一种白腐真菌及其选育方法和应用的制作方法

专利名称：：一种白腐真菌及其选育方法和应用的制作方法
技术领域：
：本发明涉及一种白腐真菌(TrametesVersicolor)YS-L613，同时还涉及该菌株的诱变选育方法，特别涉及利用该菌株生产漆酶的方法。
背景技术：
：漆酶是一种氧化还原酶，其作用主要是催化氧化还原反应，因此漆酶能把分子氧直接还原为水，在没有过氧化氢和其它次级代谢产物存在下，可催化大量的酚类和芳香胺类化合物的氧化。一些漆酶能高效地氧化抗坏血酸，另外一些真菌漆酶还能催化木质素和甲氧基酚酸的脱甲基反应。漆酶作用的底物相当广泛，包括多酚、甲基替代单酚、芳香胺、苯硫醇、聚甲氧基苯，以及其他容易氧化的化合物，还有许多与对二酚结构类似的化合物，如氨基苯酚，邻、对苯二酚，多酚，多胺，木质素和芳基二胺等。由于具有相当广泛的底物专一性和较好的稳定性，漆酶在废水处理、生物漂白、芳香化合物转化、环境监测等方面具有重要应用价值。漆酶的抑制剂大多是铜离子螯合剂,有卤化物、半胱氨酸、EDTA和SDS等；离子强度的不同会影响酶的活力，不同来源的漆酶最适pH范围也会不同。漆酶的应用研究现主要集中于生物造纸、环境污染治理、食品工业应用、有机合成、生物及免疫检测等。对漆酶的研究早在上世纪60年代就己开始，已经从不同来源的微生物中分离到大量的不同类型、不同功能的漆酶。漆酶制浆造纸工业、食品工业、能源工业中都显示出广阔的应用前景。漆酶是以农副产品为原料，经微生物纯种发酵提取而制得的一种新型酶制剂。漆酶也是继纤维素,酶，木聚糖酶等新品种酶制剂开发之后的又一重要品种，是国家大力提倡i展的新型酶制剂产品之一。随着国民经济的持续健康发展，人民的生活水平的逐步提高对漆酶的需求越来越大，这是社会发展的需要，也是开展该项目研究的重要意义之一。第二，从目前国内酶制剂行业发展情况来看，漆酶研究虽起步较早，但发展缓慢。因此适时开发漆酶即可以提高竞争，有可以部分取代进口产品，满足国内市场需求。第三，该项目的研究开发对于调整工业生产结构具有重要作用。第四，发展漆酶的开发研制，不但可以满足国内市场的需求，而且可以出口国外，为国家创造大量的外汇，同时可以与纤维素酶、木聚糖酶、淀粉酶、糖化酶、果胶酶等配制成符合酶制剂，以满足不同行业的要求。目前如何获得大批量、低成本、高品质的漆酶已经成为制约和影响我国漆酶产业化发展的关键因素。而解决这个问题需要从两方面着手菌种的选育及发酵工艺的优化。目前，国内漆酶的研究大多还处在实验室阶段研发阶段，没有进入工业化规模生产，其根本的原因在于一是菌种的产酶水平较低，经济效益差，无法进行工业化生产；二是菌种规模生产的工艺不成熟。
发明内容本发明的目的在于提供一种白腐真菌(TrametesVersicolor)YS_L613。同时，本发明的目的还在于提供一种白腐真菌(TrametesVersicolor)YS-L613的诱变选育方法。另外，本发明的目的还在于提供一种利用白腐真菌(TrametesVersicolor)YS-L613生产漆酶的方法，以大大提高漆酶的产率。为了实现上述目的，本发明的技术方案采用了一种白腐真菌(TrametesVersicolor)YS-L613,其由以下方法诱变选育而制得，以白腐真菌为出发菌株，采用以UV、6°C0、紫外线、亚硝基胍、离子注入与微波处理相结合的复合诱变育种技术，选育出漆酶高产菌株YS-L613。同时，本发明的技术方案采用了一种白腐真菌(TrametesVersicolor)YS-L613的诱变选育方法，以白腐真菌为出发菌株,采用以UV、，0、紫外线、亚硝基胍、离子注入与微波处理相结合的复合诱变育种技术，选育出漆酶高产菌株YS-L613。具体方法包括以下步骤(1)出发菌种，以白腐真菌YS菌株为出发菌种，4-C保藏于CPDA斜面；(2)培养基①斜面培养基(CPDA)为每20Q/。土豆汁1000mL中含葡萄糖15—25g、MgS047H201—2g、KH2P042—4g、VB11—3mg、琼脂粉13—16g;②摇瓶液体发酵培养基每1000mL发酵培养基中含有葡萄糖15—25g、天冬酰胺2—3g、MgS047H200.1—lg、FeS047H208—12mg、MnS044H200,1—lmg、ZnS047H200.1—lmg、CuS045H201—3mg、NaHP04'H2090—llOmg、KH2P040.1—lg、CaCl28—12mg、VB148—52mg、KraftLignin(碱溶木素)0.1—lg;③液体种子培养基葡萄糖1—3%、MgS047H200.1—1%、KH2P040.1—0.5%，VB12X1(T4%,土豆汁20%，其余为水；发酵培养基(g/L):玉米淀粉25—35g(酶解)、天冬酰胺2—3g、MgS047H200.1—lg、FeS047H208_12mg、MnS044H200.5—lmg、ZnS04'7H2O0.5—lmg、CuS04'51120l—3mg、NaHP04'I^O90—110mg、KH2P040.5—lg、CaCl28—12mg、VB150mg、KraftLignin(碱溶木素)0.5—lg，pH8.5;(3)种瓶制备:取保藏的真菌斜面进行活化培养，挑取适量菌丝块于250mL的三角瓶中(内装50mL液体培养基)，于30。C，150r/min，振荡培养3d;发酵培养将种瓶培养物匀浆后接入发酵瓶，于30'C，150r/min，培养5天；(4)菌悬液的制备将培养4—5d斜面菌种，有无菌的生理盐水洗下菌丝体，经玻璃珠打散，制成含菌体106—108的悬液；①紫外线诱变取10ml菌悬浮液于直径为9cm的平皿中，磁力搅拌，于20W紫外线灯15—20cm处，照射l一10min;②亚硝基胍(NTG)诱变:用pH6.0、0.2mol/L磷酸盐缓冲液制成的菌悬液于同样的磷酸盐缓冲液的NTG液等量混合，分别以0.25、0.5、1.0mg/mlNTG浓度，30。C温度，诱变20min，稀释法终止反应；③幼CoY-射线辐射诱变取10ml菌悬浮液于无菌试管中，分别以8万、10万、伦琴进行60CoY-射线辐射；@离子束注入诱变处理取纯种斜面加入10mL无菌水洗脱菌丝体，并稀释成一定浓度的菌丝体悬液；取O.lmL菌悬液于无菌空平皿中涂均匀，用无菌风吹干，然后放入离子注入机的靶室进行离子注入，注入完毕后，用无菌水洗脱，稀释涂平皿，等单单菌落生成后，转接于斜面培养基上；⑤微波诱变吸取制得菌悬浮液，注入底部平整的平皿中，每个平皿的菌液为10ml，调整微波炉(格兰仕)功率为700W，脉冲频率为2450Hz，辐照处理20s、40s、60s、80s、100s，其中每辐照10s，要冷却10s，然后适当稀释涂分离平板；.(5)突变株分离上述各诱变处理的菌悬液，取O.lml涂布与分离培养基上30'C，培养4一5天(紫外线诱变平板避光培养)，挑取单菌落，培养3—4天(6)筛选，对诱变入后的菌株进行筛选时，突变株酶活力高于对照菌株5%的突变株为正突变，而低于5%的菌株称为负突变，在±5%之间作为未突变菌株。所述步骤(6)的筛选包括初筛和复筛，其中初筛是各诱变处理后，从30'C培养12小时以上生长的菌落，根据经验有针对性地大量挑取可能与产酶能力有关的形态变异性突变菌株，逐步捉高产酶菌株的定向筛选范围，并传接斜面2-3代确保菌种性能稳定；然后，直接接入发酵瓶，进行培养，每个菌株接到一个发酵瓶。挑取正突变的菌株，选3-10株进行复筛；复筛是将初筛得到的高产酶菌株经斜面活化后，进行摇瓶发酵试验测定酶活力。再者，本发明的技术方案还采用了一种利用白腐真菌(TrametesVersicolor)YS-L613生产漆酶的方法，包括以下步骤将培养成熟的白腐真菌(TrametesVersicolor)YS-L613茄子瓶斜面菌株，制成菌悬液，接入装有种子发酵培养基的种子发酵罐培养,温度29—31°C，罐压O.06-0.08mpa(表)，通风量30—90m7hr，培养约30hr接入35ii^大发酵罐(装料系数70%)，温度控制在29—3rC，罐压0.06—0.08即a(表)，通风量400—1000m7hr,pH值8.3—8.8;发酵成热醪液打入回收罐后，加入O.2~0.5%抑菌剂，然后直接进行过滤，滤液经二滤后进入超滤膜过滤，经超滤浓縮后可直接进行标准化处理和包装入库，即制得液体酶制品。所述的液体种子培养基葡萄糖1—3%、MgS04*7H200.1—1%、KH2P040.1_0.5%,VB12X10-4°/。，土豆汁20%,其余为水。所述的发酵培养基为每L中含有玉米淀粉25—35g(酶解)、天冬酰胺2—3g、MgS047H20O,l—lg、FeS047H208—12mg、MnS044H200.5—lmg、ZnS047H200.5—lmg、CuS045H201—3mg、NaHP04'112090—llOmg、KH2P040.5—lg、CaCl28—12mg、VB150mg、KraftLignin(碱溶木素)0.5—lg，pH8.5。所述的抑菌剂优选为苯甲酸钠。所述的二滤工艺采用的为二滤板框过滤机。所述的过滤后的滤渣经干燥后可以用做填充料或饲料。本发明通过离子注入、紫外线、诱变剂等物理化学处理方法，进行选育工作，最终筛选得到一种产漆酶较高的菌种YS-L613，并采用小试自动化控制工艺对菌种的发酵控制工艺技术和提取工艺技术，开发出漆酶产品。选育的白腐真菌(编号YS—L613)应用于漆酶的生产，利用深层液体发酵法工业化生产的漆酶。此种菌种产酶水平稳定，周期较短，酶系较纯，利用液体深层发酵法生产漆酶，在发酵方法上采用了稀醪发酵，适时限量补料，辅助pH值控制方法，使产酶菌能够较长时间处于产酶旺盛期。经过小试、中试并扩大至工业化生产，利用35吨发酵罐进行发酵生产，平均放罐酶活力90322u/L，最高达104284u/L。本发明的方法实现了国内漆酶工业化生产，发酵放罐酶活力水平己达国内领先水平。同时对成熟发酵液进行浓縮提纯处理试验，在参照其它酶提纯工业艺基础上，把二滤和精滤技术应用于漆酶生产工艺中，成功提纯漆酶产品，产品综合回收率达60%以上，形成一套完整的漆酶提纯工艺技术，达到国内领先水平。本发明的方法形成了一套完整的微生物菌株选育、发酵、酶制剂提纯工艺技术，实现了利用液体深层发酵在35吨罐中进行漆酶工业化生产。另外，在发酵工艺中，本发明选用了以二级发酵菌悬液接种代，采用了稀醪发酵，适时限量补料,控制pH的办法，使发酵单位提高20%，縮短发酵周期34hr。在提取工艺中，按照国家标准,在总结国内酶生产提取工艺基础上，利用二滤、超滤工艺技术处理漆酶产品，产品质量经检测完全符合国家行业标准。根据漆酶在纸浆漂白、纤维改性和纸浆脱墨的实验发现，在造纸工业中利用漆酶，能够改善纸章的品质，减少环境污染，节约成本。图l为本发明的菌种诱变选育方法流程图；图2为菌体放入真空靶室内不同时间的存活曲线；图3为N+注入能量对A3存活率的影响；图4在10keV能量不同剂量下的存活率；图5为N+注入剂量与突变率间的关系；图6为紫外线照射下菌体的存活曲线；图7为Y射线辐下菌体的存活曲线；图8为漆酶产生菌筛选谱系；图9为传代实验流程图；图10为漆酶液体发酵工艺流程图。具体实施例方式本发明的白腐真菌(TrametesVersicolor)YS-L613菌种，其由以下方法诱变选育而制得，以白腐真菌为出发菌株，采用以UV、6°C0、紫外线、亚硝基胍、离子注入与微波处理相结合的复合诱变育种技术，选育出漆酶高产菌株YS-L613。所需要的材料与制备方法如下-1.1出发菌种白腐真菌YS菌株，本室筛选并初步鉴定产漆酶菌株，4'C保藏于CPDA斜面。1.2培养基1.2.1斜面培养基(CPDA):葡萄糖20g,MgS04'7H201.5g，KH2P043g，VB12mg,琼脂粉15g，20。/。土豆汁1000mL。1.2.2摇瓶液体发酵培养基葡萄糖20g，天冬酰胺2.5g,MgS047H200.5g，FeSQ4*7H2010mg，MnS04'4H20lmg，ZnS04'7H20lmg，CuS045H202mg，NaHP04H20100mg，KH2P04l.Og，CaC1210mg,VB150mg,KraftLignin(碱溶木素)lg，定容到1000mL。1.2.3液体种子培养基葡萄糖2%，MgS04*7H200.5%g，KH2P040.3%:VB12X10-4%,土豆汁20%。1.2.4发酵培养基(g/L):玉米淀粉30g(酶解)，天冬酰胺2.5g,MgS047H200.5g，FeS047H2010mg，MnS044H20lmg，ZnS047H20lmg，CuS045H202mg,NaHP04H20励mg，KH2P04l.Og，CaCl210mg,VB150mg，KraftLignin(碱溶木素)lg,pH8.5。1.3方法1.3.1种瓶制备取保藏的真菌斜面进行活化培养，挑取适量菌丝块于250mL的三角瓶中(内装50mL液体培养基)，于30。C，150r/min，振荡培养3d。1.3.2发酵培养将种瓶培养物匀浆后按一定的接种量接入发酵瓶，于30°C，150r/min，培养5天。1.3.3l吨种子罐发酵条件用接种钢瓶接入菌种悬浮液，温度3o士rc，通风量30—90mVh，pH为8.3—8.8。35吨发酵罐发酵条件采用二级发酵温度30士rC，风量400—900mVh，pH值8.3—8.8。1.3.4粗酶液制备发酵液经8层纱布过滤，于室温，12000r/min离心30min，取上清液，适当稀释后用于酶活测定。1.3.5漆酶活力测定以2，2'连氮-二(3-乙基苯并噻唑-6-磺酸)(以下简称ABTS)为底物，反应总体积为3mL。取2.85mL0.5mol/L的酒石酸盐缓冲液(pH4.0)，加入100uL15mmol/L的ABTS和50yL适当稀释的酶样液，混合，于30'C水浴中准确反应3min,迅速测定OD420值。定义每分钟氧化lixmolABTS所需的酶量为一个酶活单位。每样品做3个重复，其平均偏差小于10%。1.3.6总糖测定采用3，5-二硝基水杨酸方进行测定，以葡萄糖为标准溶液，用7230G分光光度计测反应液A590值，计算样品中总糖含量。1.3.7生物量测定发酵培养物经过滤脱水后，用蒸馏水洗涤两次，于干燥箱中80'C恒温干燥48h,用分析天平测定菌丝体干重。1.3.8pH测定精密酸度计法。1.4诱变育种程序与方法1.4.1诱变育种程序(见图l)1.4.2诱变方法1.4.2.1菌悬液的制备将培养4—5d斜面菌种，有无菌的生理盐水洗下菌丝体，经玻璃珠打散，制成含菌体106—108的悬液。1.4.2.2紫外线诱变取10ml菌悬浮液于直径威为9cm的平皿中，磁力搅拌，于20W紫外线灯15—20cm处，照射1—10min。1.4.2.3亚硝基胍(NTG)诱变用pH6.0、0.2mol/L磷酸盐缓冲液制成的菌悬液于同样的磷酸盐缓冲液的NTG液等量混合，分别以0.25、0.5、1.0mg/mlNTG浓度，30'C温度，诱变20min，稀释法终止反应。1.4.2.460CoY-射线辐射诱变取10ml菌悬浮液于无菌试管中，分别以8万、IO万、伦琴进行60CoY-射线辐射(委托省科学院同位素辅助中心处理)。1.4.2.5离子束注入诱变处理诱变装置为50keV离子注入机，等离子体物理研究所离子束生物工程实验室自行研制生产。注入方式取纯种斜面加入10mL无菌水洗脱菌丝体，并稀释成一定浓度的菌丝体悬液。取0.1mL菌悬液于无菌空平皿中涂均匀，用无菌风吹干。然后放入离子注入机的耙室进行离子注入。注入完毕后，用无菌水洗脱，稀释涂平皿，等单单菌落生成后，转接于斜面培养基上。1.4.2.6微波诱变吸取制得菌悬浮液，注入底部平整的平皿中，每个平皿的菌液为10ml，调整微波炉(格兰仕)功率为700W，脉冲频率为2450Hz，辐照处理20s、40s、60s、80s、100s，其中每辐照10s，要冷却10s，然后适当稀释涂分离平板。1.4.2.7突变株分离上述各诱变处理的菌悬液，取0.1ml涂布与分离培养13基上3(TC，培养4一5天(紫外线诱变平板避光培养)，挑取单菌落，培养3-4天备用。1.5筛选方法1.5.1筛选标准对诱变入后的菌株进行筛选时，突变株酶活力高于对照菌株5%的突变株为正突变，而低于5%的菌株称为负突变，在±5%之间作为未突变菌株。1.5.2初筛各诱变处理后，从3(TC培养12小时以上生长的菌落，根据经验有针对性地大量挑取可能与产酶能力有关的形态变异性突变菌株，逐步捉高产酶菌株的定向筛选范围，并传接斜面2-3代确保菌种性能稳定。然后，直接接入发酵瓶，进行培养，每个菌株接到一个发酵瓶。挑取正突变的菌株，选3-10株进行复筛。1.5.3复筛初筛得到的高产酶菌株经斜面活化后，进行摇瓶发酵试验测定酶活力。每个高产菌株接三瓶发酵瓶，最后挑选最高的菌株作为下一轮诱变的菌株。1.6遗产稳定性实验在斜面培养基上将高产的菌株进行传代培养，联系培养6-7次后接种到发酵瓶中检测酶活。2、结果与讨论2.1离子束注入漆酶产生菌的诱变选育2丄1注入离子的选择注入所选用的离子包括金属离子和非金属离子。实验常用的离子为非金属离子(如H"、N"和Ar+)。但就rr、N"和Ar+这三种常用类型的离子而言，不同的研究报道有所差异，有人认为在其它条件不变的情况下H+N+和Ar+三种离子的致死关系为H+〉N+〉Ar+;也有人认为三种离子在致死率上存在的关系应为Ar〉N+〉H+。虽然研究人员就三种离子在致死率关系上存有分歧，但是在其诱变效率上却存在着共识，普遍认为N+的诱变效率最高，H+次之，Ar+的诱变效率最低。因为N+为组成DNA碱基的重要元素之一，N+注入不仅可以直接引起前碱基分子结构的变化，还可以参与细胞的重组和修复，产生的诱变突变较多，因此常用于微生物和植物诱变育种。基于上述的研究结果本发明选用了N+对黑曲霉A3处理，开展诱变选育的工作。2丄2真空对存活率的影响在离子注入过程中，所有的处理样品都要放在靶室里，处在真空中，因此样品都要受到真空的影响，而真空对白腐真菌存活率影响，是研究离子注入条件下黑曲霉A3孢子存活率的基础。所以在不同剂量的离子处理样品的过程中，均在靶室中放入了未接受注入的真空对照样品。图2是菌体放入真空靶室内不同时间的存活曲线。实验结果表明白腐真菌的存活率随着放入真空中时间的延长而呈现由快到慢的下降态势。滞留6分钟后只有大约20%的孢子存活，8分钟后致死率在98%以上，有时甚至达到100%。这可能是当细胞突然暴露于真空靶室时，水分不断蒸发，带走了大量的汽化热，菌体界面温度迅速下降，由于细胞内的热传导，一段时间内，整个菌体内部形成冰晶，使孢子大量死亡。2丄3能量对存活率的影响在离子注入过程中，除离子种类对诱变效率密切相关外，注入剂量率、能量和剂量等注入参数对此也有很大的影响，近年来的研究报道指出正突变较多发生在低致死率的诱变剂量中，存活率在20%—30%时，诱变效果较好。因此如何寻找合适的诱变参数成为实验最关键的问题。本发明选用2.6X1013iOnS/cm2中等剂量率对白腐真菌进行处理，着重对N^注入的能量和剂量进行了研究。从图3中可以看出，在注入剂量为15.6X10'5ions/cm2时，菌体的存活率呈现出肩型曲线。在较低的能量下菌体存活率呈现出急剧的下降趋势，当能量继续增大到10keV以上时，其存活率下降速度有明显减慢，致死率保持在一个水平状态。在诱变选育工作中为了确保有一定的存活率和较多的正突变，因此选取10keV的能量对菌株进行离子注入处理。2.1.4不同的剂量对菌体存活率的影响在选定N"的注入能量后，对注入剂量和各个剂量下的存活率进行了考察，结果见图4。从图中可以看出，它的存活曲线呈现出特异的双峰；这种特异的存活曲线图与紫外线和Y-射线等其他射线辐照生物有机体后呈现"肩型"或"直线型"的存活曲线相比有明显不同；与曾报道过的"马鞍型"曲线也不完全相同。尽管"双峰曲线"与"马鞍型"曲线不同，但是它的确能够反映离子束这种特异的诱变源所具有的独特的诱变效果，说明离子束独特的诱变效应具有其普遍性，即出现反常损伤；这也进一步证实离子束在诱变机理上与其它的辐射诱变源相比确有差异，因为离子注入除了具有能量沉积效应外，还有动量传递、质量沉积和电荷的中和与交换等效应存在。2.1.5不同剂量下的突变率当N+注入能量为10kev时，注入剂量从10x2.6xl014120x2.6xl014ions/s'cn^等几组不同剂量，对菌体进行注入，它们的突变率情况进行了统计，结果见图5。从图中可以看到，在10、20和60x2.6x1014的注入剂量下，正突变率要比负突变高，在40x2.6xl0"的剂量下负突变稍微比正突变高一些。而在80、100和120x2.6xl0"的剂量下负突变率要远远高于正突变。因此在选用注入剂量的情况下，既要考虑突变菌株的存活率，也要考虑正突变率。所以在离子注入诱变选育中，本发明选用10，20、40、60x2.6xl014这四个剂量作为常用的诱变注入剂量。注图5中①各个剂量突变率是以随机挑取的100200个左右的单菌落来统计；②计算正负突变时以高出和低于对照组5%为标准。2.26°Co_Y射线辐照和紫外线照射对菌体存活率和诱变效果的影响用Y射线辐照和紫外线照射漆酶产生菌菌体，照射后菌体的存活曲线见图6、7。结果显示，紫外线和6°0)-Y射线辐照的存活曲线都呈现单方向下降趋势，不过紫外线照射的存活曲线，在随着照射时间的增加迅速下降，在照射3min后，存活率降低较慢；而6nCo-Y射线辐照时，在低剂量下，菌体死亡较少，但用高剂量的射线进行照射时，存活率迅速下降，其存活曲线与抛物线相近。16表1紫外线照射和600)Y辐照对菌体的影响IrradiationSurvivalMutationPositiveNegativedoserate%rate%mutationrate%mutationrate%UV(2min)28.9113.78.15.6UV+LiCl32.1719.811.58.3(2min)UV+LiCl9.1222.113.98.2(4min)60Co12.1420.59.211.3(0.6kGy)60Co0.91131.74.926.8(1.2kGy)表1为Y射线和紫外线对漆酶产生菌菌体的诱变结果。它表明，菌体随着Y射线处理剂量的增大，存活率在下降而菌株的总突变率却显著增加；与此同时，正变率大幅度降低，产量负变率大幅度上升。紫外线照射4min和用0.6kGy的y射线处理的存活率和总突变率相当，但是Y射线处理的正突变效应小于负突变效应；而紫外处理的正突变效应却大于负突变效应。虽然通过降低Y射线的辐照剂量，来提供正突变率，但是仍然不能改变，用Y射线辐照产生的正突变小于负突变这个事实。紫外线+LiCl的复合诱变处理效果明显好于单一紫外线的处理。复合诱变不仅提高了菌体的总突变率，而且还提高了正变率和正变幅度。并且从表l可以看到，随着紫外线照射的延长，虽然菌体存活率下降，但是总突变率提高，且正突变率大于负突变率。2.3筛选谱系在诱变选育实验的基础上，通过初筛和复筛得到所需要的产漆酶的高产菌株。图8为整个诱变过程中的诱变筛选图谱。在图谱中所用的字母如A、B17等为诱变的次序，字母后的数字为菌株的编号，括号内的数字为该菌株在发酵过程中每毫升发酵液中的酶活单位。通过各种诱变手段最终得到几株漆酶的高产菌株。本发明对高产菌株YS-L613的遗产稳定性以及摇瓶发酵条件进行研究，目的是确定YS-L613菌株是否适宜工业化生产漆酶。2.4高产菌株的遗产稳定性考察在工业生产中所用到的菌株，必须具备较稳定的遗产特性。通过选育得到的L613菌株，为了考察它是否具有较好的遗产稳定性，通过对该菌株传代分离纯化检测漆酶的酶活性是否保持在一个较为稳定的水平；其实验流程图和实验结果见图9和表2，从流程图9和实验结果上本发明可以看出，YS-L613很好的保持了较高的稳定产酶能力，摇瓶发酵，产酶水平基本维持在31900U/L左右。表2高漆酶产生菌YS-L613传代结果菌株YS-L613FlF2F3F4F5F6漆酶酶活(U/L)3189831817319213179331879319242.5l吨发酵罐试验将突变株YS-L613菌株茄子瓶斜面2-3瓶，稀释成菌悬浮液接入lm3发酵罐进行中试发酵实验，罐内装料体积0.6r^温度为30土rC，通风量30-90mVhr，罐压0.06-0.08mpa，pH值8.3-8.8,连续发酵5批，结果如表3。表3:11113中试发酵罐实验结果序号罐号消后pH消后DE值放罐DE值放罐pH放罐酶发酵周(mg/ml)(mg/ml)活(u/L)期(hr)1皿8.40.420.276.1631249421038.30.400.255.7596378731048.50.380.206.5615979041068.40.350.195.6593938551028.50.400.236.4698159318以上结果表明选育的YS-L613菌株能够用于中试工业生产，产酶性能稳定。2.6工业生产(35吨发酵罐进行工业化试生产)将培养成熟的YS-L613茄子瓶斜面菌株，制成菌悬液，用接种钢瓶接入装有0.71113种子发酵培养基的lm3种子发酵罐培养，温度30土rC，罐压0.06-0.08mpa(表)，通风量30-90mVhr，培养约30hr接入35n^大发酵罐(装料系数70%)，温度控制在30±1°C，罐压0.06-0.08mpa(表)，通风量400-1000mVhr，pH值8.3-8.8，于53，pH低于8.3时通氨，高于8.8时加时酸回调至8.8，当DE下降至0.4时补料,补料要少补、勤补。连续试验时8批次,发酵试验结果如表4。表4:连续8批次发酵试验结果序号罐号消后消后DE首次通放罐DE放罐放罐酶活发酵周pH值氨时间值pH(u/L)期(hr)(mg/ml(hr)(mg/ml))13038.30.61100.158.5798429623048.50.62120.138.58329710033058.60.57110.188.49824010543088.70.54130.208.39463110953078.50.55130.198.28945310263068.40.60110.118.410428411073038.60.61120.138.59127610783028.70.58100.208.681757102平均0.5850.168.4290322.5103.88以上结果表明通过对发酵过程的控制，采用适时限量补料，调控pH值的办法，使YS-L613菌株在深层液体发酵中产酶能力有极大提高。8批次35罐吨生产平均产酶90322.5U/L，最高罐产酶104284U/L，可以实现工业化生产，并为工19业化生产提供了可靠依据。3.结论以白腐真菌为出发菌株,采用以UV、6°C0、紫外线、亚硝基胍、离子注入与微波处理相结合的复合诱变育种技术，选育出漆酶高产菌株YS-L613，产酶水平较出发菌株提高85.6y。倍，达到31898u/L，并经中试，工业生产试验,其中5批次中试平均产酶62713u/L，35吨罐8批次平均产酶90322.5U/L，产酶性能稳定不易退化。本发明是将微波诱变、离子束注入和常规诱变技术相结合应用于漆酶高产菌株选育并进行大胆尝试，离子束、微波诱变作为新兴的微生物育种技术,在世界各地己广泛进行,并有一定成果，但它们与传统诱变剂进行复合诱变处理在国内并不多见。在传统工业微生物诱变育种工作中，单因子诱变筛选突变株效果不理想，本发明通过多因子不同剂量复合诱变和微波、离子束注入诱变处理相结合诱变方法,可有效改善菌株对诱变剂的敏感性，提高变异率，逐步提高突变株的产酶水平，达到诱变筛选的最终目的。2、漆酶生产工艺技术路线的确定在国内酶制剂的工业化生产中，一般有固态发酵法和液体深层发酵法之分法之分。固态发酵法又称曲法培养，往往是混杂有其它杂菌菌株混合发酵，不能达到纯种发酵，酶分离提纯难度大，发酵提取易感染杂菌，劳动强度大，难于对工艺参数进行合理控制，只能生产工业用酶，而液体深层发酵法机械化程度高，发酵条件易控制(部分发酵罐实现自动化控制)，而且酶的产率高、质量好，可达到生产要求。本发明按照液体发酵法的条件和要求,本发明筛选出了适合液体发酵的生产菌株(见第一部分)和配套的发酵提取工艺技术。在发酵工艺技术中，本发明选用了二级发酵，菌体悬浮液直接接种和采用稀醪发酵，适时限量补料，控制pH值的办法作为研究对象；在提取工艺上，以板框过滤,超滤膜浓縮为基础，增加二滤和精滤技术，以确保产品质量符合国家要求。3、漆酶生产工艺流程漆酶生产工艺流程见图IO。204、发酵工艺条件对产酶结果影响研究酶是由活细胞产生的一类具有高度催化活性的特殊蛋白质。酶的发酵技术是以优良菌株为基础,通过适当的方法进行扩大繁殖和酶的大量积累的过程。微生物产酶的发酵是一个十分复杂的过程,既有菌体的生长，又有产酶的分泌过程，影响因素诸多，各种因素之间相互影响，相互制约。选择优良的菌株和恰当的产酶条件对酶制剂生产来说已显得十分重要。为使菌体极大限度地产酶,本发明在对漆酶产酶条件研究基础上，重点选取产酶主要影响因素进行重点讨论，主要因素有接种量与接种方式，浓醪发酵与稀醪发酵，补料与不补料，PH控制与不控制等四个方面。其试验结果如下表5。表5发酵工艺条件对产酶影响试验结果ABCD消后pH8.38.55.68.7消后DE(mg/ml)0.480.750.550.62发酵酶活(u/L)73214827949191299824放罐pH8.48.38.58.4放罐DE(mg/ml)0.26.0.190.180.16首次通氨时间(hr)3335359发酵周期(hr)861059590工业参数控制温度30±1'C罐压0.06-0.08Mpa通风量400—1000mVhrPh8.3-8.8备注稀醪发酵稀醪发酵稀醪发酵稀醪发酵不补料，不补料，适时限量补料，适时限量补控制调节pH控制调节pH控制pH料，菌悬液接种菌悬液接种菌悬液接种控制pH值二级发酵21从表5可以看出(1)法方A:直接利用稀醪发酵，未进行补料，控制pH值范围，周期86hr，但产酶相对较低,与中试不控制pH相比产酶有了提高。(2)法方B:在保持C/N不比变情况下，增加C源和N源的实际投料置，产酶平均82794U/L，较A法提高高酶活力139&,但105hr的发酵周期太长，经效益不入晳n异o(3)方法C:在A法基础上应用补料工艺，产酶有一定提高，较B方法提高1W。，大发酵周期也较长达95hr。(4)方法D:在C方法基础上利用二级发酵菌悬液接种，采用稀醪补料工艺，并控制pH值方法，产酶达99824U/L，较(:法提高9%，较C法縮短同期5hr，单位时间产酶效果较明显。通过对发酵过程的动态分析和上述试验，本发明得出如下经验结论(1)本发明在试验中利用二级发酵，菌悬液接种(接种量2.5-3%)取得了显著效果。这种接种方式周期短、产酶高,是因为接种量大,菌体很快迸入对数生长产酶期，从第一次通氨时间也可说明菌体生长情况。菌悬液接种第一次通氨时间为9小时。(2)中间补料能延长发酵产物的分泌期，推迟菌种的自溶期，保持较高的发酵产物增长幅度，并增加发酵体积，使单罐产量大幅度上升。漆酶发酵过程中的补料既包括营养物质C、N源的补入，也包括无机盐(氨水、硫酸)的补入。氨水、硫酸的补入在于维持pH稳定在8.3-8.8之间，以利于菌株产酶。营养物质的补入在于及时补充菌体代谢活动和合成酶所需的C/N源及合适C/N比例。补料要根据菌体生长代谢规律和产酶合成途径,采取少补、勤补的原则,一般DE值低于O.4时补料时较为合适。补入量一般确保DE值达到O.5为宜，从补料结果看，补料与不补料相比，可以调酶活力33%，时适限量补料对漆酶生产来说十分重要。(3)采用稀醪低浓度发酵更有利于菌体生长产酶，可避免原料中营养物质降解过量而引起分解代谢阻遇，有利于pH值控制,延长产酶期，提高产量。从22表5中可知，A方法86hr酶产73214U/L，而方法B，105hr产酶82794U/L,浓醪发酵比稀醪发酵单位时间产酶率低,周期长。5.提取浓縮工艺技术研究生产工业用酶制剂，不仅菌种要严格控制，而且要选好原料，防止有害物质的污染，还要选择合适的提取工艺，这对生产符合国家酶制剂标准的要求，安全的酶制剂是十分必要的。本发明不但选育了适合生产的安全菌株，而且对提取工艺做了详细研究,在充分分析了国内其它酶制剂产品生产工艺利弊前提下，结合漆酶的实际情况，在提取工艺上增加二滤和相关工艺，充分保证成品酶制剂中不含发酵液残渣，实现工业漆酶的生产。5.1二滤设备的选择及二滤工艺液体酶的生产，本发明需要的是滤液。因此,滤液的清浊直接影响液体酶品质及超滤设备的使用。发酵成热醪液打入回收罐后，加入0.2%的苯甲酸钠抑菌剂，防止提纯过程中杂菌生长，然后直接进入大板框过滤机进行过滤(简称粗滤或一滤)。在粗滤过程中，往往由于设备原因及人为原因造成浑液少量误流入清液中，不但达不到分离的效果，而且影响产品的质量，影响后续工艺超过滤膜通透性及使用寿命。为此,在工艺制定中增加二滤设备，并连接了相关管道。二滤板框过滤机采用浙江杭洲兴源板框过滤机厂生产的XAG20/80uk(型过滤面积20m2)，滤液经二滤后进入超滤膜过滤。5.2超滤浓縮工艺研究.超滤浓縮工艺是液体酶制剂生产中的一个关键工序，发挥着重要作用。超滤的工作原理是在一定压力作用下，把大分子溶质阻留在膜的一侧(留在原来溶液中)，而小分子溶质透过至膜的另一侧，从而达到分离纯化，浓縮的目的。漆酶超滤浓縮结果见表6(漆酶提取工艺试验结果)。按照酶的传统生产方法，超滤浓縮后可直接加入防腐剂进行标准化处理和包装入库，该方法生产的酶制剂成品酶活力符合标准要求。表6漆酶提纯试验结果罐酶活(u/L)放罐体(m3)浓縮后酶活浓縮后体积(m3)产品回收率％23(u/L)832972510697391.46759824025.512024581.507294631269582631.9074894532410102921.537210428424.511442451.63736本发明的漆酶在造纸工业中的应用1)漆酶在纸浆漂白中的应用漆酶是一种含铜的酶蛋白，它的氧化还原势较低，只能氧化降解酚型的木素结构单元，而不能氧化降解在植物纤维木素结构中占主要的非酚型单元。漆酶/HBT与氧脱木素的桉木硫酸盐浆作用，接着进行碱抽提，卡伯值由10.5降至6.6，若漆酶与木聚糖酶共用，卡伯值降至5.9。采用L(E0)LQ(P0)流程，纸浆可以漂至89呢IS0的白度，而撕裂强度与D(EO)DD漂白浆相同。表72为含酶漂白的几种流程的漂白结果。表7为酶漂白的几种流程的漂白结果<table>tableseeoriginaldocumentpage24</column></row><table>上述试验结果表明，LMS在合适的介体和处理条件下，有显著的脱木素和漂白作用。卡伯值较低的松木和桉木硫酸盐浆，经漆酶/介体漂段和碱抽提，再经过氧化氢或压力过氧化氢漂段，可达到85y。ISO以上的白度。2)漆酶在纤维改性方面的应用漆酶能活化木素改进纸浆湿强度特性，选用的浆料为高得率未漂硫酸盐桨。由于这种纸浆含有较多的木素，为漆酶催化木素氧化、促进纤维间交联提供了可能。采用2种试验途径(l)在富含木素的抽出液中，用漆酶氧化未漂硫酸盐浆；(2)应用漆酶LMS.介体系统氧化未漂硫酸盐浆。其结果如表8所示。表8经漆酶和介体氧化的未漂硫酸盐浆的干湿抗张强度湿抗张强度千抗张强度介j本种类紧度/gnr3N,mg-iN.nig4S=0.12S=0.12空白*0.6922.473.84PFT0.6834.571.6MS0.6923.472,5NHAO.柳2.570,8ABTS0.6704.9议0HBT0.6852.371.6注用漆酶处理，漆酶用量为30U/g，介体浓度为25umol/L从上述结果中可以看出，经漆酶和PPT、MS、ABTS等介体处理后试样的湿强度明显提高。漆酶催化木质纤维中的木素或氧化溶于液相中的木素，生成酚氧自由基，发生自由基聚合反应，MartinLund认为自由基聚合的木素包围着纸中纤维，其作用相当于纸张湿强剂。各种可以提高纸张湿强度的高分子，其作用原理就是在纤维间形成交联网，该网可以阻止纤维润胀，保护氢键不被破坏，在未漂硫酸盐浆中加入富含木素的抽提液，其湿抗张强度增加幅度最大。3)漆酶在纸浆脱墨中的应用目前我国制浆造纸工业面临着原料短缺、污染严重和能源紧张等问题，脱墨废纸浆作为一种二次纤维用于造纸生产，不但可以减轻环境污染，节约能源，更可以部分解决我国森林资源贫乏、纸浆紧缺的问题。与传统的化学法脱墨相比，酶法脱墨能降低能耗，减轻环境污染，脱墨效率高。目前用于脱墨研究的酶制剂有脂肪酶、果胶酶、淀粉酶、半纤维素酶、纤维素酶和漆25酶等。废纸的纤维素酶和半纤维素酶酶法脱墨已实现工业化。漆酶可以通过氧化降解纸浆表面的木素来达到脱除油墨的目的，这对于旧报纸浆脱墨很有优势。最后所应说明的是以上实施例仅用以说明，而非限制本发明的技术方案，尽管参照上述实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解依然可以对本发明进行修改或者等同替换，而不脱离本发明的精神和范围的任何修改或局部替换，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。2权利要求1、一种白腐真菌(TrametesVersicolor)YS-L613，其特征在于其由以下方法诱变选育而制得，以白腐真菌为出发菌株，采用以UV、60CO、紫外线、亚硝基胍、离子注入与微波处理相结合的复合诱变育种技术，选育出漆酶高产菌株YS-L613。2、一种如权利要求l所述的白腐真菌(TrametesVersicolor)YS-L613的诱变选育方法，其特征在于以白腐真菌为出发菌株，采用以UV、6°C0、紫外线、亚硝基胍、离子注入与微波处理相结合的复合诱变育种技术，选育出漆酶高产菌株YS-L613。3、根据权利要求2所述的白腐真菌(TrametesVersicolor)YS-L613的诱变选育方法，其特征在于具体方法包括以下步骤(1)出发菌种，以白腐真菌YS菌株为出发菌种，4'C保藏于CPDA斜面；(2)培养基①斜面培养基(CPDA)为每20。/。土豆汁1000mL中含葡萄糖15—25g、MgS047H201—2g、KH2P042—4g、VB11—3mg、琼脂粉13一16g;②摇瓶液体发酵培养基每1000mL发酵培养基中含有葡萄糖15—25g、天冬酰胺2—3g、MgS047H200.1—lg、FeS047H208—12mg、MnS044H200.1—lmg、ZnS047H200.1—lmg、CuS045H201—3mg、NaHP04H2090—llOmg、KH2P040.1—lg、CaCl28—12mg、VB148—52mg、KraftLignin(碱溶木素)0.1—lg;③液体种子培养基葡萄糖1一3%、MgS04'7H200.1—1°/。、KH2P040.1—0.5%、VB12X1(T4%、土豆汁20%、其余为水；发酵培养基(g/L):玉米淀粉25—35g(酶解)、天冬酰胺2—3g、MgS047H200.1—lg、FeS047H208—12mg、MnS044H200.5—lmg、ZnS04'7H2O0.5—lmg、CuS04*5H201—3mg、NaHP04*H20%—llOmg、KH2P040.5—lg、CaCl28—12mg、VB150mg、KraftLignin(碱溶木素)0.5—lg，pH8.5;(3)种瓶制备:取保藏的真菌斜面进行活化培养，挑取适量菌丝块于250mL的三角瓶中(内装50mL液体培养基)，于30'C,150r/min，振荡培养3d;发酵培养将种瓶培养物匀浆后接入发酵瓶，于3(TC，150r/min，培养5天；(4)菌悬液的制备将培养4一5d斜面菌种，有无菌的生理盐水洗下菌丝体，经玻璃珠打散，制成含菌体106-108的悬液；①紫外线诱变取10ml菌悬浮液于直径为9cm的平皿中，磁力搅拌，于20W紫外线灯15—20cm处，照射l一10min;②亚硝基胍(NTG)诱变用pH6.0、0.2mol/L磷酸盐缓冲液制成的菌悬液于同样的磷酸盐缓冲液的NTG液等量混合，分别以0.25、0.5、1.0mg/mlNTG浓度，3(TC温度，诱变20min，稀释法终止反应；③6QCoY-射线辐射诱变取10ml菌悬浮液于无菌试管中，分别以8万、IO万、伦琴进行60CoY-射线辐射；O离子束注入诱变处理取纯种斜面加入10mL无菌水洗脱菌丝体，并稀释成一定浓度的菌丝体悬液，取O.lmL菌悬液于无菌空平皿中涂均匀，用无菌风吹干；然后放入离子注入机的靶室进行离子注入，注入完毕后，用无菌水洗脱，稀释涂平皿，等单单菌落生成后，转接于斜面培养基上；微波诱变吸取制得菌悬浮液，注入底部平整的平皿中，每个平皿的菌液为10ml，调整微波炉(格兰仕)功率为700W，脉冲频率为2450Hz，辐照处理20s、40s、60s、80s、100s，其中每辐照10s，要冷却10s，然后适当稀释涂分离平板；(5)突变株分离上述各诱变处理的菌悬液，取O.lml涂布与分离培养基上30。C，培养4一5天(紫外线诱变平板避光培养)，挑取单菌落，培养3—4天备用；(6)筛选，对诱变入后的菌株进行筛选时，突变株酶活力高于对照菌株5%的突变株为正突变，而低于5%的菌株称为负突变，在±5%之间作为未突变菌株。4、根据权利要求3所述的白腐真菌(TrametesVersicolor)YS-L613的诱变选育方法，其特征在于所述步骤(6)的筛选包括初筛和复筛，其中初筛是各诱变处理后，从3(TC培养12小时以上生长的菌落，根据经验有针对性地大量挑取可能与产酶能力有关的形态变异性突变菌株，逐步捉高产酶菌株的定向筛选范围，并传接斜面2—3代确保菌种性能稳定；然后，直接接入发酵瓶，进行培养，每个菌株接到一个发酵瓶，挑取正突变的菌株，选3—10株进行复筛；复筛是将初筛得到的高产酶菌株经斜面活化后，进行摇瓶发酵试验测定酶活力。5、一种利用如权利要求l所述的白腐真菌(TrametesVersicolor)YS-L613生产漆酶的方法，其特征在于包括以下步骤将培养成熟的白腐真菌(TrametesVersicolor)YS-L613茄子瓶斜面菌株，制成菌悬液，接入装有种子发酵培养基的种子发酵罐培养，温度29—3rC，罐压O.06—0.08即a(表)，通风量30—90m7hr，培养约30hr接入35n^大发酵罐(装料系数7090，温度控制在29—31。C，罐压0.06—0.08卿a(表)，通风量400—1000m7hr，pH值8.3—8.8;发酵成热醪液打入回收罐后，加入O.2—0.5%抑菌剂，然后直接进行过滤，滤液经二滤后进入超滤膜过滤，经超滤浓縮后可直接进行标准化处理和包装入库，即制得液体酶制品。6、根据权利要求5所述的利用白腐真菌(TrametesVersicolor)YS-L613生产漆酶的方法，其特征在于所述的液体种子培养基葡萄糖1一3%、MgS04'7H2O0.1—l%、KH2P040.1—0.5%、VB12X10-4%、土豆汁20%，其余为水。7、根据权利要求5所述的利用白腐真菌(TrametesVersicolor)YS-L613生产漆酶的方法，其特征在于所述的发酵培养基为每L中含有玉米淀粉25一35g(酶解)、天冬酰胺2—3g、MgS047H20O.l—lg、FeS047H208—12mg、MnS044H200.5—lmg、ZnS047H200.5—lmg、CuS045H201—3mg、NaHP04*恥90—110mg、KH2P040.5—lg、CaCl28—12mg、VB150mg、KraftLignin(碱溶木素)0.5—lg，pH8.5。8、根据权利要求5所述的利用白腐真菌(TrametesVersicolor)YS-L613生产漆酶的方法，其特征在于所述的抑菌剂优选为苯甲酸钠。9、根据权利要求5所述的利用白腐真菌(TrametesVersicolor)YS-L613生产漆酶的方法，其特征在于所述的二滤工艺采用的为二滤板框过滤机。10、根据权利要求5所述的利用白腐真菌(TrametesVersicolor)YS-L613生产漆酶的方法，其特征在于所述的过滤后的滤渣经干燥后可以用做填充料或饲料。全文摘要本发明涉及一种白腐真菌(TrametesVersicolor)YS-L613及其选育方法和应用，其由以下方法诱变选育而制得，以白腐真菌为出发菌株，采用以UV、⁶⁰CO、紫外线、亚硝基胍、离子注入与微波处理相结合的复合诱变育种技术，选育出漆酶高产菌株YS-L613。本发明通过离子注入、紫外线、诱变剂等物理化学处理方法，进行选育工作，最终筛选得到一种产漆酶较高的菌种YS-L613，并采用小试自动化控制工艺对菌种的发酵控制工艺技术和提取工艺技术，开发出漆酶产品。根据漆酶在纸浆漂白、纤维改性和纸浆脱墨的实验发现，在造纸工业中利用漆酶，能够改善纸章的品质，减少环境污染，节约成本。文档编号C12N1/14GK101469312SQ20071030003公开日2009年7月1日申请日期2007年12月24日优先权日2007年12月24日发明者吴慧霞,左雪梅,常东民,李市场,娜王,王耀民,茹群朵,郭至瑞申请人:河南仰韶生化工程有限公司