his-ile、phe-tyr-tyr、蛙皮降压肽、肥大细胞脱粒肽M、雨蛙肽或FMRF酰胺。
7.如权利要求6所述的方法，其中肽是鲑降钙素或人降钙素。
8.如权利要求2至7中任一项所述的方法，其中融合蛋白包含至少部分修饰的intein序列。
9.如权利要求8所述的方法，其中intein序列或其部分的修饰导致自剪切功能的丧失。
10.如权利要求8或权利要求9所述的方法，其中intein序列或其部分来自酵母的VMA1基因。
11.如权利要求1或权利要求2所述的方法，其中肽通过水解从融合蛋白中释放出来。
12.如权利要求11所述的方法，其中肽是Hirulog、爪蟾抗菌肽、胸腺素α-1、脑肽、心房肽或杀菌/通透性-增加蛋白。
13.如权利要求1至12中任一项所述的方法，其中融合蛋白包含可用于通过亲和或其它层析方法进行融合蛋白鉴定和/或纯化的标记。
14.如权利要求13的方法，其中标记是亲和标记。
15.如权利要求14所述的方法，其中亲和标记包含特异几丁质结合区或其部分、酸性或碱性氨基酸的重复、多聚组氨酸序列、谷胱甘肽合成酶和溶菌酶。
16.如权利要求1至15中任一项所述的方法，其中融合蛋白在细菌、酵母、包括所有植物的植物组织、昆虫细胞、哺乳动物细胞或在转基因哺乳动物的体液中表达。
17.如权利要求15所述的方法，其中融合蛋白在大肠杆菌或枯草杆菌中表达。
18.如权利要求17所述的方法，其中融合蛋白在大肠杆菌中表达并且如果肽在其序列中不包含甲硫氨酸就用溴化氰处理肽。
19.如权利要求15所述的方法，其中融合蛋白在酿酒酵母或P.pastoralis中表达。
20.如权利要求15所述的方法，其中融合蛋白在中国仓鼠卵巢细胞或幼仓鼠肾细胞中表达。
21.如权利要求15所述的方法，其中融合蛋白在转基因马铃薯组织或转基因玉米组织中表达。
22.如权利要求15所述的方法，其中融合蛋白在转基因猪、母牛、绵羊、山羊或兔的乳中表达。
23.如权利要求15所述的方法，其中融合蛋白在昆虫细胞如草地夜蛾细胞中表达。
24.如权利要求1至23中任一项所述的方法，其中编码融合蛋白的序列也包括分泌前导序列。
25.如权利要求24所述的方法，其中分泌前导序列在分泌过程中由天然加工酶去除。
26.编码如权利要求1、2、6-15、24或25中任一项所定义的融合蛋白的DNA构建体。
27.如权利要求26所述的DNA构建体，是载体形式。
28.用如权利要求26或权利要求27所定义的DNA构建体转化或转染的宿主细胞。
29.如权利要求28所述的宿主细胞，通过权利要求16至21的任意一个或多个特点修饰。
30.转基因的非人类哺乳动物，在其基因组中已掺入如权利要求26所定义的DNA构建体。
31.如权利要求29所述的转基因哺乳动物，是转基因猪、母牛、绵羊、山羊或兔。
全文摘要
本发明提供通过重组方法、特别地但并不仅仅进行羧基末端修饰如酰胺化作用生产肽的方法。
文档编号H04L12/28GK1254379SQ98804740
公开日2000年5月24日 申请日期1998年5月1日 优先权日1997年5月1日
发明者I·R·克丁汉姆 申请人:Ppl治疗(苏格兰)有限公司