一株高产耐酸性高温α-淀粉酶的菌株及其液体发酵方法
【技术领域】：
[0001] 本发明属于生物工程技术领域，具体设及一株高产高溫淀粉酶的菌株及其液体发 酵方法。
【背景技术】：
[0002] a-淀粉酶是工业生产中应用最广泛的酶制剂之一，国内市场常用的淀粉酶一般 为中溫a-淀粉酶和耐高溫a-淀粉酶，其适用抑在6-7之间，大部分存在热稳定性差和 抑范围窄的缺陷，对酸性条件下的淀粉深加工工艺存在局限性。
[0003] 淀粉产品深加工一般包括两个过程：液化及糖化。首先液化需要在105°c条件下 糊化形成淀粉糊，再经淀粉酶液化，之后在50°C-60°C溫度范围内由葡萄糖淀粉酶作用下 糖化；除了作用溫度不同外，在液化和糖化两个过程中所需的两种酶：a-淀粉酶和糖化酶 的作用抑也有显著差异。耐酸性高溫a-淀粉酶可W省去淀粉糊化到液化的冷却过程，减 少大量的能源消耗，提高液化速度，方便从液化到糖化过程的抑调节，简化工序，降低生产 成本。
[0004] 耐酸性高溫a-淀粉酶是在酸性和高溫条件下将淀粉水解的酶类，其在酸性和高 溫条件下具有良好的酶学稳定性，可广泛应用于食品加工、酿酒、纺织等多个行业。 阳0化]中国专利CN102363761A公开了一种产耐高溫a-淀粉酶菌种的优化方法，采用 地衣芽抱杆菌10181从菌种活化、菌种扩培到发酵提取整个过程进行优化，该菌种所产的 耐高溫a-淀粉酶其酶活一般在2500u/ml，耐受溫度为95°C;中国专利CN101838635A公 开了一种耐高溫淀粉酶的制备方法，将地衣芽抱杆菌进行菌种复壮培养、种子培养，经液体 深层发酵而成的耐高溫a-淀粉酶其酶活力高达20000-22000u/ml，耐受溫度高达Iior; 中国专利CN100415879C公开了耐酸耐高溫的a-淀粉酶及其制备方法，用重组DNA技术定 点突变前体a-淀粉酶，从微生物特别是地衣芽抱杆菌中分离前体a-淀粉酶基因，对其 L134及S320的氨基酸残基进行突变，并在大肠杆菌、枯草芽抱杆菌、地衣芽抱杆菌等细菌 中高效表达a-淀粉酶突变体，较适宜在枯草芽抱杆菌中表达，使耐酸pH4. 0-4. 5、且高溫 70-90°C的a-淀粉酶得W高效表达，a-淀粉酶突变体具有良好的酸稳定性，更适于工业 化应用，为耐酸性、耐高溫a-淀粉酶的工业化大生产提供了一条可行途径。
[0006] 如上所述，随着生物技术的发展，会有更多的分离菌、诱变菌、基因工程菌及其组 合会应用到耐高溫a-淀粉酶的生产中来，W满足日益增长的工业化生产需求。
[0007] 为了降低生产成本、拓展作用条件及范围，满足市场需求，需要开发或者优化出一 株产酶活力高、生产稳定性好、适应强的生产菌株。
【发明内容】
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[0008] 本发明的目的是提供一株高产耐酸性高溫a-淀粉酶的菌株及其液体发酵方法。 阳009] 本发明提供的高产耐酸性高溫a-淀粉酶的菌株具体为地衣芽抱杆菌度acillus Iicheni化rmis)突变株M6-X3。该菌株已于2015年5月7日保藏于中国微生物菌种保藏 管理委员会普通微生物中屯、，地址位于北京市朝阳区北辰西路I号院3号，（邮编100101)， 保藏编号为CGMCCNO. 10785。
[0010] 所述地衣芽抱杆菌突变株CGMCCNO. 10785采用地衣芽抱杆菌B307进行常压室溫 等离子体（ART巧诱变选育获得。地衣芽抱杆菌B307的液体发酵酶活最高为1600〇11/111以突 变株M6-X3的液体发酵酶活力可达到2686〇11/111以经发酵条件优化，平均发酵液酶活力可达 到 42470u/mL。
[0011] 地衣芽抱杆菌突变株CGMCCNO. 10785为革兰氏阳性菌，兼性好氧，生长溫度为 25°C-50°C，细胞形态呈杆状，单生，牛肉膏蛋白腺培养基上菌落呈白色，圆形，表面粗糖，不 透明。明胶液化、淀粉水解和VP试验均为阳性。
[0012] 地衣芽抱杆菌B307液体发酵周期长，菌体浓度低，为得到一株高产耐酸性高溫 a-淀粉酶的菌株，对其进行多轮常压室溫等离子体诱变，直到选育出一株代谢旺盛，生长 繁殖速度快，适宜高密度培养，高产耐酸性高溫a-淀粉酶的菌株。
[0013] 地衣芽抱杆菌CGMCCNO. 10785液体发酵产耐酸性高溫a-淀粉酶的方法，包括如 下步骤：
[0014] 种子培养：pH在6. 0-6. 5,培养溫度34°C-40°C，培养时间11-16小时；
[0015]种子培养基组成：麦芽糊精3-4%，酵母粉0. 2-0. 3 %，氯化巧0. 2-0. 3 %，硫酸锭 0. 8-1. 0%，蛋白腺 0. 5-0. 6%，憐酸氨二钢 0. 4-0. 5%，P册.0-6. 5。
[0016] 液体发酵：
[0017] 接种量3-5 %接种于发酵培养基，培养条件为：p册.0-6. 5,培养溫度35-40°C，罐 压0. 07MPa，溶氧在30 % -40 %，转速200-80化pm，发酵期间抑高于6. 5开始补料，补料控 制抑在6. 0-6. 5,菌体自溶严重时发酵结束，培养周期130-160小时。
[0018] 发酵培养基组成：木馨淀粉6-8%，豆饼粉6-7%，玉米浆1-3%，憐酸氨二锭 0. 1-0. 3%，氯化巧 0. 5-1. 0%，P册.0-6. 5。
[0019] 补料培养基组成：麦芽糖30-40%，憐酸二氨钢0. 5-1. 0%，氯化巧0. 5-1. 0%，pH 在 5. 0-5. 5。
[0020] 有益效果：
[0021] 本发明通过对原始菌株进行常压室溫等离子体诱变，再经发酵工艺优化和发酵培 养基优化，建立了液体发酵生产耐酸性高溫a-淀粉酶的方法，发酵酶活力在3. 8万-4. 2 万u/ml。生产的耐酸性高溫a-淀粉酶的最适抑为4.0-5.0，最适溫度反应为96-100°(：， 在95°C的条件保溫化，剩余酶活力为95%，具有稳定的耐酸和耐高溫特性，可广泛用于淀 粉加工、啤酒酿造、酒精、发酵及纺织等多个行业。
【附图说明】： 阳02引图1不同抑下的相对酶
[0023] 图2不同溫度下的相对酶活
[0024] 图3 95 °C保溫处理的相对酶活
【具体实施方式】：
[00巧]W下通过具体实施案例对本发明做详细说明，具体实施案例仅为举例说明，不作 为对本发明实施范围的限定。
[0026] 实施例1菌株的选育
[0027] 1.菌悬液的制备
[002引 吸取地衣芽抱杆菌B307种子液IOmL于离屯、管，800化pm离屯、5min，弃上清，菌体 WIOmL生理盐水清洗。相同条件离屯、2次，沉淀的菌体W2mL无菌水重悬即为菌悬液，菌 悬液浓度在107个/mL。
[0029] 2.常压室溫等离子体诱变
[0030] 吸取10yL菌悬液于载片上，用綴子将载片放于常压室溫等离子体系统操作室旋 转台上，缓慢调节升降台旋钮（参考升降台标尺）将载片与发生器间距约为2mm，诱变照射 时间选择30s、35s、40s。诱变完成后，将载片移至分装有1血生理盐水的EP管中，用縱满振 荡器摇匀后进行适当稀释。取100yL涂布于淀粉筛选板上，30°C培养36h，长出单菌落后挑 取菌落肥值（肥值=水解圈直径/菌落直径）高的菌株，分别是M6-X3、M6-22、M6-37。
[0031] 3.诱变菌株的摇瓶筛选
[0032] 将筛选的3株诱变菌株进行摇瓶发酵，摇瓶配方为：葡萄糖3%，酵母粉1. 5%，玉 米浆3. 5 %，氯化巧0. 12 %，氯化钢1. 5 %，憐酸二氨钢1. 2 %，碳酸巧3 %。培养溫度35 °C， 培养时间120h，转速2(K)巧m。3株诱变菌株摇瓶实验的酶活力如下：