一种纳米纤维素载体固定化β-甘露聚糖酶制备低聚甘露糖的方法
【技术领域】
[0001]本发明公开了一种纳米纤维素载体固定化β-甘露聚糖酶制备低聚甘露糖的方法，属于低聚甘露糖制备领域。
【背景技术】
[0002]聚甘露糖是由2?10个甘露糖通过β-l，4糖苷键聚合而成的低聚糖，又称甘露寡糖。它可有效促进生物体内以双歧杆菌为代表的肠道益生菌群的增殖，并具有抑制体内病原菌生长、减少有毒代谢产物产生、防止便秘、保护肝脏、抗肿瘤及增强机体免疫力等多种生理功能，是新一代功能性食品。目前低聚甘露糖的制备通常都是利用高温水解、酸水解或者碱水解，酶法水解虽然也有报道，但条件还不够成熟。酶法生产低聚甘露糖主要受制于生产所用的关键酶的催化效率较低、酶的生产和使用成本较高，以及底物的粘度过大难以实现高浓度的生产等。
[0003]酶作为生物催化剂，具有反应条件温和、催化效率高、对底物具有高度的选择性，活性可控等优点。但在自由状态的游离酶具有不稳定性，在高温、强酸、强碱及部分有机溶液中容易导致酶的构象变化，甚至是蛋白变性，其催化活性降低甚至完全丧失。即使在反应最适条件下，也往往会很快失活。另外，自由酶混入反应体系中，使得产品分离纯化变得更加复杂，酶也因此难以重复使用。
【发明内容】
[0004]本发明主要解决的技术问题:针对目前传统的固定化酶的载体大多采用常规薄膜、微粒或普通纤维等，存在固定量小，空间位阻大，而且酶法生产低聚甘露糖所用的酶催化效率较低、酶的生产和使用成本较高的问题，提供了一种纳米纤维素载体固定化β-甘露聚糖酶制备低聚甘露糖的方法，本发明以纳米纤维素材料为甘露聚糖酶载体得固定化酶，由于纳米纤维素巨大的比表面积，可以有利于酶固定量的提高，促使固定化酶和底物频繁碰撞，很好地保持酶的活性，大幅度提高催化效率，并且其贮存稳定性高、分离回收容易、可多次重复使用，以魔芋粉为原料，制成的固化酶为催化剂，水解得到的低聚甘露糖产率大、纯度高，而且制备工艺简单、成本低。
[0005]为了解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案是:
(1)取5?8g纳米纤维素，将其浸泡在质量分数5%氢氧化钠溶液中，搅拌混合15?20min后抽滤，将滤渣用去离子水洗涤3?5次再抽滤，将滤渣烘干，烘干后按1.5?2.5g/L加入质量浓度10%高碘酸钠溶液中，在40?50°C下置于摇床中避光振荡30?40min，振荡后过滤，得到滤渣放入质量浓度0.2mol/L乙二醇中浸泡25?35min，洗除多余高碘酸钠，浸泡后再将滤渣用去离子冲洗3?5次，烘干得改性纳米纤维素；
(2)将pH6.5?8.0磷酸盐缓冲液中按I?3mg/mL加入β-甘露聚糖酶，在35?45°C水浴下搅拌至固体溶解，将溶液用超声波在400?500W进行破碎，破碎8?1s后隔3?5s再破碎，15?20min后得到破碎液放入冰箱中冷却至4°C，取出立即加入分离机中，在5000?6000r/min转速下离心分离15?20min，收集上清液，得到甘露聚糖酶酶液；
(3)将步骤(I)得到的改性纳米纤维素按0.1?0.3g/L加入到上述β-甘露聚糖酶酶液，温度控制在4°C在恒温摇床中以200?300r/min转速下进行振荡I?2h，振荡后放入冰箱中静置固化10?12h，固化完全后过滤，将滤渣分别用pH6.5?8.0磷酸盐缓冲溶液和去离子水冲洗I?3次，冲洗后冷冻干燥就可得到纳米纤维素载体固化β-甘露聚糖酶；
(4)按质量比3:5称取50?80g魔芋粉加入到质量浓度为85?90%的乙醇溶液中，在55?65°C水浴中进行搅拌混合15?20min，得魔芋浊液，用冰醋酸调节pH为4.0?5.0，调节后加入总质量0.5?0.8%纳米纤维素载体固化β-甘露聚糖酶，在55?65°C水浴下进行搅拌反应4?6h，反应结束后把滤渣用水洗涤，得滤液和魔芋浊液合并，用质量浓度15%氢氧化钠溶液调节滤液pH为7.5?8.5，调节后将滤液在50?60°C下真空浓缩至过饱和糖浆；
(5)向上述过饱和糖浆中加入0.1?0.3mg甘露糖晶体，室温静置20?22h，待有晶体析出时，在90?95°C的水浴下缓慢加入5?8mL质量分数无水乙醇溶液，有大量晶体析出，室温静置20?22h后抽滤，将得到的晶体干燥至恒重，即为低聚甘露糖。
[0006]本发明的应用方法:本发明制得的低聚甘露糖可以应用于食品中，例如替代饮料中白砂糖的30?60%，具有低热值、低甜度、不引发龋齿、不增加血糖浓度效果；添加在奶油食品中，可将原来白砂糖的10?15%更换为低聚甘露糖，可提高产品的乳化性，而且食用起来避免油腻口感;将低聚甘露糖替代白砂糖添加在保健食品中，具有增强免疫力，抗病防病，改善肠道健康状况的功能。
[0007]本发明的有益效果是:
(1)本发明以纳米纤维素巨大的比表面积，可以有利于酶固定量的提高，促使固定化酶和底物频繁碰撞，很好地保持酶的活性，大幅度提高催化效率，并且其贮存稳定性高、分离回收容易、可多次重复使用；
(2)本发明制成的固化酶为催化剂，水解得到的低聚甘露糖产率大、纯度高，而且制备工艺简单、成本低。
【具体实施方式】
[0008]取5?8g纳米纤维素，将其浸泡在质量分数5%氢氧化钠溶液中，搅拌混合15?20min后抽滤，将滤渣用去离子水洗涤3?5次再抽滤，将滤渣烘干，烘干后按1.5?2.5g/L加入质量浓度10%高碘酸钠溶液中，在40?50°C下置于摇床中避光振荡30?40min，振荡后过滤，得到滤渣放入质量浓度0.2mol/L乙二醇中浸泡25?35min，洗除多余高碘酸钠，浸泡后再将滤渣用去离子冲洗3?5次，烘干得改性纳米纤维素;将pH6.5?8.0磷酸盐缓冲液中按I?3mg/mL加入β-甘露聚糖酶，在35?45°C水浴下搅拌至固体溶解，将溶液用超声波在400?500W进行破碎，破碎8?1s后隔3?5s再破碎，15?20min后得到破碎液放入冰箱中冷却至4°C，取出立即加入分离机中，在5000?6000r/min转速下离心分离15?20min，收集上清液，得到β-甘露聚糖酶酶液;将得到的改性纳米纤维素按0.1?0.3g/L加入到β-甘露聚糖酶酶液，温度控制在4°C在恒温摇床中以200?300r/min转速下进行振荡I?2h，振荡后放入冰箱中静置固化10?12h，固化完全后过滤，将滤渣分别用pH6.5?8.0磷酸盐缓冲溶液和去离子水冲洗I?3次，冲洗后冷冻干燥就可得到纳米纤维素载体固化β-甘露聚糖酶;按质量比3:5称取50?80g魔芋粉加入到质量浓度为85?90%的乙醇溶液中，在55?65°C水浴中进行搅拌混合15?20min，得魔芋浊液，用冰醋酸调节pH为4.0?5.0，调节后加入总质量0.5?0.8%纳米纤维素载体固化甘露聚糖酶，在55?65°C水浴下进行搅拌反应4?6h，反应结束后把滤渣用水洗涤，得滤液和魔芋浊液合并，用质量浓度15%氢氧化钠溶液调节滤液pH为7.5?8.5，调节后将滤液在50?60°C下真空浓缩至过饱和糖浆；向过饱和糖浆中加入0.1?0.3mg甘露糖晶体，室温静置20?22h，待有晶体析出时，在90?95°C的水浴下缓慢加入5?8mL质量分数无水乙醇溶液，有大量晶体析出，室温静置20?22h后抽滤，将得到的晶体干燥至恒重，即为低聚甘露糖。
[0009]实例I
取5g纳米纤维素，将其浸泡在质量分数5%氢氧化钠溶液中，搅拌混合15min后抽滤，将滤渣用去离子水洗涤3次再抽滤，将滤渣烘干，烘干后按1.5g/L加入质量浓度10%高碘酸钠溶液中，在40°C下置于摇床中避光振荡30min，振荡后过滤，得到滤渣放入质量浓度0.2mol/L乙二醇中浸泡25min，洗除多余高碘酸钠，浸泡后再将滤渣用去离子冲洗3次，烘干得改性纳米纤维素;将pH6.5磷酸盐缓冲液中按lmg/mL加入β-甘露聚糖酶，在35°C水浴下搅拌至固体溶解，将溶液用超声波在400W进行破碎，破碎8s后隔3s再破碎，15min后得到破碎液放入冰箱中冷却至4°C，取出立即加入分离机中，在5000r/min转速下离心分离15min，收集上清液，得到甘露聚糖酶酶液;将得到的改性纳米纤维素按0.lg/L加入到β-甘露聚糖酶酶液，温度控制在4°C在恒温摇床中以200r/min转速下进行振荡lh，振荡后放入冰箱中静置固化10h，固化完全后过滤，将滤渣分别用pH6.5磷酸盐缓冲溶液和去离子水冲洗I次，冲洗后冷冻干燥就可得到纳米纤维素载体固化β-甘露聚糖酶;按质量比3:5称取50g魔芋粉加入到质量浓度为85%的乙醇溶液中，在55°C水浴中进行搅拌混合15min，得魔芋浊液，用冰醋酸调节PH为4.0，调节后加入总质量0.5%纳米