一种多肽的制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及多肽领域，特别涉及一种多肽的制备方法。
【背景技术】
[0002] Velcalcetide，也称AMG 416,氨基酸序列如SEQ ID No. 1所示，结构如式I所示。
[0004] Velcalcetide用于接受透析的慢性肾病患者的继发性甲状旁腺功能允进。这个药 物目前正在进行III期研究，预期2014年下半年将公布研究数据。
[0005] 安进公司目前已经有一个同一适应症药物在市场上销售，名为Sensipar。去年，这 个药物的销售额同比增长14. 6%，达到10. 9亿美元。
[0006] Velcalcetide可以在进行血液透析的同时通过静脉给药，这对于每天都需要使用 大量药物的慢性肾病患者来说是一个福音。因此，velcalcetide很有可能会超过它的前任 Sensipar。分析师预期velcalcetide的年销售峰值出现在2023年，为10亿美元。
[0007] 目前未见合成方法的报道，更未见大规模合成的方法。因此，提供Velcalcetide 的制备方法具有现实意义。
【发明内容】
[0008] 有鉴于此，本发明提供一种多肽的制备方法。该方法为纯固相工艺，操作简便，假 稀释效应避免了液相反应中存在的多肽链间二硫键错配的反应（不会产生肽链间反应）。 提高了多肽Velcalcetide的收率和纯度，减少了副反应的发生。
[0009] 为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
[0010] 本发明提供了一种多肽的制备方法，包括如下步骤：
[0011] 步骤1 :取Arg与树脂偶联，制得Arg-树脂；
[0012] 步骤2 :取所述Arg-树脂，逐个偶联Ala、Arg、Arg、Arg、Ala、Cys(X)后，将氮端氨 基乙酰化，得到第一肽树脂；
[0013] 步骤3 :脱除所述第一肽树脂中Cys (X)的侧链保护基X，再与Y-Cys偶联，获得第 二肽树脂，裂解，即得。
[0014] 具体的，本发明提供的多肽的制备方法中，步骤2具体为取所述Arg-树脂（具体 为 D-Arg(pbf)-Resin)，逐个偶联 D_Ala、D-Arg(pbf)、D-Arg(pbf)、D-Arg(pbf)、D_Ala、 D-Cys (X)，将氮端氨基乙醜化后，得到第一肤树脂为Ac-D-Cys (X) -D-Ala-D-Arg (pbf) -D-Ar g(pbf)-D-Arg(pbf)-D-Ala-D-Arg(pbf)-Resi n〇
[0015] 具体的，本发明提供的多肽的制备方法中，第二肽树脂为
[0017] 在本发明的一些实施例中，Cys的侧链保护基所述X为mmt或mtt。适于做侧链 保护基的均在本发明的保护范围之内，本发明在此不做限定。作为优选，Cys含有特殊的侧 链保护基Npys，一方面防止合成原料之间的二硫键合成，另一方面Npys属于良好的离去基 团，能有效提高原料与链间Cys的偶联。
[0018] 在本发明的一些实施例中，步骤3中所述脱除选用体积浓度为1 %~5% TFA的 DCM 溶液，即 1 % ~5 % TFA/DCM。
[0019] 在本发明的一些实施例中，所述Y为Fmoc、Boc或H。适于做保护基的均在本发明 的保护范围之内，本发明在此不做限定。
[0020] 在本发明的一些实施例中，当所述Y为Fmoc时，步骤3中所述获得第二肽树脂与 所述裂解之间还包括脱除Y的步骤。当所述Y为Boc或H时，不需要先脱除。
[0021] 在本发明的一些实施例中，所述脱除Y选用的脱除剂为体积浓度为20%哌啶的 DMF溶液，即20 %哌啶/DMF。
[0022] 作为优选，步骤3中的偶联反应条件是空气氧化。
[0023] 在本发明的一些实施例中，步骤3中所述裂解采用的裂解液包括TFA、PhSMe、EDT、 TIS和H2O的混合物。作为优选，TFA、PhSMe、EDT、TIS和H2O的体积比为83:5:5:5:2。
[0024] 在本发明的一些实施例中，步骤1中所述树脂为氨基树脂，所述氨基树脂选自 Rink Amide ResiruRink Amide-MBHA Resin 或 Rink Amide-AM Resin。
[0025] 在本发明的一些实施例中，步骤3所述裂解后还包括纯化的步骤。
[0026] 作为优选，Fmoc-D-Arg-Resin 的替代度为 0· 2 ~0· 5mmol/g。
[0027] 作为优选，树脂与Fmoc-D-Arg(pbf)的摩尔比为1. 6:1-4:1。
[0028] 作为优选，偶联剂为HOBt/DIC。
[0029] 作为优选，反应后经封闭液封闭8h，封闭液中吡啶与乙酸酐的摩尔比为1:1。
[0030] 在本发明的一些实施例中，Fmoc-D-Arg-树脂与Fmoc-D-Ala-OH的摩尔比至少为 1:3,优选的，Fmoc-D-Arg-树脂与Fmoc-D-Ala-OH的摩尔比为1: 3。
[0031] 在本发明的一些实施例中，以g/mL计，树脂与裂解液的质量体积比为1:10。作为 优选，裂解剂中TFA/PhSMe/EDT/TIS/H 20的体积比为83:5:5:5:2。
[0032] 在本发明的一些实施例中，粗肽精制成时，加入的酸为硫酸胺、三氟乙酸或醋酸。 作为优选，硫酸胺的浓度为0.05%，pH值为2. 5。作为优选，三氟乙酸的浓度为0.1%。作 为优选，醋酸的浓度为〇. 1%。
[0033] 本发明提供一种多肽的制备方法。该方法为纯固相结合进行大规模制备的 Velcalcetide路线，利用固相的假稀释效应避免了液相反应中存在的多肽链间二硫键错 配的反应。具体为采用了特殊的合成原料Boc-Cys(Npys)-OH或Fmoc-Cys(Npys)-OH或 H-Cys (Npys) -OH，含有特殊的侧链保护基Npys，一方面防止合成原料之间的二硫键合成， 另一方面Npys属于良好的离去基团，能有效提高原料与链间Cys的偶联。提高了多肽 Velcalcetide的收率和纯度，减少了副反应的发生。
【附图说明】
[0034] 图1示实施例13制备的精肽的RT-HPLC色谱图；
[0035] 图2示实施例13制备的精肽的质谱图；
[0036] 图3示多肽Velcalcetide标准品的质谱图。
【具体实施方式】
[0037] 本发明公开了 一种多肽的制备方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改 进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显 而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了 描述，相关人员明显能在不脱离本
【发明内容】
、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行 改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
[0038] 本发明提供的多肽的制备方法中所用氨基酸及试剂均可由市场购得。
[0039] 缩写及英文含义
[0040] 缩写及英文 含义
[0041] Fmoc 9_荷甲氧撰基
[0042] DIPCDI 二异丙基碳二亚胺
[0043] HOBt 1-羟基苯并三唑
[0044] DMF N, N-二甲基甲酰胺
[0045] DCM 二氯甲烷
[0046] TFA 三氟乙酸
[0047] PhSMe 苯甲硫醚
[0048] TIS 三异丙基硅烷
[0049] EDT 乙二硫醇
[0050] Boc-Cys (Npys) -OH Boc-S-(3_ 硝基 _2_ 批陡基硫）_L_ 半脈氛酸
[0051] Fmoc-Cys (Npys) -OH Fmoc-S-(3_ 硝基 _2_ 批陡基硫）_L_ 半胱氨酸
[0052] 下面结合实施例，进一步阐述本发明：
[0053] 实施例1 :替代度为0. 5mmol/g的Fmoc-D-Arg(pbf)-氨基树脂的合成
[0054] 称取替代度为1.0 mmol/g的Rink Amide resin 400g，加入到固相反应柱中， 用DMF洗涤2次，用DMF溶胀树脂30分钟。用DBLK (20 %哌啶/DMF)脱除Fmoc保护， 然后用 DMF 洗涤 4 次，DCM 洗 2 次。称取 162. 2g Fmoc-D-Arg (pbf)-OH(250mmol)和 40. 5g HOBt (300mmol)溶于体积比为1:1的DCM和DMF混合溶液，冰水浴下加入46. 9ml DIC(300mmol)活化3min后加入固相反应柱中，室温反应2小时。用DMF洗涤3次，加入 1395. Iml封闭液（吡啶/乙酸酐=I: l，8mol :8mol)封闭8小时（树脂若未完全扩散加 DCM作为溶剂）。用DMF洗涤4次，DCM洗4次，甲醇收缩抽干，得到Fmoc-D-Arg (pbf) -Rink Amide树脂。用常规固相替代度检测方法检测替代度为0. 502mmol/g。
[0055] 以替代度为1.0 mmol/g的Rink Amide-MBHA resin