德氏乳杆菌保加利亚亚种及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明设及一种乳酸菌，具体设及一种德氏乳杆菌保加利亚亚种及其应用。
【背景技术】
[0002] 德氏乳杆菌保加利亚亚种化actobacillus de化rueckii subspecies bulgaricus)属于乳酸杆菌菌群，在世界范围内广泛应用于酸奶、干酪等发酵乳品生产，是 最具经济价值的同型发酵乳酸菌之一。研究表明德氏乳杆菌保加利亚亚种具有益生作用， 对维持人体胃肠道微生态平衡，抑制肠道内病原菌生长，提高机体免疫力具有积极的功效。
[0003] 酸奶发酵的过程是一个明显的酸化过程，德氏乳杆菌保加利亚亚种是乳酸菌中产 酸能力最强的菌种，能利用葡萄糖、果糖、乳糖进行同型乳酸发酵产生D型乳酸，D型乳酸的 特点是有酸涩味，适口性差，市售德氏乳杆菌保加利亚亚种发酵的酸奶在未加调味剂之前， 品尝起来感官是太酸，且酸味较强烈。
[0004] 例如中国专利文献CN102286407 B(申请号201110220985. 5)公开了一种低溫 发酵的德氏保加利亚乳杆菌及其制备酸奶的方法，是采用MRS培养基从甘肃省甘南自治州 的发酵巧牛乳中分离得到的，该菌种在25°C下发酵15h即可凝乳，用该菌株生产的酸奶具 有粘度高、双乙酷含量高的特点。该专利解决了德氏保加利亚乳杆菌低溫发酵的问题，未解 决德氏保加利亚乳杆菌发酵的酸奶酸味强烈的问题。
【发明内容】
[0005] 本发明所要解决的技术问题是提供一种改善酸奶口感、发酵的酸奶酸味柔和不强 烈、发酵的酸奶香味更浓郁的德氏乳杆菌保加利亚亚种及其应用。
[0006] 实现本发明第一目的的技术方案是本发明提供德氏乳杆菌保加利亚亚种 (Lactobacillusde化rueckiisubspeciesbulgaricus)NJ441CCTCCNO.M2014249。
[0007] 本发明的德氏乳杆菌保加利亚亚种化actobacillusde化rueckiisubspecies bulgari州s)NJ441，保藏日期2014年6月9日，保藏地点中国典型培养物保藏中屯、(地址 为中国，武汉，武汉大学)，其简称为(：口'〇：。保藏编号为(：口'〇：^.12014249。
[0008] 实现本发明第二目的的技术方案是上述德氏乳杆菌保加利亚亚种 化actobacillus de化rueckii subspecies bulgari州s)NJ 441在制备乳制品中的应用。
[0009] 本发明具有积极的效果：（1)本发明的德氏乳杆菌保加利亚亚种（Lactobacillus de化rueckiisubspeciesbulgari州S)NJ441分离自保加利亚山里人家的传统发酵乳制 品，在显微镜下观察，本发明的菌较市售的菌株个头大，粗、长，状态更好。
[0010] (2)本发明的德氏乳杆菌保加利亚亚种化actobacillusde化rueckii subspeciesbulgari州s)NJ441发酵得到的酸奶的抑值较市售德氏乳杆菌保加利亚亚种 发酵的酸奶的抑值稍高，体现在口感上是本发明的菌发酵的酸奶酸味绵柔不刺激不强烈， 消费者试食用口感更高。另一方面，由本发明的菌发酵的酸奶的香味更为浓郁，对于酸奶的 风味也进一步改善。
【具体实施方式】
[0011] 本发明的德氏乳杆菌保加利亚亚种化actobacillusde化rueckiisubspecies bulgaricus)NJ441菌株从保加利亚山里人家的自制酸奶中分离获得，保加利亚自然条件 优越，境内低地、丘陵、山地各约占=分之一。本发明所述的山里人家指的是生活在山地地 区的人家。保加利亚属溫带大陆性气候，空气中含氧量高；森林资源丰富，适宜优质乳酸杆 菌的生长；当地人民很早就开始自制酸奶，在自然进化过程中获得凝乳状态好、风味独特的 优良乳酸菌。
[001引（实施例1) 德氏乳杆菌保加利亚亚种化actobacillusde化rueckiisubspeciesbulgari州s)NJ441的分离方法包括W下步骤： ①用无菌枪头取ImL经无菌离屯、管采集回来的保加利亚山里人家的自制酸奶，转移入 无菌试管中，向试管中加入生理盐水9mU充分振荡溶解均匀得到稀释度为10 1的菌液。
[0013] ②取步骤①的菌液ImL于另一试管中，向试管中加入生理盐水9mU充分振荡溶解 均匀得到稀释度为10 2的菌液。
[0014] 重复上述步骤四次，依次得到稀释度为10 3的菌液、10 4的菌液、10 5的菌液和10 6 的菌液。
[001引将装有10 %菌液、10 3的菌液、10 4的菌液、10 %菌液和10 6的菌液的试管分别 标号为1号、2号、3号、4号和5号。
[0016] ③分别从步骤②的五支试管中取0. 05血菌悬液涂布于MRS琼脂培养基平板，剩余 的五个稀释度的菌液置于4°C的冰箱中备用。将MRS琼脂培养基平板在36°C恒溫下厌氧培 养2至3天(本实施例中为72h)。
[0017] 上述MRS琼脂培养基平板的准备方法如下：取蛋白腺10.Og、牛肉浸取物10.Og、酵 母提取液5.Og、葡萄糖20.Og、乙酸钢5.Og、巧樣酸二胺2.Og、吐溫-80 1.Og、憐酸氨二钟 0.4g、硫酸儀0.58g、硫酸儘0.29g、碳酸巧20.Og、琼脂15.Og依次加入蒸馈水并将蒸馈水补 充到1000血，将抑调至6. 3,揽拌均匀后加热，煮沸2min，在121°C、0.IMpa下灭菌30min， 然后倾注平板，冷却后得到MRS琼脂培养基平板。
[0018] ④用接种针或接种环挑取单菌落的一半进行革兰氏染色，菌落的另一半接种于含 有10%乳清的MRS琼脂培养基，待做生化鉴定。
[0019] 步骤④挑取的菌落革兰氏染色结果为阳性。选择革兰氏阳性的菌落进一步划线分 离，直至分离得到纯德氏乳杆菌保加利亚亚种化actobacillusde化rueckiisubspecies bulgari州S)NJ441菌种为止。
[0020] 本实施例的德氏乳杆菌保加利亚亚种化actobacillusde化rueckiisubspecies bulgari州S)NJ441具有W下特性： 1、德氏乳杆菌保加利亚亚种化actobacillusde化rueckiisubspeciesbulgari州S)NJ441的细胞形态为杆状，形成芽抱结果为阴性，接触酶结果为阴性，氧化酶结果为阴性， 发酵葡萄糖产气结果为阴性。
[0021] 德氏乳杆菌保加利亚亚种化actobacillusde化rueckiisubspecies bulgari州S)NJ441的理化试验-碳水化合物产酸（API50CH)试验结果如下：
2、 遗传学特征 德氏乳杆菌保加利亚亚种化actobacillusde化rueckiisubspeciesbulgari州s)NJ441的16SrRNA基因序列如下：
3、 德氏乳杆菌保加利亚亚种(Lactobacil山Sdelbrueckiisubspeciesbulgaricus)NJ441 的出eS 基因序列如下：
根据细胞形态、生理化学特征、16SrRNA基因序列和地eS基因序列等试验数据综 合分析，本实施例的菌种鉴定为德氏乳杆菌保加利亚亚种化actobacillusde化rueckii subspeciesbulgari州S) (W上鉴定结果由中国科学院微生物研究所作出，2014微检字第 Ill号)。
[0022] (应用例I、用德氏乳杆菌保加利亚亚种NJ441发酵牛奶制备酸奶） 首先准备杀菌乳，向4. 5kg鲜牛奶中加入0. 3kg薦糖，溶解后过滤除去杂质，再预热至 60°C，然后在15Mpa下均质lOmin，得到均匀液体于95°C下杀菌5min，然后冷却至30°C备 用。
[0023] 向0. 04kg杀菌乳中分别接入3环实施例1的德氏乳杆菌保加利亚亚种 化actobacillusde化rueckiisubspeciesbulgari州s)NJ441，培养24小时使细胞计数在 IO8~10 9C化/mL之间，得到接种菌液。
[0024] 向IL消毒后的牛奶中加入0. 03kg上述接种菌液，揽拌均匀后，在35°C~45°C溫 度下保溫4~10小时。本实施例中在42°C溫度下保溫5小时，5小时后得到发酵好的酸奶。 保溫时间根据个人口感确定，需要酸奶粘稠些延长保溫时间，需要酸奶稀一些，缩短保溫时 间。
[002引（对比例1) 参比菌株来源于用川秀菌粉(川秀双歧杆菌7菌酸奶发酵剂1.化型）发酵鲜牛奶得到 的酸奶中，先使用市售川秀菌粉发酵鲜牛奶，得到酸奶后，按照实施例1的方法得到其中的 德氏乳杆菌。同样的，按照应用例1的方法向0.04kg杀菌乳中分别接入3环参比菌株，培 养24小时使细胞计数在IO8~10 9C化/血之间，得到接种菌液待用。
[0026] 按照应用例1制备酸奶的方法，分别向IL消毒后的牛奶中加入0.03kg德氏乳杆 菌保加利亚亚种化actobacillusde化rueckiisubspeciesbulgari州s)NJ441 接种菌液 和参比菌株接种菌液，揽拌均匀后，在40°C溫度下保溫4小时40分钟发酵完成，保溫过程中 在不同时间点取适量酸奶放入烧杯中，检测各时间点的抑值，检测结果如下：
由上表数据对比可知，本发明的德氏乳杆菌保加利亚亚种化actobaciIIus de化rueckiisubspeciesbulgari州s)NJ441发酵后得到的酸奶的抑值较市售德氏乳杆 菌保加利亚亚种发酵的酸奶的抑值稍高，品尝发现本发明的菌发酵的酸奶酸味绵柔不刺 激不强烈，食用口感更佳。另一方面，由本发明的菌发酵的酸奶的香味更为浓郁，对于酸奶 的风味也进一步改善。
【主权项】
1. 一 种德氏乳杆菌保加利亚亚种（Lactobacillus delbrueckii subspecies bulgaricus) NJ441，其特征在于：所述德氏乳杆菌保加利亚亚种菌株保藏在中国典型培养 物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO. M2014249。2. 权利要求1所述的德氏乳杆菌保加利亚亚种NJ441在制备乳制品中的应用。
【专利摘要】本发明提供了一种德氏乳杆菌保加利亚亚种及其应用，本发明的德氏乳杆菌保加利亚亚种（Lactobacillus？delbrueckii？subspecies？bulgaricus）NJ？441发酵得到的酸奶的pH值较市售德氏乳杆菌保加利亚亚种发酵的酸奶的pH值稍高，体现在口感上是本发明的菌发酵的酸奶酸味绵柔不刺激不强烈，消费者食用口感更好。另一方面，由本发明的菌发酵的酸奶的香味更为浓郁，对于酸奶的风味也进一步改善。CCTCC NO：M201424920140609
【IPC分类】C12N1/20, A23C9/123, C12R1/225
【公开号】CN105154369
【申请号】CN201510630596
【发明人】陈咏梅
【申请人】陈咏梅
【公开日】2015年12月16日
【申请日】2015年9月29日