一种mhc-i类限制性抗肿瘤ctl表位肽的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及肿瘤免疫治疗技术领域中的一种MHC-I类限制性抗肿瘤CTL表位肽。
【背景技术】
[0002] 近年来，随着对免疫应答分子机制研究的深入，现已逐渐认识到机体的免疫细胞 并不是对应于各种各样的病原体或天然抗原的整体分子，而是针对各种各样抗原分子的抗 原表位，即蛋白质抗原是通过其表位来体现其免疫特异性。目前的研究表明，CD8+T细胞所 识别的靶抗原需先经抗原提呈细胞处理，之后以"抗原肽-MHC-I类分子"复合物的形式呈现 在抗原提呈细胞或靶细胞表面，相应的与MHC-I类分子结合的抗原肽即为CTL表位。表位肽 能够激活诱导产生特异性CTL细胞，可对人类白细胞抗原(HLA)配型匹配的肿瘤有一定的杀 伤效果。因此，研究开发一种MHC-I类限制性抗肿瘤CTL表位肽是目前急待解决的新课题。
【发明内容】
[0003] 本发明的目的在于提供一种MHC-I类限制性抗肿瘤CTL表位肽，该发明是对与人主 要组织相容性复合物(MHC)I类分子结合的多肽分子进行预测、筛选和鉴定，提供能与人 MHC-I类分子的结合位点进行结合、可激活特异性的细胞毒性T淋巴细胞(CTL细胞）的表位 肽，从而有效杀伤肿瘤细胞，达到治疗肿瘤的目的，以及所述表位肽在制备用于临床治疗和 检测肿瘤性疾病疫苗中的用途。
[0004] 本发明的目的是这样实现的：一种MHC-I类限制性抗肿瘤CTL表位肽，能与人MHC-I 类分子的结合位点进行结合，可激活特异性的细胞毒性T淋巴细胞的表位肽，2条表位肽具 有下列氨基酸序列为：
[0005] El,Tyr He Met Phe Val Asp Pro Ser Leu；
[0006] E2,Tyr Leu Val Ala Leu Ser Tyr Thr Leu；
[0007] 所述的与人MHC-I类分子结合的表位肽，为具有该氨基酸序列的游离型多肽、融合 型多肽和嵌合型多肽；以及以上所述2种多肽之一为单体的各种形式的聚合体；
[0008] 所述的MHC-I类限制性靶向抗肿瘤CTL表位肽可通过人工合成，或通过原核细胞或 真核细胞表达纯化获得；
[0009] 所述的MHC-I类限制性抗肿瘤CTL表位肽根据表位肽与MHC-I类分子相互作用的机 理，预测获得表位肽，并根据其能有效与MHC-I类分子结合并能激活特异性T淋巴细胞的特 性鉴定为有效的表位肽，该表位肽长度仅9个氨基酸序列，体外容易合成，方便临床应用；
[0010] 所述的MHC-I类限制性抗肿瘤CTL表位肽所涉及的表位肽与功能或性质已知的蛋 白质融合或嵌合，即这些蛋白质分子或嵌合分子包含了本发明涉及的多肽氨基酸序列，具 有这些多肽的相同或相似活性。
[0011] 本发明的要点在于提供能与人MHC-I类分子的结合位点进行结合、可激活特异性 的细胞毒性T淋巴细胞(CTL细胞）的表位肽。其基本原理是：首先生物信息学原理验证表位 肽与MHC-I类分子的理论结合能力，并通过计算机模拟联合T2亲和力实验进一步验证表位 肽与MHC-I类分子的结合力;然后通过Fmoc原理合成、HPLC纯化表位肽，并通过HPLC-MS分析 其纯度和分子量;最终利用DC负载表位肽诱导CTL细胞，并通过与不同MHC-I分子表型的肿 瘤靶细胞混合培养，观察CTL细胞免疫杀伤靶细胞的MHC-I分子的限制性。一种MHC-I类限制 性抗肿瘤CTL表位肽与现有技术相比，具有使用计算机模拟技术与实验相结合的方法，进一 步提高表位肽筛选的准确性，多肽物质仅为9肽的短肽，体外容易合成，能够诱导产生显著 抗肿瘤免疫反应，具有非常大的商业产业化价值等优点，将广泛的应用于肿瘤免疫治疗技 术领域中。
【附图说明】
[0012]下面结合附图及实施例对本发明进行详细说明。
[0013]图1为El表位肽的空间结构模拟图。
[0014]图2为El表位肽和MHC-I分子结合的空间结构模拟图一。
[0015]图3为El表位肽和MHC-I分子结合的空间结构模拟图二。
[0016]图4为E2表位肽的空间结构模拟图。
[0017]图5为E2表位肽和MHC-I分子结合的空间结构模拟图一。
[0018]图6为E2表位肽和MHC-I分子结合的空间结构模拟图二。
[0019]图7为El表位肽的质谱分析图。
[0020]图8为El表位肽的高效液相色谱法分析图。
[0021]图9为E2表位肽的质谱分析图。
[0022]图10为E2表位肽的高效液相色谱法分析图。
【具体实施方式】
[0023] -种MHC-I类限制性抗肿瘤CTL表位肽，能与人MHC-I类分子的结合位点进行结合， 可激活特异性的细胞毒性T淋巴细胞的表位肽，2条表位肽具有下列氨基酸序列为：
[0024] El,Tyr He Met Phe Val Asp Pro Ser Leu；
[0025] E2,Tyr Leu Val Ala Leu Ser Tyr Thr Leu〇
[0026] 所述的与人MHC-I类分子结合的表位肽，为具有该氨基酸序列的游离型多肽、融合 型多肽和嵌合型多肽；以及以上所述2种多肽之一为单体的各种形式的聚合体。
[0027] 所述的MHC-I类限制性靶向抗肿瘤CTL表位肽可通过人工合成，或通过原核细胞或 真核细胞表达纯化获得。
[0028]所述的MHC-I类限制性抗肿瘤CTL表位肽根据表位肽与MHC-I类分子相互作用的机 理，预测获得表位肽，并根据其能有效与MHC-I类分子结合并能激活特异性T淋巴细胞的特 性鉴定为有效的表位肽，该表位肽长度仅9个氨基酸序列，体外容易合成，方便临床应用。
[0029] 所述的MHC-I类限制性抗肿瘤CTL表位肽所涉及的表位肽与功能或性质已知的蛋 白质融合或嵌合，即这些蛋白质分子或嵌合分子包含了本发明涉及的多肽氨基酸序列，具 有这些多肽的相同或相似活性。
[0030] 以下实施例将有助于对本发明的了解，但这些实施例仅为了对本发明加以说明， 本发明并不限于这些内容。
[0031] 实施例一
[0032]表位肽与人MHC-I类分子亲和力验证：
[0033] 1、通过超基序法与量化基序法结合的方法，验证本发明设计的多肽序列与MHC-I 类分子结合特性。
[0034] 超基序法是基于在同一人白细胞抗原(HLA)家族，甚至不同家族的HLA同种异性分 子接纳的抗原肽具有相同或相似的锚点残基构成的肽基序，超基序主要作用的锚点残基是 位于肽链2位(P2)氨基酸残基及羧基末端9位(P9)氨基酸残基。当P2、P9的残基为A、I、L、M、 V、T时，且第二位为芳香族氨基酸，第九位为疏水性氨基酸，与HLA-A2分子有较高的亲和力。 这些氨基酸的特定序列是多肽分子与MHC-I分子结合的活性位点或关键性氨基酸，决定了 与MHC-I类分子结合多肽的活性特征。
[0035] 应用http://www· syfpeithi ·de/bin/MHCServer ·dll/EpitopePrediction·htm提 供分析软件对多肽氨基酸序列进行超基序法分析。
[0036]量化基序法是基于IBS假设，即在抗原肽与HLA-A2分子的结合中，抗原肽的侧链效 应(锚定、抑制或中性)主要依赖与相应的氨基酸残基在肽中所处的位置受相邻的氨基酸残 基影响较小。这在一定的范围内可以假设在一个多肽序列中，每个氨基酸残基相互独立且 影响整个肽与MHC-I类分子的结合，而该抗原肽的结合能就是每个位置氨基酸残基结合能 的综合。基于这种假设，1993年Parker等用肽结合实验分析154个九肽与HLA-A2分子的亲和 力，并得到一个包含180个系数的结合矩阵，其中每一个系数反应了相应氨基酸残基在该位 置时的相应结合能。结合能越大，表位肽与HLA-A2分子结合越紧密。对于某测定多肽各位置 相应氨基酸残基结合系数相乘再乘标准系数〇. 151，即为该肽与HLA-A2的结合力，当结合系 数大于或等于5时，可以确定为与HLA-A2分子结合稳定，反之认定为结合不稳定。根据上述 原理，应用http: //www. bimas . com提供的分析软件对多肽氨基酸序列进行量化基序法分 析。
[0037] 超基序法预测CTL表位虽然克服了以往采用简单基序法易产生的假阴性结果，但 由于此预测法与基序法具有相同的弱点，即在预测中仅仅考虑了二、九位残基的影响而忽 略了其它位点的残基结合情况，易出现假阳性结果，故应联合量化基序法提高CTI.表位预 测的准确性(表1)。表1显示，超基序法和量化基序法均表明两条表位肽El和E2与HLA-A2分 子具有很好的结合能力;表2为20中氨基酸的缩写表。
[0038] 表1综合超基序法和量化基序法获得多肽氨基酸序列与HLA-A2结合的评分
[0040]表2氨基酸缩写表
[0041]
[0042] 2、计算机模拟表位肽与人MHC-I类分子的结合：
[0043] 对上述所得表位肽用ChemOffice软件包中的ChemDraw Ultra、ChemDraw 3D Ultra分别建立表位肽的二维和三维结构；用MOE软件对表位肽和和HLA-A2.1的能量和结构 进行修饰，模拟二者结合的三维结构，进行分子动力学结合模拟和生理活性和运用价值的 预估，主要包括以下方法：（1)表位肽分子模型构建。运用ChemOf f ice软件包中的ChemDraw Ultra构建表位肽分子二维结构，再将表位肽的二维结构导入ChemDraw 3D Ultra得到三维 模型并保存为M〇12格式，在对接模拟环节将三维结构导入MOE软件中，依次选择下拉菜单 Compute-Minimize-Molecule，出现Minimize对话框进行多肽分子的能级优化，使之能级达 到最小最适合与HLA-A2.1的复合物进行分子对接的能量和结构状态，然后将优化后的表位 肽导出为M0L2格式，以备和HLA-A2.1的结合槽凹槽进行三维对接。（2)HLA-A2.1