具有立体选择性脂肪酶活性的酵母菌及其在生物拆分法制备s-型盐酸倍他洛尔中的应用的制作方法

专利名称：：具有立体选择性脂肪酶活性的酵母菌及其在生物拆分法制备s-型盐酸倍他洛尔中的应用的制作方法
技术领域：
：本发明涉及一株酵母菌及其应用，尤其涉及一株具有立体选择性脂肪酶活的酵母菌及其在生物拆分法制备s-盐酸倍他洛尔中的应用。
背景技术：
：青光眼是一种发病迅速、危害性大、随时导致失明的常见疑难眼病。近年来发病率有所上升，据世界卫生组织统计，目前全球青光眼患者约为6700万，约450万人因青光眼而失去视力，在我国，年龄大于40岁的人群中，原发性青光眼的发病率1%2%，以全国13亿人口计，原发性青光眼患者已超过700万，青光眼己成为我国第二大眼科常见疾病，约占眼科疾病的14.36%。统计数据表明青光眼己成为第二大致盲因素。目前青光眼的临床治疗以手术和药物治疗为主。手术只是暂时降低眼压，对于某些类型的青光眼只能缓解症状，最终还是以失明告终。治疗青光眼药物主要包括拟副交感神经药、拟肾上腺素药、肾上腺素受体阻滞剂、碳酸酐酶抑制剂、高渗脱水剂等。其中首选药物肾上腺素受体阻滞剂如噻吗洛尔、倍他洛尔等，但这些药物容易引起支气管痉挛、心动过缓、增加心脏阻滞、降低血压等副作用，目前国外已不再将其作为首选药物。左旋倍他洛尔是倍他洛尔的左旋体，它对卜受体的亲和性远远高于其消旋体，这种高选择性使其对具有心肺疾病的患者更为安全，它副作用也非常小，且不具有膜稳定(局部麻醉)作用和内源性拟交感胺作用。左旋倍他洛尔对眼纤毛上皮的^受体也有较高的亲和力，可以减少房水的生成而降低眼内压，还可通过阻滞L一电压依赖性钙离子通道保护视神经免受多种伤害。动物实验表明左旋倍他洛尔产生的降低眼内压效应比倍他洛尔要强l-2mmHg，也有报道称左旋倍他洛尔降低眼内压的能力比其右旋体强25.9%左右，其有效期也比外消旋体和右旋体要长得多。眼用倍他洛尔最常见的副作用是有刺激性，通过使用效果相同但浓度减小的眼药水可使这一副作用减至最小。国外己有左旋盐酸倍他洛尔的滴眼剂上市，商品名为"BetopticS"，主要用于治疗慢性开角型青光眼或高眼压病人降低眼内压。RameshA.Joshi研究组于2005年报道了用化学合成法制备S-倍他洛尔的工艺，并申请了几篇与此工艺有关的专利，这些工艺或者需要昂贵的试剂，或者需要昂贵的催化剂。自从微生物转化应用于生产后，一般以化学法与微生物转化相结合来制备手性药物。生物催化拆分反应立体选择性和区域选择性强，反应条件温和，可避免或减少使用强酸、强碱和一些有毒原料，改善操作条件，减少环境污染；可避免使用不对称合成中所必需的昂贵的手性试剂或手性催化剂。生物催化剂生产成本低廉，可大规模生产，生产周期短，不受季节影响，且催化剂可重复利用，进一步降低成本。Gius印peDB等人于1995年报道了化学-酶法制备S-倍他洛尔的方法，他们用于催化手性拆分反应的是一些微生物脂肪酶。其中效果最好的是假单胞菌脂肪酶AK，该反应在特丁基甲基醚介质中反应，反应体系闪点低，易燃，存在安全隐患；酶和底物重量比1:7，催化剂成本很高；他们的光学纯度仅能达到80%(拆分收率50%)，通过对其盐酸盐重结晶才使ee值达到90%。其它微生物酶催化的反应立体选择性要差得多，且酶-催化剂重量比为1:1，催化剂成本更高。另外，他们没有报道酶的稳定性，也没有有关细胞或酶固定化的报道，距离工业化的要求尚远。筛选立体选择性强、催化效率高且稳定性好微生物酶，并在此基础上探索催化成本低的生产s-盐酸倍他洛尔的新工艺并拥有自主知识产权为我国目前制药行业所迫切需求。
发明内容本发明的目的在于提供一种立体选择性强、催化效率高且稳定性好的酵母菌；另一目的在于以该酵母菌为催化剂，提供其在生物拆分法制备S-型盐酸倍他洛尔中的应用。本发明中的酵母菌能产生具有立体选择性的脂肪酶，其特征在于可对手性中心含有酰基的化合物进行对映体拆分。该酵母菌为粘质红酵母菌(Rhodotorulamucilaginosa)DQ832198，已于2007年11月20日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(北京市朝阳区大屯路)，保藏编号CGMCC.No.2257。该酵母菌的筛选包括以下步骤(1)以底物为唯一碳源进行富集培养和平板分离，得到能作用于底物的菌种。(2)通过对转化产物进行TLC和旋光测定，筛选转化产物中含有新化合物并且旋光值为负的菌种。(3)通过鉴定产物的结构最后确定能转化底物为预期产物的菌种。(4)对菌种进行鉴定。本发明从土壤中筛选具有立体选择性脂肪酶活性的酵母菌的具体筛选方法如下首先从不同地方取土样，然后将土样用富集培养基富集培养二次；富集培养液适当稀释后涂布选择性平板培养，将分离良好且有透明圈的菌落挑至斜面；将斜面菌种培养一定时间后加入底物进行转化，然后提取产物进行测定，并对产物的结构进行鉴定。转化产物可用旋光法、薄层色谱法(TLC)和高效液相色谱法(HPLC)进行分析。旋光值于589nm进行测定；TLC测定以硅胶GF254薄层板为固定相，氯仿-甲醇(10:1v/v)为展开剂，碘蒸气为显色剂，采用双波长薄层扫描法进行；HPLC测定条件为以手性Chiralcel0J-H柱为固定相，正己烷-异丙醇(85:15)为流动相，流速1mL/min，检测波长为273nm。产物倍他洛尔的HPLC测定条件为固定相0D-H柱，流动相正乙垸/异丙醇/二乙胺6/4/0.5，流速0.5mL/min,检测波长254nm，进样量20uL。转化产物的ee值通过样品HPLC图谱上两个异构体的峰面积来计算，公式为ees(%)=(峰面积s-峰面积R)/(峰面积s+峰面积R)*100。对于具有立体选择性的酶，立体选择性是一个重要的技术指标，这一指标用E值表示，E值越大，菌种的立体选择性越好。E=ln[(l-c)(l-ees)]/ln[(l-c)(l+ees)]=ln[l-c(l+ee》]/ln[l-c(l-eep)]，其中eeP=([P]-[Q])/([P]+[Q]),ees=([B]-[A])/([B]+[A])，c=ees/(ees+eep)。A、B分别为底物的两种对映体；P、Q分别为产物的两种对映体。产物结构用MS、核磁法进行鉴定。根据转化产物的旋光值和薄层结果来确定菌种的转化能力。优良菌种的转化产物应该具有负的绝对值较大的比旋光值、薄层结果应证实其产生了不同于底物的新物质，MS结果应证明其产生的新物质是底物脱去乙酰基产生的，其ee值也要较高，整个反应的E值也要较高。对具有上述性质的转化产物进行分离，得到纯的脱乙酰产物，并通过陋R来确定其结构。通过对菌落形态、菌体细胞形状和大小、有无孢子和菌丝形成以及繁殖方式的观察对菌种进行初步鉴定。经过对该菌株16SDNA的分析，进行菌种的确定。确定其为粘质红酵母(Rhodotorulamucilaginosa)DQ832198,保藏编号CGMCC.No.2257。可以用海藻酸钠-活性碳-聚乙烯醇对筛选的菌株进行固定化，以此固定化细胞作为催化剂进行生物转化，固定化细胞可重复利用。本发明制备S-盐酸倍他洛尔中间体的生物转化方法，包括以下步骤(1)产酶菌株的培养。(2)结合本研究开发的化学方法合成化合物(l)。(3)以化合物(l)为转化底物。(4)将底物加入酵母培养液中进行转化得到中间产物。(5)由得到的中间产物结合本研究室开发的工艺合成S-盐酸倍他洛尔。在步骤(4)中，可以用静息细胞进行转化，也可以用固定化细胞进行转化。以下是本发明的详细描述。1、底物的制备化合物(l)的制备a:K2C02，CH3CN，C3H50Cl，b:CH30H，C3H7NH2c:Et3N，DMAP，(CH:iC0)20EtOAc取一定量对羟基苯乙醇，加入适量乙腈使其完全溶解，加入环氧氯丙烷和无水碳酸钾，75'C油浴，回流反应6h，冷却，抽滤除去K2C03并用丙酮洗涤沉淀几次，合并滤液，减压蒸馏至基本干燥，并用石油醚重结晶后得到醚化产物1,4-(2,3环氧丙氧基)苯乙醇。将一定量醚化产物溶于甲醇中，边搅拌边缓慢加入异丙胺，于室温下反应7h，至薄层检测反应完全。减压蒸馏除去溶剂和残余异丙胺；再用氯仿溶解，用饱和NaHC03和饱和食盐水萃取，将有机相蒸干，即得胺化产物4-[2-羟基-3-[(甲基乙基)氨基]丙氧基苯乙醇。取一定量胺化产物，用适量乙酸乙酯溶解，加入醋酐(按原料三倍当量加入)，以DMAP为催化剂，在无水吡啶和醋酸酐中对产物进行乙酰化，室温条件下，0.5h反应完全，加适量水以停止反应，用饱和NaHC03萃取有机相三次，饱和NaCl溶液萃取三次，然后用无水Na2S04干燥。即得到微生物转化的底物(化合物l)。2、固定化细胞的制备现有文献报道了用海藻酸钠、海藻酸铝、卡拉胶、卡拉胶-明胶、明胶-戊二醛制备固定化细胞。本发明用海藻酸钠(CA)-活性炭(C)复合凝胶制备固定化细胞，方法如下将一定量的海藻酸钠(15%)、蒸馏水及活性炭(05%)—起加热煮沸，冷却到室温；将一定量的本发明筛选出的菌株加入到上述配置好的PVA混合物中搅拌均匀；用注射器将其匀速滴入110%硼砂和氯化钙混合液中(混合并充分搅拌成乳状)，过滤，洗净，即得均匀固定化细胞小珠。聚乙烯亚胺(PEI)强化处理方法如下配制0.1%5%的聚乙烯亚胺溶液，加入1050mmol/L氯化钙，调pH值至510，加入等量CA-C或PVA-CA-C包埋颗粒，震荡1048h。取出用无菌水洗涤，再用戊二醛处理1060min，用无菌水洗净。3、生物转化反应将本发明菌体接种于培养基(玉米浆0.55%、蛋白胨0.15%、甘油0.55%,初始pH410)中，于20。C50。C培养1248h，然后加入底物(1)0.512g/L，再于20。C5(TC转化545h。转化产物用HPLC法测定转化率和产物ee值。除在菌体培养液中加入底物直接转化外，也可将微生物细胞过滤出来后，加入pH410的缓冲溶液，利用静息细胞进行转化。利用静息细胞转化时可以在转化体系中可以加入氯仿、正乙烷或甲苯以提高转化速度。用固定化细胞在填充床反应器中进行转化将固定化细胞装入ci)1050X100500的反应柱，通过恒温箱205(TC保温。进行连续转化反应时，在填充床反应器中填充固定化细胞凝胶50500g，底物浓度为110g/L，底物溶液由反应柱上部流入，反应后的转化液从反应器下部收集。在此条件下转化的产物用HPLC法测定转化率和产物ee值。4、S-型盐酸倍他洛尔的合成在转化产物中加入适量的甲醇和过量的氢氧化钠，反应550分钟。然后除去甲醇，用乙酸乙酯萃取水相得到脱乙酰化产物。在脱乙酰化产物中加入甲苯、苯甲醛和对甲苯磺酸，充入氩气，油浴下回流。冷却后用水洗涤，将有机层用硫酸钠干燥，在减压下蒸去甲苯得氨基乙醇衍生物。将氨基乙醇衍生物溶于无水DMF中，加入NaH，常温下反应130分钟。加入溴甲基环丙垸后于0°C-5CTC反应110h，然后在常温下反应15h。把反应液倒入适量的碳酸氢钠饱和溶液中，除去NaOH再用氯仿萃取。减压蒸馏除去氯仿得到S-倍他洛尔。将S-倍他洛尔用适量异丙醇溶解，滴加两倍当量的浓盐酸，减压蒸馏除去异丙醇，用饱和碳酸氢钠溶液洗涤产物，用氯仿洗涤水层(3*20ml),减压下蒸馏除去氯仿，得到淡黄色液体，再用石油醚-丙酮混合体系进行重结晶，即得s-型盐酸倍他洛尔。本发明优点在于1、本发明提供了一种具有立体选择性脂肪酶活性的酵母菌，利用该菌种进行倍他洛尔等e-受体阻滞剂、盐酸麻黄碱、肾上腺素、左羟丙哌嗪、硫酸沙丁胺醇、卡普托利、佐芬普利等在手性中心含有酰基的化合物的手性拆分，对推动我国手性药物开发的进程有重要的应用价值；2、就合成工艺而言相对化学法来说，以具有立体选择性脂肪酶活性的酵母菌为催化剂生产s-型盐酸倍他洛尔，生物催化剂价格低廉、生产转化反应条件温和，环境友好并且生物转化反应速度快、立体选择性好，具有较好的应用前景。图l本发明工艺路线图图220tt菌株转化产物的HPLC图谱；图327It菌株转化产物的HPLC图谱；图4外消旋倍他洛尔的HPLC图谱；图5S-倍他洛尔产品的HPLC图谱。具体实施方式为对本发明进行更好地说明，举实施例如下。实施例1从郑州市区饭店、油厂附近采集到15个被油脂污染的土样，称取各种土样种10g，分别悬浮于0.9%NaCl溶液中，用8层纱布过滤除去较大的杂质颗粒，接种富集培养基((NH4)2S040,2%;K2HP040.2%;NaCl0.05%;MgS(WH200.05%;底物3%;pH自然)，培养71h后取10mL培养液再用同样方法再富集二次。涂布选择性平板(组成同富集培养其含琼脂2%)。经过初筛得到52个能在以底物为唯一碳源的平板上生长，且产生透明圈的菌株，将其挑出转接LB培养基(酵母膏0.5%，蛋白胨1%，NaCl1%，琼脂2%，pH7.5)制成的斜面保藏，并用于转化试验。分别将上述初筛所得52个菌株接种至转化培养基(酵母浸膏0.2%，蛋白胨0.5%，葡萄糖1%，pH自然)中，培养24h后加入底物(浓度0.3%0.7%),再转化培养48h，提取产物进行TLC及旋光测定。结合文献选取转化产物旋光值为负值且绝对值较大，TLC结果表明有新产物生成的13个菌株进行复筛，复筛结果如表l。表l菌种复筛TLC及旋光结果<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>TLC结果有产物的以+记，没有产物的以-计。本试验中底物l在微生物酶的催化下发生不对称水解，有立体选择性酶活性的菌种水解底物所产生的产物具有旋光性，产物旋光值为负值且绝对值较大的菌种是本发明所需要的。由表1可知菌株20#和27#符合本发明要求。转化结束后提取产物通过硅胶柱分离纯化，然后将产物的各组分通过NMR和MS对其结构进行确定。结果表明菌株20#和27#转化底物生成的两种产物(2)和(3)的有关数据如下。产物(2)的氢谱数据如下-7.14，6.8(each2H，d,J=8.5Hz,Ar-H);3.82(2H.t,J=6.6Hz,H-1);2.82(2H't,J=6.6Hz，H-2);3,60(1H,dd'J=l.44Hz,J=14.0Hz,H-3');3.33(1H，dd'J=7.5Hz,J=14.OHz，H-32);4.46(1H,Ws'H_4);4.10(1H,dd,H-5');4.03(1H,dd，H-52);3.70(1H,m'H_6);1.26,1.22(each3H,d,J=6.76Hz,J=6.56Hz,CH3*2);2.24(6H,s,-COCH:,)高分辨正离子ESI-MSm/z:338.1958[M+H]+;360.1774[M+Na]+其比旋光值均为负值，由20#菌株转化产物分离所得化合物(2)的比旋光值的[a]/"为-2700(C=l，CH3OH)，由27tt菌株转化产物分离所得化合物(2)的比旋光值的[a]严为-711，由于结构类似化合物的旋光值都是负值，由此得知该化合物为本发明需要的s-型产物。产物(3)的氢谱数据如下7.14,6.80(each2H,d,J=8.5Hz,Ar-H);3.81(2H.t，J=6.6Hz,H-1);2.81(2H,t,J=6.6Hz,H_2);3.60(1H,dd,J=l.44Hz'J=14.OHz,H-31);3.43(1H,dd,J=7.5Hz,J=14.OHz,H-32);4.46(IH，Ws,H-4);4.10(1H,dd,H-5l);4.03(lH,dd'H-52)3.60(lH,m,H—6);1.26'1.21(each3H,d,J=6.76Hz'J=6.56Hz,CH3*2);2.20(3H，s,_C0CH3)高分辨正离子ESI-MSm/z:296.1876[M+H]+:318.1689[M+Na]'。由20tt菌株转化产物分离所得化合物(3)的比旋光值的[a]"为+116,由27#菌株转化产物分离所得化合物(3)的比旋光值的[a]。2"为+285。由刚R和MS结果可知化合物(2)和化合物(3)的结构如下(2)(3)微生物转化产物的结构式两个菌株转化产物的HPLC结果见图2和图3。图2和图3进一步证实了化合物(2)为本发明所需要的S-型产物。用HPLC法测定产物的ee值、转化率并由此计算出E值。2(W菌株的E为10.6，27#菌株的E为5.3。由此可知20共菌株优于27#菌株。最后选择20tt菌株保藏于斜面保藏培养基(葡萄糖1%，蛋白胨0.5%，酵母膏O.2%，琼脂2%)。实施例2通过对菌落形态、菌体形状和大小、有无孢子和菌丝生成以及繁殖方式的观察对菌种进行初步鉴定。结果如下细胞有圆形(5um)和椭圆形(5X6ym)，无孢子，无假菌丝，主要为裂殖，少数为芽殖。该菌株在不同培养基上的形态不同，具体形态如下YEPD(—)培养基菌苔较小，呈粉红色，表面光滑，有光泽，比较湿润，边缘较透明，较整齐，无褶皱，易挑取，呈粘稠状，无味，细胞有圆形(5ym)和椭圆形(5X6"n0。麦芽汁培养基菌苔较小，呈水红色，表面褶皱，无光泽，比较干燥，边缘由于褶皱的影响不太整齐，无孢子，无假菌丝，易挑取，呈粘稠状，无味，细胞圆形偏多(3.5m)。PDA培养基菌苔较大，呈粉红色，表面光滑，有光泽，比较湿润，边缘颜色较浅，稍透明，比较整齐，无孢子，无假菌丝，易挑取，呈粘稠状，无味，细胞椭圆偏多(4.5X6.5um)。豆芽汁培养基菌苔较大，呈粉红色，表面光滑，有光泽，比较湿润，颜色较深并一致，边缘比较整齐，无孢子，无假菌丝，易挑取，呈粘稠状，无味，细胞椭圆形偏多(2X33X4nm)。对该菌株16SDNA的分析结果表明其16SDNA有320个碱基对，该菌株的基因与粘质红酵母(Rhodotorulamucilaginosa)完全一致，经基因库检索该菌株为粘质红酵母(Rhodotorulamucilaginosa)DQ832198,保藏编号CGMCC.No.2257。实施例3将保藏的菌种CGMCC.No.2257接入培养基(玉米浆2%、蛋白胨0.5%、甘油2%，初始pH6)中，250mL三角瓶装110mL(即45%)，于32。C培养16h后加入1g底物(1),28'C转化12h。反应液用等体积的乙酸乙酯萃取发酵液三次，将乙酸乙酯相用饱和NaHC03洗三次、饱和NaCl溶液洗三次，再用蒸馏水洗一次，饱和NaHC03相和饱和NaCl相用乙酸乙酯反萃一次，合并有机相，并用无水N&S04干燥，得产物(2)0.42g，产率47.5%,产物ee值为95%。产物(3)0.58g，产率68%。其中产物(2)为我们的目的产物，由产物(2)按前面所述方法制备S-盐酸倍他洛尔，其ee值为95%，比旋光度达到[a],为-19.7(C=l,CH,0H)。外消旋倍他洛尔和S-倍他洛尔的HPLC图谱如图3和图4。HPLC图谱可以进一步证明产物的左旋构型。实施例4在实施例3中本发明的保藏菌种培养后经过滤得到菌体，将菌体用PH=6的磷酸缓冲液冲洗三次，然后在相同的缓冲液中按实施例3中条件进行转化，结果与实例3相似，优点是转化产物更容易萃取且细胞可重复利用，用同一批细胞转化9次，细胞的转化能力未见下降，表明该菌体中的酶稳定性良好。实施例5将pH6的磷酸缓冲液分装灭菌，冷却后加入3g/L底物，然后加入不同量的甲苯，把已离心的细胞平均分至各瓶，于28'C，210r/min进行转化。当反应体系中不加入有机溶剂时细胞转化的速度很慢，最高速率为0.3mirf1，所需产物在反应6h的最高转化率为45%。反应体系中加入甲苯后，细胞的通透性得到改变，酶与底物可以充分接触，使底物的转化率得到提高。加入甲苯在反应1h时的产物转化率达到最大值66%，最高速率为0.65mirf1。反应体系中加入不同量甲苯转化0.5h后的结果表明，反应体系中加入15%甲苯时转化速度最高。转化反应的立体选择性指标E值与水相中基本相同。实施例6在实施例5用氯仿代替甲苯，其它条件相同。反应体系中加入氯仿后，也增加了细胞的通透性，但效果没有甲苯明显，最高速率为0.12mirf1，反应3h产物转化率达到最大值55%，以后随时间变化不明显。转化反应的立体选择性指标E值与在水相中基本相同。实施例7在实施例5用正己烷代替甲苯，其它条件相同。反应体系中加入正己烷后，也增加了细胞的通透性，但效果没有甲苯明显，反应3h时几乎达到最高，最高速率为0.08min—'，产物转化率达61%，以后随时间变化不明显。转化反应的立体选择性指标E值与在水相中基本相同。实施例8按前面所述方法用不同材料制备的固定化细胞机械强度如表2和表3。表2.不同固定化细胞的耐压性能固定化方法CA海藻酸铝卡拉胶明胶卡拉胶-明胶PVA-CAPVA-CA-C机械强度(g/)16.615.265.754.26012035.1注表中数据由砝码加压法测定表3.不同固定化细胞的耐振荡性能包埋方法卡拉明卡拉-胶名CA海藻酸PVA-兩-CA-胶胶胶铝CAC颗粒保持完好时间0.50,40.61.00.21.21.0(h)由上表可知由CA、PVA-CA和PVA-CA-活性炭所得颗粒比卡拉胶、明胶和卡拉胶-明胶的机械强度和耐压性都好。活性碳的用量对包埋颗粒的通透性存在一定的影响，结果见表4。表4.活性炭对包埋颗粒通透性和机械强度的影响活性炭(％)00.512转化时间1211.51110注包埋材料中含PVA10%,CA2%,转化时间为转化率达到50%所需时间。可见加入活性炭使反应速率提高，但随着活性炭的增加颗粒的机械强度逐步减小，故活性炭的用量也不能太多，可选择0.5%。但经上述方法固定化的细胞经磷酸缓冲液浸泡后，颗粒机械强度明显下降，加入底物转化一刻钟后颗粒全部溶化，说明这些颗粒不耐磷酸缓冲溶液。经聚乙烯亚胺处理后，经CA-C和CA-PVA-C固定化的细胞耐磷酸缓冲溶液的性能均大大提高。经CA-PVA-C固定化的细胞机械强度变化不大，且由于PVA通透性特别差，其转化速率特别慢。经CA-C固定化的细胞机械强度有明显的提高，用0.6%PEI的强化的固定化颗粒转化效果最好，基本上与游离的细胞相当，并且转化后颗粒完好无损。最后选择CA2%、活性炭0.5%固定化细胞，并用0.6%的PEI进行强化处理。固定化细胞在4)50X200mm的填充床反应器通过恒温箱28'C保温进行连续转化反应，在填充床反应器中填充固定化细胞凝胶200g，底物浓度3g/L,底物溶液由反应柱上部流入，反应后的转化液从反应器下部收集。当底物浓度为3g/L,停留时间为15h时，底物的转化率为80%，目的产物ee值为〉95%。当停留时间一定时，底物转化率会随着底物(1)浓度的增大而减小，增加底物浓度时，停留时间要相应增加。对体积产率而言，体积产率随着停留时间的延长而减小。在停留时间一定时，增大底物浓度可以提高体积产率，但是若底物浓度过高，底物的转化率很低，底物无法充分利用。在底物浓度为3g/L，停留时间为15h的条件下，该反应器在连续运转40天后仍保持稳定。权利要求1.一株从土壤中筛选的微生物菌种，其特征在于，该菌株为粘质红酵母(Rhodotorulamucilaginosa)DQ832198，能产生立体选择性脂肪酶，经中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏号CGMCC.No.2257。2、如权利要求1所述粘质红酵母CGMCC.No.2257在制备S-型盐酸倍他洛尔中的应用，其特征在于，通过如下步骤(1)将粘质红酵母CGMCC.No.2257在如下条件下进行培养、发酵，获得细胞培养液或湿菌体或固定化细胞，将其作为酶制剂；(a)斜面培养基为葡萄糖0.55%，蛋白胨0.15%，酵母膏0.15%，琼脂2%;(b)种子及发酵培养基为葡萄糖05%,蛋白胨05%，玉米浆15%、蛋白胨0.15%、甘油15%，初始pH510;(c)培养条件为温度205(TC，时间548h，装液量系数1060%;(2)将上述酶制剂接种于组成为玉米浆0.55%、蛋白胨O.15%、甘油0.55%,初始pH410培养基中，于2(TC50。C培养1248h，然后加入4一(2—乙酰氧基一3—(N_(异丙基)一N-乙酰基氨基)丙氧基苯乙醇乙酸酯0.512g/L做为底物，于20'C5(TC转化550h,生成中间转化产物，中间转化产物用HPLC法测定转化率和产物ee值；(3)合成S-型盐酸倍他洛尔在中间转化产物中加入适量的甲醇和过量的氢氧化钠，反应550分钟，然后除去甲醇，用乙酸乙酯萃取水相得到脱乙酰化产物；在脱乙酰化产物中加入甲苯、苯甲醛和对甲苯磺酸，充入氩气，油浴下回流，冷却后用水洗涤，将有机层用硫酸钠干燥，在减压下蒸去甲苯得氨基乙醇衍生物；将氨基乙醇衍生物溶于无水DMF中，加入NaH，常温下反应130分钟，加入溴甲基环丙垸后于0'C-5(TC反应110h,然后在常温下反应15h，把反应液倒入适量的碳酸氢钠饱和溶液中，除去Na0H再用氯仿萃取，减压蒸馏除去氯仿得到S-倍他洛尔；将S-倍他洛尔用适量异丙醇溶解，滴加两倍当量的浓盐酸，减压蒸馏除去异丙醇，用饱和碳酸氢钠溶液洗涤产物，用氯仿洗涤水层，减压下蒸馏除去氯仿，得到淡黄色液体，再用石油醚-丙酮混合体系进行重结晶，即得S-型盐酸倍他洛尔。3、根据权利要求2所述方法，其特征在于步骤(l)中所述固定化细胞用海藻酸钠、聚乙烯醇和活性碳进行固定化，并用聚乙烯亚胺进行强化处理，海藻酸钠用量15%、聚乙烯醇用量05%、活性碳用量05%，聚乙烯亚胺浓度0.15%。4、根据权利要求2所述方法，其特征在于步骤(2)中用细胞培养液直接进行转化，底物浓度为l10g/L，转化温度为2050°C，转化时间为550h。5、根据权利要求4所述方法，其特征在于在转化体系中加入甲苯、正己垸、氯仿有机溶剂以提高转化速度，有机溶剂加入量为110%。6、根据权利要求2所述方法，其特征在于步骤(2)中用静息细胞在pH510的缓冲液中进行转化，缓冲体系为Na2HP(V柠檬酸、Na2HP04-KH2P04、Na2HP04-NaH2P04、K2HP04-KH2P04，底物浓度为l10g/L，转化温度为205(TC，转化时间为550h。7、根据权利要求2所述方法，其特征在于步骤(2)中固定化细胞用在填充床反应器中进行转化，填充床反应器尺寸为cpl050x100500mm，通过恒温箱2CTC5(TC保温；底物浓度110g/L，底物溶液由反应柱上部或下部流入，反应后的转化液从反应器另一端收集。8、如权利要求1所述粘质红酵母CGMCC.No.2257在手性化合物拆分中的应用，其特征在于，利用该微生物进行手性中心含有酰基、羟基类化合物的手性拆分。9、如权利要求8所述粘质红酵母CGMCC.No.2257在手性化合物拆分中的应用，其特征在于，所述的手性中心含有酰基、羟基类化合物为卩-受体阻滞剂、盐酸麻黄碱、肾上腺素、左羟丙哌嗪、硫酸沙丁胺醇、卡普托利、佐芬普利。10、如权利要求1所述粘质红酵母CGMCC.No.2257在化合物上进行添加或脱去酰基反应中的应用，其特征在于，利用该微生物在化合物上进行添加或脱去酰基。全文摘要本发明公开了一株具有立体选择性脂肪酶活性的酵母菌及其在生物拆分法制备S-型盐酸倍他洛尔中的应用。该方法从土壤中筛选到一株具有立体选择性脂肪酶活性的酵母菌，并利用其湿菌体或用海藻酸钠-活性碳-聚乙烯亚胺固定化所得固定化细胞作为酶制剂，对含有酰基的底物进行对映体拆分，制备出S-型盐酸倍他洛尔。转化方法简便、成本低廉，立体选择性较好。利用该菌种可对倍他洛尔等β-受体阻滞剂、盐酸麻黄碱、肾上腺素、左羟丙哌嗪、硫酸沙丁胺醇、卡普托利、佐芬普利等手性中心含有羟基或酰基的化合物进行手性拆分，对推动我国手性药物的开发进程有着重要的应用价值。文档编号C12N1/16GK101220336SQ20071030006公开日2008年7月16日申请日期2007年12月25日优先权日2007年12月25日发明者于梅艳,刘宏民,李永红,瑞王申请人:郑州大学