一种天门冬酰胺酶环糊精脂质体及其制备方法
【技术领域】
[0001]本发明属于医药制剂领域，涉及天门冬酰胺酶环糊精脂质体及其制备方法。
【背景技术】
[0002]淋巴系统恶性肿瘤是最常见的儿童恶性肿瘤，天门冬酰胺酶作为治疗淋巴系统肿瘤的有效抗癌药，自其临床应用以来，儿童淋巴系统恶性肿瘤的无病生存率及缓解率都有了很大程度的提高。但是天门冬酰胺酶稳定性差、易被酶降解、半衰期短等缺点，限制了该药在临床上的广泛应用。环糊精具有略呈锥形的中空圆筒立体环状结构，外缘亲水而内腔疏水，它能够提供一个疏水的结合部位，作为主体包络各种适当的客体，是一种很好的药物载体材料，既可以增强药物的稳定性，又可以改善药物吸收，延长药物作用时间。脂质体是指将药物包封在类脂质双分子层内而形成的微型囊泡，它具有增强药物稳定性、延长药物作用时间及提高药物生物利用度等优点。环糊精脂质体是近年来才发展的新型脂质体，能给予药物双重保护作用，从而提高药物稳定性，减少药物泄漏，除此以外环糊精脂质体还可以改善药物的体内行为，提高药物生物利用度。
[0003]经查询专利及文献，目前尚无环糊精脂质体载带酶类和基因类药物的任何研宄报道，当然，目前也尚无天门冬酰胺酶环糊精脂质体的任何研宄报道。本发明制备得到的天门冬酰胺酶环糊精脂质体可以增强天门冬酰胺酶的稳定性，提高天门冬酰胺酶抗蛋白酶水解的能力，达到长期作用的效果，并且可以提高生物利用度。
【发明内容】
[0004]本发明所要解决的技术问题是提供天门冬酰胺酶环糊精脂质体及其制备方法。天门冬酰胺酶环糊精脂质体克服了天门冬酰胺酶稳定性差、易被酶降解、生物利用度低等缺点，可保持较长时间的血药浓度，具有缓释作用，可以减少给药次数，提高患者的顺应性，降低毒副作用。本发明提供的天门冬酰胺酶环糊精脂质体制备工艺简单，成本较低，易于控制，易于工业化生产。本研宄为天门冬酰胺酶提供了可供选择的新型载体，具有明显的实用意义，社会和经济价值。
[0005]本发明提供的天门冬酰胺酶环糊精脂质体，其特征在:制剂中天门冬酰胺酶的含量为10-500U/mL，Tris缓冲液的pH为6.5-8.5、离子强度为25_150mM，制剂中其余组分重量百分比为:环糊精1-4份，磷脂2-10份，胆固醇1-6份。所述环糊精为羟丙基-β -环糊精、磺丁基-β -环糊、α -环糊精、γ -环糊精、δ -环糊精中的一种或多种。本发明提供的天门冬酰胺酶环糊精脂质体，制备步骤如下:(I)将处方量的环糊精溶于Tris缓冲液中，得环糊精溶液，将处方量的天门冬酰胺酶溶于Tris缓冲液中，得天门冬酰胺酶溶液，将环糊精溶液和天门冬酰胺酶溶液混合后超声振荡，搅拌1-3小时，过滤，即得天门冬酰胺酶环糊精溶液；(2)称取处方量的胆固醇、磷脂溶于二氯甲烷，待其充分溶解，旋转蒸发至形成均匀透明薄膜，取乙醚将薄膜溶解，然后加入天门冬酰胺酶环糊精溶液，再超声直至形成带乳光的均匀分散体系，旋转蒸发至形成白色均匀混悬液，即得。
[0006]本发明提供的天门冬酰胺酶环糊精脂质体平均粒径小于400nm(图1)。本发明提供的天门冬酰胺酶环糊精脂质体能增加天门冬酰胺酶的稳定性，提高天门冬酰胺酶抗蛋白酶水解的能力。4°C放置稳定性实验中，游离的天门冬酰胺酶约在19天时，活性降至50%，而天门冬酰胺酶环糊精脂质体约在28天时，活性才降至50% (图2)。天门冬酰胺酶环糊精脂质体增加酶稳定性的原因可能有:(I)环糊精对酶有包合作用，能增强其稳定性；(2)脂质体独特的类细胞膜双分子层结构对酶起保护作用，使天门冬酰胺酶更好地维持自身活性，稳定性得到提高。抗胰蛋白酶水解实验中，游离的天门冬酰胺酶在50分钟时，活性消失，而天门冬酰胺酶环糊精脂质体在360分钟时，活性才消失(图3)。可能是因为环糊精脂质体的双重保护，使天门冬酰胺酶免受蛋白酶的破坏。本发明提供的天门冬酰胺酶环糊精脂质体体内给药后，活性-时间曲线图下面积相对于游离酶有明显提高(图4)，为游离酶的
3.91倍，活性最大值为游离酶的1.21倍，体内平均滞留时间为游离药的2.58倍。结果表明，将天门冬酰胺酶制备成天门冬酰胺酶环糊精脂质体后，能显著提高天门冬酰胺酶的生物利用度，同等剂量下能使药物在更长时间内保持较高活性，延长药物在体内的作用时间。本发明的制剂生物利用度明显提高的原因可能包括:(I)天门冬酰胺酶环糊精脂质体的双重保护作用，使其免受蛋白酶水解和吞噬细胞清除；(2)天门冬酰胺酶环糊精脂质体能增强酶的稳定性，使其在长时间内保持较高活性；(3)天门冬酰胺酶环糊精脂质体能改善酶的体内行为，提高生物利用度。
[0007]本发明不同于通常研宄报道的天门冬酰胺酶的递送载体和制备工艺。天门冬酰胺酶的递送载体研宄报道的有:前脂质体、非脂质体制剂:壳聚糖纳米囊及甘露糖-壳聚糖纳米囊等。本发明中的环糊精脂质体是一种新型脂质体，目前有少量小分子类药物环糊精脂质体的报道，如:葛根素(主要用于心血管疾病)环糊精包合物脂质体、桂利嗪(主要用于脑血管障碍)环糊精包合物脂质体、谷胱甘肽(主要用于皮肤病)环糊精脂质体等，目前对环糊精脂质体的研宄还停留在小分子药物(分子量为IkDa以下)的载带上，尚无环糊精脂质体载带大分子药物的研宄。本发明首次将天门冬酰胺酶(分子量为130kDa左右)包络在环糊精中，再包裹于脂质体双分子层结构中，制备得到天门冬酰胺酶环糊精脂质体，双重保护作用起到了良好的稳定效果，并能增加天门冬酰胺酶在体内的循环时间，延长半衰期，提高生物利用度。
【附图说明】
[0008]图1为本发明制得的天门冬酰胺酶环糊精脂质体的粒径。
[0009]试验条件:采用马尔文激光粒度仪测定天门冬酰胺酶环糊精脂质体的粒径。
[0010]图2为本发明制得的天门冬酰胺酶环糊精脂质体的4°C放置稳定性。
[0011]试验条件:将游离天门冬酰胺酶、天门冬酰胺酶环糊精脂质体样品溶液放置于4°C的冰箱中，分别于第0，1，2，5，10，15，20，25，28天时测定样品溶液中天门冬酰胺酶的活性。
[0012]图3为本发明制得的天门冬酰胺酶环糊精脂质体的抗胰蛋白酶水解的能力。
[0013]试验条件:取游离天门冬酰胺酶、天门冬酰胺酶环糊精脂质体与等体积的胰蛋白酶溶液混匀，于37 °C水浴中保存，分别于O，10，20，30，40，50，60，120，240，360分钟测定混合溶液中天门冬酰胺酶的活性。
[0014]图4为本发明制得天门冬酰胺酶环糊精脂质体活性-时间曲线图。
[0015]试验条件:12只SD大鼠(在给药前禁食12小时，但不禁水)，随机分为2组，每组6只，分别尾静脉注射天门冬酰胺酶、本发明提供的天门冬酰胺酶环糊精脂质体，给药剂量为每只大鼠2000U/kg(以天门冬酰胺酶计)。给药后定时采血，进