一种变温调节生产耐高温真菌α-淀粉酶的方法
【技术领域】
[0001]本发明属于酶制剂制备技术领域，特别是一种耐高温真菌α-淀粉酶的制备方法。
【背景技术】
[0002]α-淀粉酶全称为ct-l，4-葡聚糖水解酶(EC3.2.1.1)，作用于淀粉时，可从分子内部切开ct -1,4-糖苷键而生成糊精和还原糖，由于产物的末端葡萄糖残基Cl碳原子为α-构型，故得名为α-淀粉酶。
[0003]常见的Ct-淀粉酶有二种:细菌α-淀粉酶、真菌α -淀粉酶和麦芽α -淀粉酶。细菌Ct-淀粉酶是由细菌如枯草杆菌、地衣芽孢杆菌等产生的，细菌α-淀粉酶的热稳定性较强。
[0004]真菌α -淀粉酶最早于1896年由日本的高峰让吉从米曲霉中提取，并作为消化剂使用。50年代以来，真菌α-淀粉酶的应用范围逐渐扩大，开始应用于淀粉制糖、酿造、面包、果蔬饮料、医药和饲料等领域。用于淀粉制糖可以生产出以麦芽三糖为主的新型糖浆；与葡萄糖苷转移酶合用，可以制备异麦芽低聚糖；在传统的饴糖、黄酒生产中使用此酶，可以简化生产工艺，提高原料利用率，节省粮食，降低生产成本；用于面包制作可以缩短发酵周期，制成的面包气孔分布均匀，体积大，保鲜期长，还可替代以往常用的面包添加剂溴酸钾；用于医药可作为消化剂，代替动物中提取的酶；用于果蔬饮料可以消除浑浊，提高收率；用于饲料可以提高饲料利用率。因此，真菌α-淀粉酶的应用具有广阔的市场前景。
[0005]但真菌α -淀粉酶的最适作用温度在55°C左右，当温度高于60°C便会逐渐失活，且热稳定相对较低，不适用于较高温度的反应过程，因此其应用与发展受到一定程度的限制。
【发明内容】
[0006]本发明的目的是提供一种变温调节生产耐高温真菌α -淀粉酶的方法。
[0007]所述的变温调节生产耐高温真菌α -淀粉酶的制备方法，其发酵罐培养阶段包括如下步骤:
[0008]将一级种子罐发酵液以6%接种量接入发酵罐，培养温度27_30°C，搅拌速度120-180r/min，通风量(V/V)l:l_3，培养时间10_15h ;然后以1_2°C /h降温速率缓慢降温至10-15°C，恒温培养15-20h ;继续以1_2°C /h降温速率缓慢降温至2_5°C，此时，将一级种子罐发酵液以4%接种量追加接入发酵罐，恒温培养20-30h ;最后以1_2°C /h升温速率缓慢升温至10_15°C，恒温培养15-20h ;继续以1_2°C /h升温速率缓慢升温至27_30°C，恒温培养 15-20h ；
[0009]补料控制:当发酵液中的还原糖含量降至3mg/ml-8mg/ml时，开始添加补料培养基，补料量以维持发酵液还原糖含量为2mg/ml-5mg/ml ；
[0010]放罐标准:60-80%菌体衰老自溶，酶活力增长缓慢。
[0011]所述发酵培养基组成为:麦芽糊精50-150g，玉米粉50-60g，豆饼粉15_25g，海藻糖30-40g，酵母粉4-8g，玉米浆l_5g，硫酸铵l_3g，磷酸氢二钾l_2g，磷酸二氢钾l_2g，柠檬酸钠 l-5g,消泡剂 0.Ι-lg,纯净水 100mL, pH 值 5-6.5，121。。灭菌 20min ；
[0012]所述补料培养基重量组成为:麦芽糊精20-30%，玉米粉10-20%，豆粉15-25 %，不足部分纯净水补足，pH值5-6.5，121-123°C灭菌30_40min。
[0013]发酵液经过滤、浓缩、调配、精滤、干燥得耐高温真菌α -淀粉酶。
[0014]本发明所使用的菌株具体为里氏木霉901_18Trichoderma reesei 901-18。该菌株已于2013年11月24日保藏于中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC，地址为:中国.武汉.武汉大学)，保藏号CCTCC N0:M2013602c
[0015]所述里氏木霉901-18由一株分离自津市市河堤食用菌培植基地土壤样本的里氏木霉菌株经紫外线-氯化锂-硫酸二乙酯复合诱变筛选获得，菌株特点如下:该菌株在PDA固体培养基上生长，形成的菌落特征为菌落呈棉絮状，菌落呈淡绿色，菌落扁平，高0.2-0.8mm,菌落边缘白色,整齐；生长速度快，48h菌落直径达1.5-8.5mm, 72h达30_55mm ；菌丝白色，有隔膜，菌丝壁光滑，直径在2-5 μ m。分生孢子梗从菌丝的短侧枝发生，侧枝上对生。该菌株产真菌ct -淀粉酶的最适pH 3.0-6.5 ;最适温度为27?30°C。
[0016]有益效果:
[0017]1、本发明所述的生产耐高温真菌α-淀粉酶的方法以里氏木霉901-18为菌种，该菌种为首次公开。
[0018]2、采用本发明所述方法生产的耐高温真菌α -淀粉酶具有如下特点:酶活力高达12000-15000u/ml ;酶温度适应范围较宽，为50_75°C之间，最适作用温度在65°C，70°C下保存3h仍具有80%以上酶活，具有较好的热稳定性和保存活性；该酶最适反应pH值为5.5，在pH值4.5-7.0酶活保持在70%以上。比现有的耐高温真菌α -淀粉酶酶活力高，酶作用最适pH值范围宽泛，耐温度高，特别适合反应温度高、液化工艺与糖化工艺并存的工业化需求。
[0019]3、本发明中的耐高温真菌α -淀粉酶在制备过程中由于对培养基实施全程优化，采用梯度降温和梯度升温的发酵工艺显著提高了里氏木霉901-18的抗应激能力，致使菌种的产酶能力最大限度地显现，使得本发明所产耐高温真菌α-淀粉酶酶活力高、作用条件宽泛、稳定性强、适于工业化生产，具有更好的稳定性和保存活性。
【具体实施方式】
[0020]下面通过具体的实施方案叙述本发明。除非特别说明，本发明中所用的技术手段均为本领域技术人员所公知的方法。另外，实施方案应理解为说明性的，而非限制本发明的范围，本发明的实质和范围仅由权利要求书所限定。对于本领域技术人员而言，在不背离本发明实质和范围的前提下，对这些实施方案中的物料成分和用量进行的各种改变或改动也属于本发明的保护范围。
[0021]实施例1:
[0022]一种变温调节生产耐高温真菌α -淀粉酶的方法，包括如下步骤:
[0023](I)菌种活化
[0024]将保存完好的里氏木霉901-18的PDA斜面菌种接种于斜面培养基，27°C培养24h进行菌种活化，如此活化2次；
[0025](2)液体种子扩大培养
[0026]①一级种子培养:将步骤(I)活化制成的孢子悬液接入500毫升摇瓶中，使孢子浓度达到15个/mL，培养基装量100毫升，旋转式摇床120r/min，培养温度27°C，培养时间1h ；
[0027]②二级种子培养:将一级种子按照10%的接种量接入500毫升二级种子摇瓶中，培养条件与一级种子相同；
[0028]③三级种子培养:将二级种子以10%接种量接入5000 _升三级种子摇瓶中，培养基装量1000毫升，旋转式摇床100r/min，培养温度27°C，培养时间1h ；
[0029]④一级种子罐培养:将三级种子以10%接种量接入总容积为150L的一级种子罐，发酵培养基装量100L，培养温度TVC，搅拌速度200rpm，通风量(V/V) 1:1,罐压0.05Mpa,培养时间1h ；
[0030]所一级、二级、三级种子培养基重量组成为:
[0031]酵母粉0.3%，葡萄糖1%，蛋白胨0.3%，牛肉膏0.5%，磷酸氢二钾0.8%，海藻糖1%，硫酸韩Ig,氯化镁2g,朽1檬酸钠lg，不足部分纯净水补足，pH值5,121°C灭菌30min。
[0032]所述种子罐培养基重量组成为:
[0033]麦芽糊精5%，酵母粉0.4%，海藻糖1%，蛋白胨0.1%，玉米浆0.1%，磷酸氢二钾0.8%，硫酸镁0.05%，柠檬酸钠0.1%，不足部分纯净水补足，pH值5，121°C灭菌30min。
[0034](3)发酵罐发酵
[0035]将步骤(2)中一级种子罐发酵液以6%接种量接入发酵罐，培养温度27°C，搅拌速度120r/m，通风量(V/V) 1:1，培养时间1h ;然后以1°C /h降温速率缓慢降温至10°C，恒温培养15h ;继续以1°C /h降温速率缓慢降温至2°C，此时，将步骤(2)中一级种子罐发酵液以4%接种量追加接入发酵罐，恒温培养20h ;最后以1°C /h升温速率缓慢升温至1tVg温培养15h ;继续以1°C /h升温速率缓慢升温至27 °C，恒温培养15h ；
[0036]溶解氧控制:通过调整搅拌转速及通风量，控制溶解氧15% ；
[0037]PH控制:通过补氨水或稀磷酸，控制发酵过程中pH值保持在5 ；
[0038]补料控制:当发酵液中的还原糖含量降至3mg/ml-8mg/ml时，开始添加补料培养基，补料量以维持发酵液还原糖含量为2mg/ml-5mg/ml ；
[0039]放罐标准:60%菌体衰老自溶，酶活力增长缓慢。
[0040]所述发酵培养基组成为:麦芽糊精50g，玉米粉50g，豆饼粉15g，海藻糖30g，酵母粉4g，玉米浆lg，硫酸铵lg，磷酸氢二钾lg，磷酸二氢钾lg，柠檬酸钠lg，消泡剂0.1g,纯净水 100mL, pH 值 5，121°C灭菌 20min ；
[0041]所述补料培养基重量组成为:麦芽糊精20%，玉米粉10%，豆粉15%，不足部分纯净水补足，pH值5,121。。灭菌30min。
[0042](4)发酵液经过滤、浓缩、调配、精滤、干燥得耐高温真菌α -淀粉酶。
[0043]经上述制备方法得到的耐高温真菌α -淀粉酶液体酶活力为12000u/ml。
[0044]实施例2:
[0045]一种变温调节生产耐高温真菌α -淀粉酶的方法，包括如下步骤:
[0046](I)菌种活化
[0047]将保存完好的里氏木霉901-18的PDA斜面菌种接种于斜面培养基，30°C培养30h进行菌种活化，如此活化3次；
[0048](2)液体种子扩大培养
[0049]①一级种子培养:将步骤(I)活化制成的孢子悬液接入500毫升摇瓶中，使孢子浓度达到15个/mL，培养基装量100毫升，旋转式摇床150r/min，培养温度30°C，培养时间1h ；
[0050]②二级种子培养:将一级种子按照10%的接种量接入500毫升二级种子摇瓶中，培养条件与一级种子相同；
[0051]③三级种子培养:将二级种子以10%接种量接入5000晕升三级种子摇瓶中，培养基装量1000毫升，旋转式摇床150r/min，培养温度30°C，培养时间15h ；
[0052]④一级种子罐培养:将三级种子以10%接种量接入总容积为150L的一级种子罐，发酵培养基装量100L，培养温度30 V，搅拌速度150r/min，通风量(V/V) 1:1.5,罐压0.05Mpa,培养时间15h ；
[0053]所一级、二级、三级种子培养基重量组成为:
[0054]酵母粉0.4%，葡萄糖1.2%，蛋白胨0.4%，牛肉膏0.6%，磷酸氢二钾1.