β-内酰胺酶抑制肽的聚乙二醇化衍生物及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物医药领域，具体涉及β-内酰胺酶抑制肽的聚乙二醇化衍生物，还 涉及β-内酰胺酶抑制肽的聚乙二醇化衍生物的应用。
【背景技术】
[0002] 细菌对β-内酰胺类抗菌药物耐药的机制有多种，其中β-内酰胺酶的产生是最重要 和最常见的机制，其通过与内酰胺环上的羰基共价结合，水解酰胺键使内酰胺类抗菌 药物失活。近年来，随着超广谱内酰胺类抗菌药物的大量应用，内酰胺酶的种类、底物 谱及耐药程度以惊人的速度发展，已经使细菌对氨曲南、绝大多数第三代头孢菌素甚至第 四代头孢菌素耐药。解决上述问题的主要方法之一是开发内酰胺酶抑制剂。目前临床广 泛应用的内酰胺酶抑制剂有克拉维酸、舒巴坦和三唑巴坦等，它们通过抑制内酰胺酶 的活性而达到保护内酰胺类抗菌药物的目的。但随着这些内酰胺酶抑制剂的广泛应 用，对这些β-内酰胺酶抑制剂耐药的产酶菌也逐渐增加。因此，开发新型、高效的其它β-内 酰胺酶抑制剂很有必要。
[0003] β-内酰胺酶抑制蛋白（β-lactamase inhibitory protein，BLIP)是 1990年从土壤 棒状链霉菌培养液中分离得到的主要蛋白质。文献报道，BLIP的2个折叠区域能够插入β-内 酰胺酶的活性位点中，阻止内酰胺酶与内酰胺类抗菌药物的接合。虽然BLIP由165个氨 基酸组成，分子量较大，抗原性较强，不适合开发成为临床使用的药物，但其为β-内酰胺酶 抑制肽的研究和开发提供了新的途径。公开号为CN1778916A的中国专利申请公开了一种能 够抑制内酰胺酶的多肽。该多肽由24个氨基酸组成，推测分子量为2600道尔顿，虽然与 BLIP相比在分子量、抗原性方面具有一定优势，但仍然存在分子量较大及潜在的抗原性等 问题；同时该多肽采用大肠杆菌表达制备，工艺复杂，周期长，耗资大，不适合大规模生产。 李勇湧等(β_内酰胺酶抑制肽的活性研究.中国抗生素杂志，2010,35(4):300-304)通过计 算机分子三维模拟设计并合成了 6个β-内酰胺酶抑制肽(各抑制肽的氨基酸序列未公开）， 但在鉴定活性的过程中发现，抑制肽②和⑤无法溶解，抑制肽④在保存过程中大部分已降 解，剩下的3个抑制肽虽然具有β-内酰胺酶抑制活性，但活性均较弱。陈勇川等在申请号为 CN102212110A公开了β-内酰胺酶抑制肽具有较强的β-内酰胺酶抑制活性，且分子量小，不 易产生抗原性，但其在体内易被水解酶水解，半衰期短，为维持一定的疗效需要大剂量反复 用药。因此，对β-内酰胺酶抑制肽进行化学修饰，增加其稳定性，改变其在人体内的生物学 分布，延长其半衰期是十分必要的。
【发明内容】
[0004] 有鉴于此，本发明的目的之一在于提供β-内酰胺酶抑制肽的聚乙二醇化衍生物； 本发明的目的之二在于提供内酰胺酶抑制肽的聚乙二醇化衍生物在制备内酰胺酶抑 制剂中的应用;本发明的目的之三在于提供内酰胺酶抑制肽的聚乙二醇化衍生物与内 酰胺类抗菌药物联合在制备抗菌药物中的应用。
[0005] 为实现上述发明目的，经大量实验，本发明提供如下技术方案：
[0006] β-内酰胺酶抑制肽的聚乙二醇化衍生物，所述β-内酰胺酶抑制肽的聚乙二醇化衍 生物为β-内酰胺酶抑制肽的氨基端修饰Nh 2-(Ch2CH2O)8-CH2CH 2COOH的化合物，所述β-内酰 胺酶抑制肽的氨基酸序列如SEQ ID NO. 1所示。
[0007] 优选的，所述β-内酰胺酶抑制肽的聚乙二醇化衍生物的结构式如下：
[0009] 2、所述β_内酰胺酶抑制肽的聚乙二醇化衍生物在制备β_内酰胺酶抑制剂中的应 用。
[0010] 3、所述β-内酰胺酶抑制肽的聚乙二醇化衍生物与β-内酰胺类抗菌药物联合用于 制备抗菌药物中的应用。
[0011] 本发明的有益效果在于:本发明提供了一种β-内酰胺酶抑制肽的聚乙二醇化衍生 物，可通过固相多肽合成法制备，简便易行、生产成本低，适合工业化大规模生产;不易被水 解酶水解，体内半衰期长;可用于制备β-内酰胺酶抑制剂，与β-内酰胺类抗菌药物联用以提 高β-内酰胺类抗菌药物的抗菌疗效，在细菌感染治疗领域具有良好的开发应用前景。
【附图说明】
[0012] 为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图：
[0013] 图1为β-内酰胺酶抑制肽的聚乙二醇化衍生物高效液相图。
[0014] 图2为β-内酰胺酶抑制肽的聚乙二醇化衍生物质谱图。
[0015] 图3为β-内酰胺酶抑制肽的聚乙二醇化衍生物对β-内酰胺酶的抑制活性测定结 果。
[0016] 图4为β-内酰胺酶抑制肽的聚乙二醇化衍生物和β-内酰胺酶抑制肽的药时曲线 图。
【具体实施方式】
[0017] 下面将结合附图，对本发明的优选实施例进行详细的描述。实施例中未注明具体 条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。
[0018] 实施例1、固相多肽合成法制备β-内酰胺酶抑制肽的聚乙二醇化衍生物
[0019 ]固相多肽合成法制备β_内酰胺酶抑制肽的聚乙二醇化衍生物，具体步骤如下：
[0020] (1)树脂溶涨:将王树脂(wang resin)放入反应管中，加 N，N-二甲基甲酰胺(DMF)， 振荡30min;
[0021] (2)接第一个氨基酸:通过沙芯抽滤掉溶剂，加入相当于合成多肽3倍摩尔的Fmoc-〇-叔丁基-L-酪氨酸(Fmoc-L-Tyr(Tbu)-OH)，再加入相当于合成多肽10倍摩尔的4-二甲氨 基吡啶(DMAP)和二环己基碳二亚胺(DCC)，最后加入DMF溶解，振荡30min，用醋酸酐封闭； [0022] (3)脱保护:去掉DMF，加体积分数为20 %的哌啶DMF溶液，5min后去掉，再加体积分 数为20%的哌啶DMF溶液，15min;
[0023] (4)检测：抽掉哌啶溶液，取十几粒树脂，用乙醇洗三次，加入茚三酮，氰化钾，苯酚 溶液各一滴，105-110°C加热5min，变深蓝色为阳性反应；
[0024] (5)清洗:用DMF、甲醇、DMF各洗两次；
[0025] (6)缩合:将相当于合成多肽3倍摩尔的保护氨基酸，相当于合成多肽3倍摩尔的0-苯并三氮唑-四甲基脲六氟磷酸盐(HBTU)，用DMF溶解，加入反应管，立刻加入相当于合成多 肽10倍摩尔的4-甲基吗啉(NMM)反应30min;
[0026] (7)清洗:依次采用DMF (I Oml /g)洗一次，甲醇（I Oml /g)洗两次，DMF (I Oml /g)洗两 次；
[0027] (8)重复2至6步操作，按照序列C端到N端残基顺序依次合成序列如下氨基酸:Thr Thr Trp Ser Glu Tyr Tyr Pro Ala Tyr；
[0028] (9)直线肽完成后质谱检测直线肽为主峰对，加入相当于合成多肽2倍摩尔的NH2-(CH2CH 20)8-CH2CH2C00H，相当于合成多肽3倍摩尔的HBTU，利用DMF溶解，立刻加入相当于合 成多肽10倍摩尔的NMM反应30min;按步骤(4)的方法进行检测，显色为无色，去除Fmoc保护 基；
[0029] (10)抽干，按照下列方法洗树脂：依次采用DMF(IOmVg)洗两次，甲醇（IOmVg)洗 两次，DMF( 10ml/g)洗两次，DCM( 10ml/g)洗两次，抽干 IOmin;
[0030] (11)从树脂上切割多肽:配制切割液（IOmVg)三氟乙酸95%(V/V);水2%(V/V); 1，2-乙二硫醇2%(￥八〇;三异丙基硅烷1%(￥八〇;在切割液作用下切割12〇1^11。
[0031] (12)吹干洗涤:将裂解液用氮气尽量吹干，用乙醚洗六次，然后常温(25°C)挥干； [0032] (13)将干粉状多肽粗品，采用高效液相色谱法进行纯化(SMMADZU高效液相色谱 仪，Kromasil 20 X 250mm C18120A色谱柱，流动相由体积分数为0.1 %的三氟乙酸和乙腈按 照体积比为50:50混合而成），即得β-内酰胺酶抑制肽的聚乙二醇化衍生物纯品，结构如式I 所示。
[0034]式 1
[0035]经高效液相色谱法鉴定，结果如图1所示，结果显示获得的β_内酰胺酶抑制肽的聚 乙二醇化衍生物纯品纯度大于98%;经质谱法鉴定，结果如图2所示，结果表明β-内酰胺酶 抑制肽的聚乙二醇化衍生物纯品分子量与理论分子量一致。
[0036]实施例2、β_内酰胺酶粗提液的制备及活性鉴定
[0037]挑取临床分离并经Nitrocef ?η(β-内酰胺酶特异性鉴定试剂）鉴定的产β-内酰胺 酶的肺炎克雷伯菌单菌落，接种于5ml新鲜肉汤中，37°C孵育24小时，再吸取该培养液2ml加 入200ml新鲜肉汤中，37°C振荡孵育24小时，4°C、5000Xg离心30分钟，收集菌体，用0.05M、 PH7.0的磷酸盐缓冲液洗涤菌体2次，再用该缓冲液5ml重悬菌体，冰水浴条件下超声破碎菌 体，4°C、20000 X g离心1小时，收集上清液，即得β-内酰胺酶粗提液，经蛋白定量后置-70°C 冰箱中保存。
[0038]向终浓度为HT4M的头孢噻啶溶液3ml中加入β-内酰胺酶粗提液30μ1，37°C混匀，立 即用紫外分光光度