专利名称：一种白腐真菌的产酶方法
技术领域：
本发明专利涉及一种白腐真菌持续高效产酶方法，属于环境生物技术领域，能够应用在难降解有机废水处理及环境修复中。
背景技术：
包括染料化工废水在内的难降解有机工业废水具有色度高、盐度高、毒性强、污染物含量高且成分复杂、难以降解等特点，是工业废水污染治理的重点和难点，这些工业废水如不妥善处理而排放到环境中以后，将造成严重的生态破坏和人类健康问题。
白腐真菌在木质素降解酶催化作用下通过自由基链式反应对染料废水中各种有机污染物等具有广谱、高效的降解功能。白腐真菌分泌的木质素降解酶主要有木质素过氧化物酶(LiP)、锰过氧化物酶(MnP)和漆酶(Lac)，它们是难降解有机工业废水快速、高效处理的功能核心。如何实现白腐真菌木质素降解酶的持续高效产出，是白腐真菌环境生物技术的工程化应用中急需解决的问题，对建设大规模酶反应器处理系统、降低工业废水处理的运行费用具有重大意义。
发明内容
本发明专利提供一种白腐真菌持续高效产酶的方法。
为实现本发明的目的，本发明所述的白腐真菌持续高效产酶方法包括保证持续产酶和降低产酶成本的玉米芯填料、孢子液制备和发酵参数控制方法。
本发明的主要内容为利用玉米芯作为白腐真菌的生长载体和补充营养基质，利用气升式发酵设备并优化发酵条件，实现木质素过氧化物酶和锰过氧化物酶的持续高效产出，同时降低产酶成本。具体包括以下步骤 (1)玉米芯的前处理将玉米芯处理成尺寸为0.5cm×0.5cm×0.5cm的立方体，在115℃、0.1Mpa下灭菌15分钟，放至于无菌室内冷却，后于无菌室内将其放至装有限氮培养基的摇瓶中，使每个摇瓶中玉米芯载体的数量保持在10个/100ml； (2)白腐真菌孢子液配制平板内注入无菌水，加入白腐真菌孢子粉，经过4层擦镜纸过滤，滤去菌丝体，得白腐真菌孢子液； (3)将玉米芯载体和白腐真菌孢子液通入发酵罐，发酵罐内温度保持在37℃，进气量为1.0vvm，往发酵罐内加入限氮培养基，实现白腐真菌的产酶方法。
本发明提供的白腐真菌的产酶方法，其中限氮培养基成分为(L-1)葡萄糖10g，酒石酸铵0.2g，苯甲醇0.54g，KH2PO4 2.56g，MgSO4·7H2O0.71g，维生素B10.001g，微量元素液70mL，10mmol/L醋酸缓冲液调节pH至4.5；其中微量元素液(L-1)的成分为氨基乙酸0.6g，MnSO4·H2O 0.5g，NaCl 1g，FeSO4·7H2O 0.1g，CoCl2·H2O 0.19g，CaCl2·2H2O 1.56g，ZnSO4·7H2O 0.1g，CuSO4·5H2O 0.1g，KAl(SO4)2·12H2O 0.01g，HBO3 0.01g，Na2MoO4·2H2O 0.01g。
本发明专利的显著效果为(1)木质素过氧化物酶和锰过氧化物酶的持续高效产出；(2)产酶成本下降。
具体实施例方式 下面结合实施例对本发明进行详细说明 (1)玉米芯的前处理、尺寸、投料量和投加时间将玉米芯先用清水洗净，后处理成尺寸为0.5cm×0.5cm×0.5cm的立方体，将其在115℃、0.1Mpa下灭菌15分钟，放至于无菌室内让其冷却，后于无菌室内将其放至装有限氮培养基的摇瓶中，使每个摇瓶中玉米芯载体的数量保持在10个/100ml。
(2)白腐真菌孢子液配制平板内注入少量无菌水(实验室无菌水将100mL水加入200mL或250mL三角瓶中，加棉塞，包扎，121℃、0.1Mpa下灭菌30分钟)，以推棒刮下孢子粉，经过4层擦镜纸过滤，滤去菌丝体。所得滤出液用血球计数板计数。
菌体计数步骤1)取清洁干燥的血球计数扳，在计数室上面加盖玻片。2)取菌液摇匀，用滴管由盖玻片边缘滴一小滴，则菌液自行渗入，计数室不得有气泡。3)样品浓度要求每小格有5-10个菌体为宜。4)计数时，按对角线取左上、左下、右上、右下及中央方格(即80小格)。5)每个样品重复计数2-3次，取平均数，按公式计数细胞数/(mL)＝(80小格内的细胞数/80)×400×10000×稀释倍数。发酵参数的控制通过调节温度控制阀，使发酵罐内温度保持在37℃；通过调节进气阀门，使进气量为1.0vvm；通过前期检测到的酶活变化曲线定期往发酵罐内加入一定的限氮培养基，使黄孢原毛平革菌在发酵罐内能持续高效的产酶。
蒸汽进入发酵罐进行加热和消毒；使发酵罐温度维持在115℃，罐压维持在0.1Mpa，保温15分钟；停止蒸汽进入，发酵罐自然冷却至38℃；将无菌空气通入发酵罐以提供发酵所需的氧气；加入限氮培养基15L至发酵罐中。将白腐真菌孢子和玉米芯填料放入发酵罐；发酵过程中需要检测酶活和总糖含量及其变化规律；当发酵液中酶活达到峰值时，可以排出粗酶液，或经提纯制成酶制剂产品。培养液采用限氮培养基，其成分为(L-1)葡萄糖10g，酒石酸铵0.2g，苯甲醇0.54g，KH2PO4 2.56g，MgSO4·7H2O 0.71g，维生素B1 0.001g，微量元素液70mL，10mmol/L醋酸缓冲液调节pH至4.5。其中微量元素液(L-1)的成分为氨基乙酸0.6g，MnSO4·H2O 0.5g，NaCl 1g，FeSO4·7H2O 0.1g，CoCl2·H2O 0.19g，CaCl2·2H2O 1.56g，ZnSO4·7H2O0.1g，CuSO4·5H2O 0.1g，KAl(SO4)2·12H2O 0.01g，HBO3 0.01g，Na2MoO4·2H2O 0.01g。
权利要求
1、一种白腐真菌的产酶方法，以玉米芯作为菌体的生长载体和产酶的补充基质，其特征在于
(1)玉米芯的前处理将玉米芯处理成尺寸为0.5cm×0.5cm×0.5cm的立方体，在115℃、0.1Mpa下灭菌15分钟，放至于无菌室内冷却，后于无菌室内将其放至装有限氮培养基的摇瓶中，使每个摇瓶中玉米芯载体的数量保持在10个/100ml；
(2)白腐真菌孢子液配制平板内注入无菌水，加入白腐真菌孢子粉，经过4层擦镜纸过滤，滤去菌丝体，得白腐真菌孢子液；
(3)将玉米芯载体和白腐真菌孢子液通入发酵罐，发酵罐内温度保持在37℃，进气量为1.0vvm，往发酵罐内加入限氮培养基，实现白腐真菌的产酶方法。
2.如权利要求1所述的白腐真菌的产酶方法，其特征在于限氮培养基成分为(L-1)葡萄糖10g，酒石酸铵0.2g，苯甲醇0.54g，KH2PO4 2.56g，MgSO4·7H2O 0.71g，维生素B1 0.001g，微量元素液70mL，10mmol/L醋酸缓冲液调节pH至4.5；其中微量元素液(L-1)的成分为氨基乙酸0.6g，MnSO4·H2O 0.5g，NaCl 1g，FeSO4·7H2O 0.1g，CoCl2·H2O0.19g，CaCl2·2H2O 1.56g，ZnSO4·7H2O 0.1g，CuSO4·5H2O 0.1g，KAl(SO4)2·12H2O 0.01g，HBO3 0.01g，Na2MoO4·2H2O 0.01g。
全文摘要
本发明涉及一种白腐真菌持续高效产酶方法，属于环境生物技术领域，能够应用在难降解有机废水处理及环境修复中。为实现本发明的目的，本发明所述的白腐真菌持续高效产酶方法利用玉米芯作为白腐真菌的生长载体和补充营养基质，利用气升式发酵设备并优化发酵条件，实现木质素过氧化物酶和锰过氧化物酶的持续高效产出，同时降低产酶成本。
文档编号C02F3/00GK101260389SQ200810036038
公开日2008年9月10日 申请日期2008年4月15日 优先权日2008年4月15日
发明者黄民生, 尚 高, 芳 陶 申请人:华东师范大学