一对用于连接非依赖克隆的接头序列及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及基因工程领域，特别涉及一对用于连接非依赖克隆的接头序列及其应 用。
【背景技术】
[0002] 采用限制性内切酶进行酶切、DNA连接酶连接构建质粒载体的方法受到酶切位点 的序列、排列方式、方向等的限制。
[0003] 连接非依赖的克隆技术(LIC)利用DNA聚合酶的外切活性，在目的载体和插入片段 产生DNA双链5'较长的粘性末端，通过碱基互补配对形成带有切刻的环状DNA，转化大肠杆 菌后，在细菌细胞内修复成为无切刻的质粒DNA，从而完成目的片段的克隆。LIC技术可以克 服酶切连接克隆的限制，目的片段不受载体酶切位点的影响，克隆效率高，适用于高通量的 克隆。
[0004] 连接非依赖克隆的关键之一在于接头序列的设计，由于质粒载体多用于目的蛋白 的表达，因此接头序列应尽量避免引入稀有氣基酸残基、带电荷氣基酸残基等，以保证蛋白 质性质不发生显著变化。
【发明内容】
[0005] 本发明提供一对用于连接非依赖克隆的接头序列，将它连接到质粒载体的多克隆 位点位置后，可以进行外源基因片段的连接非依赖的克隆，用于连接非依赖克隆的载体的 构建。
[0006] 本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：
[0007] -种用于连接非依赖克隆的接头序列，该接头序列包括
[0008] 上游序列：gggAgCggAAgCgg，SEQIDN0:7所示的核苷酸序列；和
[0009]下游序列：gC Cag AgC CAC Cgc，SEQ ID N0:8所示的核苷酸序列。本发明的用于 连接非依赖克隆（ligation independent cloing，LIC)序列，将该接头序列连接入质粒载 体后形成的新的载体，可以实现目的片段的连接非依赖克隆。
[0010] -种所述的接头序列在连接非依赖克隆方面的应用，包括如下步骤：
[0011] a、序列的获得人工合成权利要求1所述的接头序列；
[0012] b、利用分子生物学技术将接头序列连接到质粒载体的多克隆位点位置后，形成的 新的载体，对外源片段进行连接非依赖的克隆。
[0013] 作为优选，利用分子生物学技术，合成扩增Gateway盒的引物，其中本发明的上下 游接头序列分别位于上下游引物的5'末端，通过PCR扩增Gateway盒，通过酶切连接克隆入 目的载体的多克隆位点，形成新的载体可以用于作为连接非依赖的克隆，其中该载体的多 克隆位点的上下游位置分别为本发明上下游接头序列。进行连接非依赖克隆时，本发明的 上下游接头序列应分别设计与目的基因的上下游引物5'末端，通过PCR扩增获得侧翼序列 为上下游接头的目的基因片段。通过T4DNA聚合酶处理载体和中介片段，获得5'末端突出的 载体和中间片段，其中的末端突出为接头序列。通过将5'末端突出的载体和片段混合，形成 碱基互补配对，转化如大肠杆菌后，在大肠杆菌内修复形成完整的质粒载体，完成对目的片 段的克隆。
[0014] 本发明所述的两段核苷酸序列，将它连接到质粒载体的多克隆位点位置后，可以 进行外源基因片段的连接非依赖的克隆，用于连接非依赖克隆的载体的构建。本发明的序 列能够用于适于LIC质粒载体接头。
[0015] 本发明利用分子生物学实验技术将本发明序列连到质粒载体的多克隆位点，形成 用于连接非依赖克隆的质粒载体，可以用于目的基因的连接非依赖克隆。
【具体实施方式】
[0016] 下面通过具体实施例，对本发明的技术方案作进一步的具体说明。应当理解，本发 明的实施并不局限于下面的实施例，对本发明所做的任何形式上的变通和/或改变都将落 入本发明保护范围。
[0017] 在本发明中，若非特指，所有的份、百分比均为重量单位，所采用的设备和原料等 均可从市场购得或是本领域常用的。下述实施例中的方法，如无特别说明，均为本领域的常 规方法。
[0018] 本发明所提供的实施例均按照常规实验条件，其中所采用的引物序列如表1。
[0019] 表1连接非依赖克隆载体构建引物
[0022] 实施例1:连接非依赖克隆接头序列的设计、合成、扩增和测定
[0023] 1.连接非依赖克隆接头序列的设计、合成
[0024] 分别含有接头序列SEQ ID N0:7和SEQ ID N0:8所示的核苷酸序列的引物对 Licll-FP( + )，Licll-RP(_)由核酸合成公司合成并纯化
[0025] 2 · Gateway 盒扩增
[0026] 以引物对1^(3114?( + )，1^(：11-1^(-)扩增63七6￥37盒序列，？0財广增体系为：3841^ 水、5yL 10XPCR Buffer for Pfu、4yL 2.5mM dNTPs、上下游引物（ΙΟμΜ)各0.5yL、lyL Gateway盒质粒模板、lyL Pfu聚合酶。总反应体系为50yL。各片段的反应条件为:94°C5min; 94°C45s，52°C45s，72°C4min，35个循环;72°C10min。扩增的PCR产物纯化后经测序拼接获得 含有接头序列边界的Gateway盒。
[0027] 3.连接非依赖克隆载体的构建
[0028] 步骤2中PCR产物经Qiagen凝胶纯化试剂盒(德国Qiagen公司）纯化后，利用DNA连 接酶进行PCR片段的克隆，采用10yL体系反应，条件如下：10Xligase buffer lul，Nde I和 Xhao I双酶切线性化克隆载体pET3250ng，Gateway盒回收片段5〇]^，14-1丨83861111(大连宝 生物），最后用ddH2〇调整体系至10yL，混匀后4°C反应16h。反应完毕后，取5ul反应液加入到 含有100ul大肠杆菌Db3.1感受态细胞的离心管中，轻轻混匀冰上放置30m后，42°C热激90s， 立即放置冰上2-3分钟，向离心管中加入LB液体培养基900ul。将离心管放于37°C摇床上震 动培养1.5hr后，离心收集培养液涂布于含有50mg/L卡那青霉素、10mg/L氯霉素的固体LB培 养基上，37°C过夜培养。选择菌斑送至杭州擎科公司测序。含有正确插入序列的克隆命名为 pET32a-LIC(Seq ID No.5)〇
[0029] 实施例2:外源基因的连接非依赖克隆
[0030] 1.外源基因的扩增
[0031] 以引物对 Licll-NbPinlFP( + )，Licll-NbPinlRP(_)扩增外源基因 NbPinl 序列，PCR 扩增体系为：38yL水、5yL 10XPCR Buffer for Pfu、4yL 2.5mM dNTPs、上下游引物（10μΜ) 各0.5yL、lyL Nbpinl模板、lyL Pfu聚合酶。总反应体系为50yL。各片段的反应条件为:94°C 5min; 94°C45s，52°C45s，72°C4min，35 个循环；72°C 10min。扩增的 PCR 产物纯化后经测序拼 接获得含有接头序列的Nbpinl基因片段。
[0032] 2.外源片段克隆入pET32-LIC
[0033]步骤1中PCR产物采用PEG沉淀纯化后，进行连接非依赖的克隆。
[0034] 1)PCR产物PEG沉淀纯化
[0035] 等体积加入ddH20，30 % PEG-8000/30mM MgCl2，涡旋混匀。离心（14，OOOrpm， 20min)，此时PCR产物沉淀于离心管底部；去除液体，加入lmL 75%乙醇漂洗DNA沉淀，离心 (14，OOOrpm，20min);去除液体，烘干(37°C，5min);加入1/10PCR反应体积ddH 20，溶解PCR产 物，电泳检测纯化效果。
[0036] 2)PCR产物末端处理
[0037] 反应体系于冰浴中配制，步骤1)中片段浓度100ng/yL，dATP浓度为5mM;加入4yL DNA聚合酶，温浴(37°C，20min)处理PCR产物，产生5'-末端单链;温浴（75°(3,2〇11^11)，灭活 T4DNA聚合酶。
[0038] 3)LIC载体处理：
[0039] 碱法提取质粒PET28-LIC;采用快速限制性内切酶Sac頂每切，质粒浓度5yg/100y L，并去除RNA;补水至400yL，氯仿：异戊醇（24 :1)抽提2次；乙醇沉淀，漂洗；烘干（37°C， 5min)，溶解并电泳检测酶切效果；反应体系于冰浴中配制，线性化质粒浓度5yg/100yL， dTTP浓度为5mM;加入4DNA聚合酶，温浴(37°C，20min)，处理线性化质粒，产生5 ' -末端单链； 温浴（75°C，20min)，灭活T4DNA聚合酶。
[0040] 4)连接非依赖的克隆：
[0041] 等体积混合T4DNA聚合酶处理的步骤2)中间片段和步骤3)载体；温浴（70°C， 5min)，温浴（22°C，30min)形成末端退火；反应完毕后，转化大肠杆菌DH5a。涂布于含有 50mg/L氨苄青霉素的固体LB培养基上，37°C过夜培养。选择菌斑送至杭州擎科公司测序，经 检测含有正确插入序列的克隆命名为pET32a_Nbpinl(Seq ID No.6)。
[0042] 综上，利用本发明序列，可以构建用于连接非依赖克隆的载体，从而方便的进行外 源基因的连接非依赖克隆。
[0043] 以上所述的实施例只是本发明的一种较佳的方案，并非对本发明作任何形式上的 限制，在不超出权利要求所记载的技术方案的前提下还有其它的变体及改型。
【主权项】
1. 一对用于连接非依赖克隆的接头序列，其特征在于：该接头序列包括上游序列：gg gAg Cgg AAg Cgg，SEQ ID N0:7所示的核苷酸序列；和下游序列：gC Cag AgC CAC Cgc，SEQ ID NO:8所示的核苷酸序列。2. -种权利要求1所述的接头序列在连接非依赖克隆方面的应用，其特征在于： a、 序列的获得人工合成权利要求1所述的接头序列； b、 利用分子生物学技术将接头序列连接到质粒载体的多克隆位点位置后，形成的新的 载体，对外源片段进行连接非依赖的克隆。3. 根据权利要求2所述的应用，其特征在于b步骤具体是:合成扩增Gat eway盒的引物， 其中上下游接头序列分别位于上下游引物的5'末端，通过PCR扩增Gateway盒，通过酶切连 接克隆入目的载体的多克隆位点，形成新的载体作为连接非依赖的克隆，其中该载体的多 克隆位点的上下游位置分别为所述的上下游接头序列； 进行连接非依赖克隆时，所述的上下游接头序列分别设计与目的基因的上下游引物5' 末端，通过PCR扩增获得侧翼序列为上下游接头的目的基因片段； 通过T4DNA聚合酶处理载体和中介片段，获得5'末端突出的载体和中间片段，其中的末 端突出为接头序列;通过将5 '末端突出的载体和片段混合，形成碱基互补配对，转化，形成 完整的质粒载体，完成对目的片段的克隆。
【专利摘要】本发明涉及基因工程领域，特别涉及一对用于连接非依赖克隆的接头序列及其应用。一种用于连接非依赖克隆的接头序列，该接头序列包括上游序列：gg？gAg？Cgg？AAg？Cgg，SEQ？ID？NO：7所示的核苷酸序列；和下游序列：gC？Cag？AgC？CAC？Cgc，SEQ？ID？NO：8所示的核苷酸序列。本发明的用于连接非依赖克隆(ligation？independent？cloing，LIC)序列，将该接头序列连接入质粒载体后形成的新的载体，可以实现目的片段的连接非依赖克隆。
【IPC分类】C12N15/63, C12N15/11
【公开号】CN105524919
【申请号】CN201511027677
【发明人】赵晋平, 彭杰军, 鲁宇文, 燕飞, 程晔, 陈剑平
【申请人】浙江省农业科学院
【公开日】2016年4月27日
【申请日】2015年12月31日