缺失d-乳酸产生的约氏乳杆菌菌株cncm i-1225的天然衍生物的制作方法
【专利摘要】本发明一般地涉及益生菌领域。特别地，本发明涉及缺失D-乳酸产生的约氏乳杆菌（Lactobacillus?johnsonii）菌株CNCM?I-1225的天然衍生物。
【专利说明】缺失D-乳酸产生的约氏乳杆菌菌株CNCM 1-1225的天然衍
生物
[0001]本发明一般地涉及益生菌领域。特别地，本发明涉及缺失D-乳酸产生的约氏乳杆菌(Lactobacillus johnsonii)菌株 CNCM 1-1225 的天然衍生物。
[0002]人分离株约氏乳杆菌CNCM 1-1225也称为约氏乳杆菌NCC533或者嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus) La1、或者约氏乳杆菌 Ljl (Bernet-Camard, M.F.，等人，(1997) Appl.Environ.Microbiol.63，2747-2753)是目前非常成功地以商标Lcl商品化的益生菌。
[0003]约氏乳杆菌CNCM 1-1225具有几种明确记录的健康益处，例如，免疫调节或病原体抑制的活性(Haller，D.，等人，2000，Infect.1mmun.68:752-759 ；Haller, D.，等人，2000，Gut47:79-87 ;或 Ibnou-Zekri, N.，等人，2003，Infect.1mmun.71:428-436)和长期的安全
使用历史。
[0004]限制约氏乳杆菌CNCM 1-1225在一些产品种类，例如在用于幼儿和婴儿的产品中的应用的一个方面是从糖的发酵中主要地产生了 D-乳酸同分异构体。例如，如果在MRS培养基中培养，那么约氏乳杆菌CNCM1-1225将乳糖发酵成60%: 40%比例的D-和L-乳酸。
[0005]由于3岁以下婴儿有限的D-乳酸消除(这可能导致D-乳酸中毒)，所以CODEXInfant Formula Directive对3岁以下婴儿消费的D-乳酸和产生D-乳酸的细菌给出了建议。
[0006]支持该结论的证据是有限的，并且所述证据主要是基于食物中D-乳酸的存在，并且没有基于产生D-乳酸细菌(其是胃肠道的天然寄居菌)的施用。
[0007]因此，几篇文献对该观点`提出了质疑(Connolly，E.等人，NTRAfoods3 (3),37-49,2004 ；Haschke-Becher, E.，等人，2008, Ann.Nutr.Metab.53:240-244, Mack, D.R.,2004,Can.J.Gastroenterol.18:671-675),但到目前为止，CODEX Infant Formula Directive的建议仍没有改变。
[0008]CODEX基本上排除了将产生D-乳酸的益生菌作为婴儿配方食品中的补充剂，但鼓励只产生L-乳酸的菌株的遗传改造。此类研发的实例是产生经遗传修饰的生物(GM0)，特别是经遗传修饰的约氏乳杆菌菌株，其中分离了 d-乳酸脱氢酶(D-LDH)基因(ldhD)，并通过基因替换，将IdhD基因体外截短的克隆拷贝用于失活基因组拷贝(Lapierre，L.，等人，1999, Appl.Environ.Microbiol.65:4002-4007)。
[0009]产生的这种经遗传改造的菌株仅用于实验室目的，并且从未用于食品中，因为使用重组DNA技术，已经改变了所述菌株的遗传物质，因此认为该菌株是GM0。
[0010]然而，期望存在这样的可能性，允许约氏乳杆菌菌株CNCM 1-1225的大量健康益处也可用于目前并不建议消费D-乳酸或者产生D-乳酸的细菌的个体。
[0011]因此，本领域存在天然益生菌菌株，特别是约氏乳杆菌菌株CNCM 1-1225的天然衍生物的强烈需求，所述约氏乳杆菌菌株CNCM 1-1225的天然衍生物缺失了 D-乳酸产生，但尽管如此仍可存活。
[0012]本发明人处理了这些需求。[0013]因此，本发明的目的是为本领域提供约氏乳杆菌菌株CNCM 1-1225的衍生物，其还可以应用于婴幼儿产品，同时考虑CODEX Infant Formula Directive的当前规则,所述约氏乳杆菌菌株CNCM 1-1225的衍生物是天然的且不会被认为是GM0。
[0014]本发明人惊讶地发现，他们可以通过独立权利要求的主题实现本发明的目的。从属权利要求进一步发展了本发明的理念。
[0015]本发明人研究了分离天然的(非GM0)、活的和遗传上稳定的约氏乳杆菌Lal的变体的可能性，所述约氏乳杆菌Lal的变体只产生L-乳酸。
[0016]基因组序列的改变以相对低的频率天然地发生，例如由于损伤DNA的错误修复或者DNA复制错误而发生。
[0017]为了寻找约氏乳杆菌菌株CNCM 1-1225的此类天然衍生物，本发明人筛选了大约21-000个约氏乳杆菌CNCM 1-1225菌落，并且已经鉴定了两个可以实现本发明的目的的天然D-乳酸缺失变体。
[0018]本发明人还测定了 MRS培养上清液中的D-和L-乳酸浓度，并且显示与培养上清液中总的乳酸浓度相比，相对的D-乳酸浓度低于4% ;特别地，在一种情况下3.7%，并且在第二种情况下0%。
[0019]DNA序列分析鉴定了乳酸脱氢酶基因中主要的点突变，所述点突变改变了酶的氨基酸序列，因此改变了酶的催化性质。
[0020]两种天然衍生物都显示是可存活的并且稳定的，并且没有回复突变至D-乳酸产生的实例。
[0021]因此，本发明的一个实施方案是约氏乳杆菌菌株CNCM 1-1225的天然衍生物，其中所述约氏乳杆菌菌株CNCM 1-1225的衍生物缺失D-乳酸产生。
[0022]据本发明人了解，这是第一次提供了缺失D-乳酸产生的约氏乳杆菌菌株CNCM1-1225的天然衍生物。
[0023]对于本发明的目的，“缺失D-乳酸产生”指的是与总乳酸生产量相比，菌株产生少于5%，优选地少于4%，和理想地0%的D-乳酸。可以在无细胞培养上清液中测量D-和L-乳酸浓度。
[0024]由约氏乳杆菌菌株CNCM 1-1225的天然衍生物产生的乳酸的总量最初与细胞生长相关。当细胞进入稳定期并停止分裂时，它们继续代谢糖并产生更多的乳酸。然而，发现产生的D-和L-乳酸的比例是恒定的。
[0025]约氏乳杆菌菌株CNCM 1-1225的“天然”衍生物指的是不认为是GMO的菌株。例如可以通过筛选经历了天然发生的基因组序列改变(例如，由于损伤DNA的错误修复或者DNA复制错误)的菌落，来获得此种天然衍生物。通过使菌落经历胁迫条件，例如通过应用甲磺酸乙酯，EMS可以增加这种错误的天然发生。
[0026]对于本申请的目的，术语“GM0”应当根据2001年3月12日的DIRECTIVE2001/18/EC OF THE EUROPEAN PARLIAMENT AND OF THE COUNCIL对于故意将经遗传修饰的生物释放到环境中和撤销的Council Directive90/220/EEC定义。因此，‘经遗传修饰的生物(GM0)’指的是除人类之外的这样的生物，其中遗传物质已经通过非天然发生(交配和/或非天然重组)的方式而改变。 [0027]就该定义而言，至少通过使用以下技术发生遗传修饰:[0028](I)重组核酸技术，其涉及通过将以生物之外的任一种方法产生的核酸分子插入到任一种病毒、细菌质粒或其他载体系统中来形成遗传物质的新组合，并且将所述遗传物质的组合掺入到它们并非天然存在，但能继续增殖的宿主生物中；
[0029](2)涉及将在生物之外制备的可遗传物质直接引入到生物中的技术，其包括显微注射法、巨量注射法和微囊化作用；或
[0030](3)细胞融合(包括原生质体融合)或杂交技术，其中使用并非天然存在的方法，通过融合两个或多个细胞形成具有可遗传的遗传物质的新组合的活细胞。
[0031]如果菌株具有至少99.95%，例如至少99.99%，优选地至少99.995%的核酸同一性，那么认为菌株是约氏乳杆菌菌株CNCM 1-1225的“衍生物”。例如，如果与约氏乳杆菌CNCM1-1225的核酸序列相比，菌株具有不超过500个，例如不超过100个，优选地不超过50个的核酸改变，那么认为菌株是约氏乳杆菌菌株CNCM 1-1225的衍生物。
[0032]本发明人发现，本发明约氏乳杆菌菌株CNCM 1-1225的天然衍生物在负责D-乳酸缺失表型的d-ldh基因中显示出突变。
[0033]因此，约氏乳杆菌菌株CNCM 1-1225的天然衍生物可能具有改变的D-乳酸脱氢酶序列。例如，约氏乳杆菌菌株CNCM 1-1225的天然衍生物可以包含在D-乳酸脱氢酶序列的氨基酸位置153处甘氨酸至天冬氨酸的氨基酸改变和/或在氨基酸位置204处丝氨酸至亮氨酸的氨基酸改变。
[0034]这种改变明显地改变了 D-乳酸脱氢酶的功能，以致产生了极少的D-乳酸或者不会产生D-乳酸。
[0035]D-乳酸脱氢酶蛋白质序列的改变基于D-乳酸脱氢酶基因的核酸序列的改变。
·[0036]使得到的酶失活的D-乳酸脱氢酶基因的核酸序列的任何天然改变都可以实现本发明的主题。此外，野生型序列或者一部分或整个D-乳酸脱氢酶基因内一个或多个连续核苷酸的一个或多个缺失均可以实现本发明的主题。
[0037]本发明人分析了本发明约氏乳杆菌菌株CNCM 1-1225的天然衍生物中D-乳酸脱氢酶基因的核酸序列。
[0038]因此，本发明还涉及约氏乳杆菌菌株CNCM 1-1225的天然衍生物，其中在约氏乳杆菌菌株CNCM 1-1225的天然衍生物中D-乳酸脱氢酶基因的核酸序列在核酸位置498处包含G至A的转变和/或在核酸位置651处包含C至T的转变。
[0039]尽管导致D-乳酸脱氢酶失活的此种改变在大自然中可以以低频率自发地发生，但其是随机的，并且可以以相同的频率修复回亲本序列(野生型)。
[0040]如果失活的基因赋予了变体生长缺陷，那么这种修复频率可以甚至更高。考虑到从培养物保藏到最终产物之间的多次传代，重要的是此种改变是稳定的，特别地因为单碱基对改变在遗传上比缺失更不稳定。
[0041 ] 有利地，还发现这些改变是稳定的。
[0042]实现本发明目的的约氏乳杆菌菌株CNCM 1-1225的天然衍生物的两个实例是分离的、纯化的，并且详细表征的菌株。
[0043]因此，本发明涉及约氏乳杆菌菌株CNCM 1-1225的天然衍生物，其选自约氏乳杆菌CNCM 1-4434 和约氏乳杆菌 CNCM 1-4441。
[0044]约氏乳杆菌CNCM 1-4434和约氏乳杆菌CNCM 1_4441都在布达佩斯条约下于2011年 2 月 8 日保藏于 Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (CNCM),Institut Pasteur, 25Rue du Docteur Roux, F_75724Paris Cedexl5,法国。
[0045]两株菌株都是被完全测序的。
[0046]约氏乳杆菌CNCM 1-1225在布达佩斯条约下于1992年6月30日保藏于CNCM。
[0047]约氏乳杆菌CNCM 1-4434含有总共37个核酸改变，其包括单碱基对缺失。这包括D-乳酸脱氢酶基因序列的期望改变(推测其负责该菌株缺失的D-乳酸产生)和原噬菌体Lj965中可以认为是‘自私’ DNA的基因的两个改变(不可能影响细菌的生理)。剩余的基因/预测蛋白质在大体上仅是不精确注释的，但几种改变影响对细菌生长更加重要的基因。存在经预测其功能对生长是必需的6个基因的改变，所述基因即LJ1108-DNA拓扑异构酶1、LJl 197 -青霉素结合蛋白1A、LJ1283 -乳清酸磷酸核糖基转移酶、LJ1492-DNA聚合酶IIIa亚基、LJ1493-脯氨酰-tRNA合成酶和LJ1600 -肽链释放因子3。全部这些功能对细菌的生长都是必需的，因为可能除LJ1283外，不能通过生长培养基补充它们。通过在MRS肉汤中，CNCM 1-4434以与Lal相似的速率生长，以及CNCM 1-4434在MRS和工业培养基中也达到的相似的最终CFU，证实各个以及积累的改变的作用对生长没有显著的不利影响。值得注意的最后第二个改变是LJ0854 - β_半乳糖苷酶小亚基，其不会影响乳糖发酵。
[0048]约氏乳杆菌CNCM 1-4441含有总共27个核酸改变，其包括D-乳酸脱氢酶基因的期望改变(在该菌株中负责缺失D-乳酸产生)，在原噬菌体Lj965和Lj928中的各一个改变和插入序列ISLjo5的转座酶的改变。存在经预测其功能对生长重要的3个基因的改变，所述基因即LJ1009 -延伸因子Tu、LJ1516 -信号识别颗粒蛋白和LJ1600 -肽链释放因子
3。尽管这些单个以及组合的改变，在MRS和工业培养基中，与Lal相比，约氏乳杆菌CNCM1-4441达到了相似的最终CFU。
[0049]本发明还扩展至根据本发明的`约氏乳杆菌菌株CNCM 1-1225的天然衍生物，其中约氏乳杆菌菌株CNCM 1-1225的天然衍生物以在生物学上纯的培养物存在。
[0050]根据本发明的约氏乳杆菌菌株CNCM 1-1225的天然衍生物可以根据任何合适的方法培养，并可以通过例如冷冻干燥或者喷雾干燥另外地制备以添加至本发明的组合物中。
[0051]益生菌菌株约氏乳杆菌CNCM 1-1225提供了许多明确记录的健康益处，其中一些在上文中进行了详述。
[0052]“益生菌”指的是对宿主的健康或安康具有有益作用的微生物细胞制备物或者微生物细胞的组分。(Salminen S,等人“Probiotics:how should they be def ined”TrendsFood Sc1.Technol.1999:10107_10)。
[0053]就提供的健康益处而言，基本上可以把根据本发明的约氏乳杆菌菌株CNCM1-1225的天然衍生物看作生物等效物(bioequivalent)。
[0054]科学工作显示，从约氏乳杆菌菌株CNCM 1-1225的生物学上纯的培养物分离的无细胞培养上清液也具有几种健康益处(参见例如，Bernet-Camard, M._F.，等人，1997，APPLIED AND ENVIRONMENTAL MICROBIOLOGY，第 2747 - 2753 页)。
[0055]因此，本发明还扩展至从根据本发明的约氏乳杆菌菌株CNCM 1-1225的生物学上纯的天然衍生物的培养物分离的无细胞培养上清液。
[0056]由于本发明约氏乳杆菌菌株CNCM 1-1225的天然衍生物和无细胞培养上清液具有大量健康益处，因此可以将它们用于治疗或预防人体或动物体的病症。
[0057]因此，本发明涉及包含根据本发明的约氏乳杆菌菌株CNCM 1-1225的天然衍生物和无细胞培养上清液的组合物，其用于制备在通过治疗处理人体或动物体的方法中使用的组合物。
[0058]本发明还涉及包含根据本发明的约氏乳杆菌菌株CNCM 1-1225的天然衍生物和无细胞培养上清液的组合物的用途，其用于制备药物组合物或者药物。
[0059]已经对约氏乳杆菌CNCM 1-1225的益生菌相关活性进行了大量的研究，所述益生菌相关活性包括免疫调节(Haller, D.，等人，2000, Infect.Tmmun.68, 752-759 ；Haller,
D.，等人，2000，Gut47,79-87 ；Ibnou-Zekri, N.，等人，2003，Infect.1mmun.71，428-436)、病原体抑制(Bernet，M.F.，等人，1994，Gut35，483-489)和上皮细胞附着(Neeser，J.R.，等人,2000, GlycobiologylO, 1193-1199 ；Granato, D.，等人，1999, Appl.Environ.Microbiol.65，1071-1077)。
[0060]由于生物等效性，根据本发明的约氏乳杆菌菌株CNCM 1-1225的天然衍生物和/或其无细胞培养上清液提供了相同的健康益处。
[0061]因此，本发明涉及包含根据本发明的约氏乳杆菌菌株CNCM 1-1225的天然衍生物和/或无细胞培养上清液的组合物，其用于治疗或预防与减弱的免疫系统相关的疾病。
[0062]本发明还涉及根据本发明的约氏乳杆菌菌株CNCM 1-1225的天然衍生物和/或无细胞培养上清液的用途，其用于制备用于治疗或预防与减弱的免疫系统相关的疾病的组合物。
[0063]与减弱的免疫系统·相关的疾病是本领域熟知的，并且本领域技术人员理解，哪些疾病与减弱的免疫系统相关。
[0064]与减弱的免疫系统相关的疾病的一般实例可以选自流感、鼻炎、普通感冒及其组
口 ο
[0065]还可以将包含根据本发明的约氏乳杆菌菌株CNCM 1-1225的天然衍生物和/或无细胞培养上清液的组合物用于治疗或预防与肠道毒性细菌(enterovirulent bacteria)或病毒的细胞附着和细胞入侵相关的疾病。
[0066]本发明还扩展至根据本发明的约氏乳杆菌菌株CNCM 1-1225的天然衍生物和/或无细胞培养上清液的用途，其用于治疗或预防与肠道毒性细菌或病毒的细胞附着和细胞入侵相关的疾病的组合物的制备。
[0067]肠道毒性细菌或病毒是本领域熟知的。欧洲食品安全局(European Food SafetyAuthority) (EFSA)已经在2010年11月公布了此种病原体的列表。
[0068]例如，肠道毒性细菌或病毒可以选自沙门氏菌属(Salmonella);弯曲杆菌属(Campylobacter);利斯特氏菌属(Listeria);大肠杆菌菌株，例如如ETEC、EHEC> EPEC或EIEC菌株；耶尔森氏菌属(Yersinia);志贺氏菌属(Shigella);产毒素细菌，如金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、肉毒梭状芽胞杆菌(Clostridium botulinum)或腊状芽抱杆菌(Bacillus cereus) ；Vibrio vulnifucus/parahaemoIyticus (副溶血弧菌)；轮状病毒属(rotavirus);诺瓦克病毒(norovirus);肠出血型大肠杆菌(verotoxigenic
E.coli )；阪崎肠杆菌(Enterobacter sakazakii );产毒的产气荚膜梭菌(toxigenicC.perfringens) (A型和B型)；食源性寄生虫，如棘球蝴(Echinococcus)、弓形体(Toxoplasma)或贾第虫属(Giardia);幽门螺杆菌(Helicobacter pylori);艰难梭菌(Clostridium difficile);破伤风梭菌(Clostridium tetani)及其组合。
[0069]本领域技术人员清楚，哪种病症与哪种肠道毒性细菌或病毒物种相关。
[0070]例如，与肠道毒性细菌或病毒物种的细胞附着和细胞入侵相关的疾病可以选自下呼吸道感染、胃肠道感染、中耳炎及其组合。
[0071]本发明组合物可以是任何类型的组合物，只要其适合于施用给人类或动物。
[0072]特别地，本发明组合物可以口服地、肠内地、胃肠外地或者局部地施用。可以以通常用于选定的施用模式的任何植物制剂形式提供组合物。
[0073]可以将本发明组合物施用给任何年龄组。
[0074]优选地，可以在寒冷的季节，例如从秋天至春天期间，施用本发明组合物。
[0075]还可以在任何时间消费本发明组合物。优选地，在早晨消费本发明组合物，例如以增强一天的免疫系统。
[0076]组合物可以例如选自食品组合物、宠物食品组合物、饮料、乳制品、营养制剂、婴儿配方食品、食品添加剂、营养制品、药物组合物、食品成分和/或化妆品组合物。
[0077]例如，组合物可以选自酸化的乳产品，例如酸奶或酸奶饮料；或者基于乳的粉末。
[0078]如果以货架稳定粉末的形式提供组合物，那么特别优选的是粉末状产品。为了获得货架稳定性，并且确保益生菌的存活，可以以少于0.2，例如0.19-0.05，优选地少于0.15的水活度提供组合物。水活度或aw是系统中水的能量状态的测量。它定义为来源于粉末/产品的水的蒸汽压除以在相同温度下纯水的蒸汽压；因此，纯蒸馏水具有准确地为I的水活度。`
[0079]本发明组合物可以是清洁剂、保护剂、治疗或护理乳膏、护肤洗液、凝胶或泡沫，如清洁或消毒洗液、沐浴组合物或除臭组合物。
[0080]更特别地，对于用于体外局部施用的组合物，它们可以是水溶液、水-醇溶液或油性溶液、洗液或血清类型的溶液或分散剂、通过分散水相中的脂肪相(0/W)或反过来(W/0)获得的液体或半液体稠度的乳型乳剂或者软的、半固体或固体稠度(solid consistency)的乳膏性混悬剂或乳剂、水凝胶或无水凝胶、微乳剂、微胶囊、微粒或者离子和/或非离子型的多孔分散剂。
[0081]根据本发明的局部组合物可以有利地以适合于护发的任何植物制剂形式，特别地以洗发剂、香波，特别地去头屑洗发剂、护发素、薰衣草洋甘菊护发素(detangler)、发乳或凝胶、造型漆(styling lacquer)、卷发药水、治疗洗液、染色组合物(特别地氧化染料)的形式，任选地以染色香波、头发重构洗液、电烫组合物(permanent-waving composition)、抗脱发洗液或凝胶、抗寄生虫香波或药用香波，特别地低抗-皮脂溢香波、头皮护理产品(其特别地抗刺激、抗老化或者重构，或者活化血液循环)的形式配制。
[0082]当本发明组合物是乳剂时，相对于组合物的总重量，脂肪相以重量计可以为5%至80%，优选地以重量计10%至50%。在组合物中以乳剂形式使用的油、乳化剂和辅助乳化剂可以选自在化妆品和/或皮肤病领域中常规使用的那些油、乳化剂和辅助乳化剂。相对于组合物的总重量，在组合物中，乳化剂和辅助乳化剂以重量计可以以0.3%至30%，优选地以重量计0.5%至20%的比率存在。
[0083]当本发明的组合物是油性凝胶或溶液时，脂肪相可以以超过组合物的总重量的90%存在。
[0084]用于局部施用的植物制剂形式还可以含有在化妆品、药物和/或皮肤病领域中常用的辅助剂，例如亲水性或亲脂性胶凝剂、亲水性或亲脂性活性剂、防腐剂、抗氧化剂、溶剂、香料、填料、防晒剂、吸味剂和染料。这些多种辅助剂的量为所考虑领域使用的常规量，并且例如为组合物的总重量的0.01%至20%。取决于辅助剂的性质，可以将它们引入到脂肪相中和/或水相中。
[0085]提及的可以用于本发明的脂肪物质可以由这样的物质制备，所述物质例如是矿物油例如氢化聚异丁烯和液体的矿脂、植物油例如牛油树脂的液体部分、向日葵油和杏仁油、动物油例如鲨烷、合成油，特别地鸭子尾脂腺油(Purcellin oil)、肉豆蘧酸异丙酯和乙基己基棕榈酸酯、不饱和脂肪酸和氟代油例如聚全氟聚醚。还可以使用脂肪醇、脂肪酸例如硬脂酸和例如蜡，特别地石蜡、巴西棕榈蜡和蜂蜡。还可以将硅酮化合物例如硅酮油、环状甲基硅酮和二甲硅油，以及硅酮蜡、树脂和树胶制备用于本发明的脂肪物质。
[0086]提及的可以用于本发明的乳化剂可以由这样的物质制备，所述物质例如是甘油硬脂酸酯、聚山梨醇60、由公司Henkel以名称Sinnowax AO?销售的包含33摩尔环氧乙烧的十六/十八醇/十六/十八烷基氧乙烯醚(cetylstearyl alcohol/oxy ethylenatedcetylstearyl alcohol)的混合物、由公司 Gattefosse 以名称Tefose? 63销售的 PEG-6/PEG-32/硬脂酸乙二醇酯的混合物、肉豆寇醚、硅酮乳化剂例如鲸蜡基二甲基硅氧烷共聚醇和山梨糖醇酐单硬脂酸 酯或三硬脂酸酯、PEG-40硬脂酸酯或者氧乙烯化山梨糖醇酐单硬脂酸酯(20E0)。
[0087]提及的可以用于本发明的溶剂，可以由这样的物质制备，所述物质是例如低级醇，特别地乙醇、异丙醇和丙二醇。
[0088]本发明组合物还可以有利地含有泉水和/或矿泉水，特别地选自Vittel水、来自Vichy 流域(basin)的水和 la Roche Posay 水。
[0089]提及的亲水性胶凝剂，可以由这样的物质制备，所述物质例如是羧基聚合物如卡波姆、丙烯酸共聚物如丙烯酸酯/丙烯酸烷基酯共聚合物、聚丙烯酰胺，以及特别地由公司SEPPIC以名称Sepigel 305?销售的聚丙烯酰胺、C13-14异链烷烃和Laureth-7的混合
物、多糖例如衍生物如羟烷基纤维素，特别地羟丙基纤维素和羟乙基纤维素、天然树胶如瓜尔豆胶、豆角胶、角豆胶和黄元胶，以及粘土。
[0090]提及的亲脂性胶凝剂，可以由这样的物质制备，所述物质例如是改良的粘土如膨润土、脂肪酸的金属盐如硬脂酸铝、疏水性二氧化硅、乙基纤维素和聚乙烯。
[0091 ] 根据本发明的组合物还可以是构成清洁皂或棒的固体制备物。
[0092]还可以将它们以溶液、乳膏、凝胶、乳剂或摩丝形式或者备选地以还含有压力下的推进剂的气溶胶组合物形式用于头皮。
[0093]在根据本发明的口服施用的情况下，优选的是使用可消化的支持体或运载体。取决于所考虑的组合物的类型，可消化的支持体或运载体可以具有不同的性质。
[0094]乳、酸奶、干酪、发酵乳、基于乳的发酵产品、冰淇淋、基于谷物的产品或者基于发酵的谷物的产品、早餐谷物、谷物或燕麦棒、基于乳的粉末、婴幼儿配方食品、糖果食品、巧克力或谷物类型、特别地用于家畜的动物饲料、片剂、凝胶胶囊或锭剂、液体细菌混悬剂、以干物质形式的口服补充剂或以液体形式的口服补充剂都特别适合作为可吸收的支持体或运载体。
[0095]根据本发明待口服施用的组合物可以例如以包衣片、凝胶胶囊、凝胶、乳剂、片剂、胶囊、水凝胶、食物棒、压缩的或者松散的粉末、液体悬浮液或溶液、糖果产品、发酵乳、发酵乳酪、口香糖、牙膏或喷雾溶液或者食物运载体的形式配制。
[0096]干物质形式的药片或锭剂、口服补充剂，以及液体形式的口服补充剂适合用作饮食或药物支持体或者食物运载体。
[0097]特别地，可以通过产生糖衣片剂、凝胶胶囊、凝胶、乳剂、片剂、胶囊和允许缓释的水凝胶的常用方法配制组合物，例如食品补充剂。
[0098]特别地，可以将根据本发明的微生物掺入到所有形式的食品补充剂或强化食品，例如食物棒或者压缩的或未压缩的粉末中。粉末可以稀释于水、苏打水、乳制品或大豆衍生物中，或者可以掺入到食物棒中。
[0099]此外，可以将本发明的微生物、其部分和/或其代谢物与下述物质一起配制，所述物质是此类口服组合物或食品补充剂的常用的赋形剂和组分，特别地即脂肪和/或含水组分、湿润剂、增稠剂、防腐剂、质地改进剂(texturing agent)、增味剂和/或涂布剂、抗氧化剂、防腐剂和食品领域(sector)中常规使用的染料。
[0100]用于口服组合物，以及特别地用于食品补充剂的制剂和赋形剂是本领域已知的，且不是本文中详细描述的主题。
[0101]在治疗应用中，以足以至少部分治愈或者抑制疾病及其并发症的症状的量施用组合物。将足够实现该目的的量定义为“治疗有效剂量”。用于该目的有效量取决于本领域技术人员已知的许多因素，例如疾病的严重性和患者的体重和一般状态。
·[0102]在预防性应用中，以足以至少部分降低发展成疾病的风险的量将根据本发明的组合物施用给对易感染特定疾病或者另外地处于特定疾病风险的患者。将此种量定义为“预防有效剂量”。同样，精确的量取决于患者特异的多种因素，例如患者的健康状态和体重。
[0103]本发明组合物以治疗或预防有效量包含本发明约氏乳杆菌菌株CNCM 1-1225的至少一种天然衍生物和/或无细胞培养上清液。
[0104]本领域技术人员能相应地调整剂量。
[0105]例如，组合物可以以每日剂量106_1012cfu，例如108_1010cfu的量包含根据本发明的约氏乳杆菌菌株CNCM 1-1225。
[0106]以前的工作还显示，可以将非复制性约氏乳杆菌CNCM 1-1225用于治疗或预防与免疫系统相关的疾病包括感染，参见WO 2010/133475，将其全部并入本文作为参考。发现，约氏乳杆菌CNCM 1-1225强烈地诱导了组成型hBDl表达，并且与约氏乳杆菌CNCM 1-1225活的对应物相比，经热处理的约氏乳杆菌CNCM 1-1225更强烈地上调hBDl。
[0107]因此，根据本发明的约氏乳杆菌菌株CNCM 1-1225还可以以非复制的形式存在。
[0108]约氏乳杆菌菌株CNCM 1-1225的“非复制性”天然衍生物包括已经受到热处理的衍生物。这包括灭活的、死的、无生活力的和/或以碎片如DNA、代谢物、胞质化合物和/或细胞壁物质存在的约氏乳杆菌菌株CNCM 1-1225的天然衍生物。
[0109]“非复制性”指的是通过经典的平板接种方法可以检测的无生活力的细胞和/或菌落形成单位。在微生物书中概述了这些经典的平板接种方法:James Monroe Jay, MartinJ.Loessnerj David A.Golden.2005.Modern food microbiology.7th edition, SpringerScience, New York, N.Y.790p。通常地,存活细胞的缺失可以按照以下显示:用不同浓度细菌制备物(“非复制”的样品)接种并且在适合的条件(有氧和/或厌氧空气中持续至少24小时)下培育后，在琼脂平板上没有可见的菌落或者在液体生长培养基中没有增加的浊度。显而易见，非复制性微生物不会形成菌落，因此，应将该术语理解为从106-1012cfu/g可复制的细菌获得的的非复制的微生物的量。
[0110]组合物还可以以每日剂量0.005mg - 5000mg,例如0.5mg-50mg的量包含根据本发明的约氏乳杆菌菌株CNCM 1-1225的天然衍生物。
[0111]本领域技术人员应当理解，在不背离所公开的本发明范围的情况下，他们可以自由地组合本文中所述的本发明的全部特征。特别地，可以将用于描述本发明的用途的特征应用于本发明的食品，反之亦然。
[0112]本发明的其他优点和特征从以下实施例和附图中是显而易见的。
[0113]图1显示了用甲磺酸乙酯处理的约氏乳杆菌CNCM 1-1225的‘存活曲线’。
[0114]图2显示了从G碱基的氧化到DNA链的分离的天然突变的分子过程，其产生了亲本和经修饰的DNA类型的混合物，以及混合的亲本和经修饰的克隆。
[0115]图3显示约氏乳杆菌CNCM 1-1225D-乳酸脱氢酶基因的基因序列(SEQ ID N0:1),并圈出了经鉴定的在约氏乳杆菌CNCM 1-4434和约氏乳杆菌CNCM 1-4441中的相应基因中的改变。还显示了由于约氏乳杆菌CNCM 1-4434和约氏乳杆菌CNCM 1-4441的相应改变而翻译的D-乳酸脱氢酶(SEQ ID NO:2)。
[0116]图4A显示约氏乳杆菌CNCM 1-4434D-乳酸脱氢酶基因的基因序列(SEQ IDN0:6)，框出位置611处的碱基并且与亲本菌株约氏乳杆菌CNCM 1-1225相比所述碱基(C)发生改变。`
[0117]图4B显示约氏乳杆菌CNCM 1-4434D-乳酸脱氢酶基因的蛋白质序列(SEQ IDNO:8)，框出位置204处的氨基酸并且与亲本菌株约氏乳杆菌CNCM 1-1225相比所述氨基酸
(S)发生改变。
[0118]图5A显示约氏乳杆菌CNCM 1-4441D-乳酸脱氢酶基因的基因序列(SEQ IDNO:7)，框出位置458处的碱基并且与亲本菌株约氏乳杆菌CNCM 1-1225相比所述碱基(G)发生改变。
[0119]图5B显示约氏乳杆菌CNCM 1-4441D-乳酸脱氢酶基因的基因序列(SEQ IDNO: 9)，框出位置153处的氨基酸并且与亲本菌株约氏乳杆菌CNCM 1-1225相比所述氨基酸发生改变(G)。
[0120]实施例1.用甲磺酸乙酯处理约氏乳杆菌CNCM 1-1225培养物。用Dulbecco’s磷酸缓冲盐水洗涤100 μ I含大约108个菌落形成单位的16个小时的约氏乳杆菌CNCM 1-1225培养物的样品3次。最后，将细胞悬浮在Iml PBS中，加入O、10 μ I甲磺酸乙酯并在37°C，在没有振荡的情况培养。在PBS中洗涤经处理的细胞2次，测定经处理的和未处理培养物的CFU，并对存活者作图，以产生图1中所述的‘存活曲线’。最初靶向了产生1%存活者的条件并包括(bracket)之前和之后的时间点，稀释细胞，并在MRS平板上将细胞接种为单个菌落。然后，剩余的经处理的细胞用于接种10ml MRS肉汤，并在37°C培养16小时。然后，稀释培养物，并铺展在MRS平板上，以产生用于筛选的单个菌落。[0121]如图2中所示，当通过DNA复制解析时，在细菌中，主要通过双链DNA中鸟苷(G)残基的氧化，天然地发生突变，通常产生单碱基对改变。取决于所测序的DNA链，这导致G至腺苷(A)和胞苷(C)至胸苷(T)改变的天然突变谱。甲磺酸乙酯起着化学氧化G碱基的作用，导致与天然突变相同的突变谱，即取决于所测序的DNA链，产生G至A和C至T的突变。这随后通过D-乳酸脱氢酶基因和基因组序列的DNA测序进行了确证，其中大多数观察到的改变都是G至A或C至T。
[0122]实施例2.筛选缺失D-乳酸产生菌株的各个菌落。将经甲磺酸乙酯处理的各个菌落接种到含200 μ I MRS肉汤的96孔板中，并在37°C培养24小时，以形成最小的培养物。使用Tecan sunrise酶标仪(microplate reader),通过620nm处的吸光度估计培养物的生长。将10 μ I的培养上清液与190 μ I反应混合物混合，在室温温育I小时，所述反应混合物含IOOmM Tris HCl pH9,2.5mM EDTA pH8.0，20U/ml D-乳酸脱氢酶(来自肠膜明串珠菌(Leuconostoc mesenteroide)), lmg/ml NAD ( β -烟酰胺腺嘌呤二核苷酸)加上 3% 水合肼(hydrazinium hydroxide)。然后使用 Tecan sunrise 酶标仪测量 320nm(形成 β-NADH)的吸光度，并将数据输出至excel用于分析。在每一平板上，将仅含MRS的对照和含5%、25%、50%或100%浓度的约氏乳杆菌CNCM 1-1225培养上清液作为归一化数据的标准。
[0123]进行分离的菌落的表型分析，以确定培养后培养基中D-乳酸的存在或者不存在。当筛选各个菌落中的D-乳酸的存在时，还清楚的是含有50%的D-乳酸产生者和50%的非D-乳酸产生者的‘混合’培养物将导致培养物为D-乳酸存在的‘阳性’。因此，认为我们靶向的D-乳酸缺失表型为D-乳酸产生表型的‘隐性’。这是重要的，当我们将图2中所示的诱变的示意图考虑为单个氧化的G碱基时，会导致最终的菌落为亲本和改变个体的混合物，因此在表型上为D-乳酸阳 性。在这种情况下，对于分离缺失D-乳酸产生的菌株，在甲磺酸乙酯处理后在MRS肉汤中的培养是必要的。筛选了大约21，000个经甲磺酸乙酯处理的单个菌落后，分离了 15个缺失D-乳酸产生的菌落，并进行了进一步分析。
[0124]实施例3.测定培养基中D-乳酸水平。在37°C，在MRS肉汤中培养培养物16个小时，并通过离心去除细菌。为了测定D-乳酸浓度，将无细胞培养上清液稀释于水中，如上所述进行分析，并将所述结果与用D-乳酸钠稀释液制备的标准曲线相比较。通过用兔肌肉L-乳酸脱氢酶交换D-乳酸脱氢酶，并使用L-乳酸钠作为标准，以相同的方式测定L-乳酸浓度。对CNCM 1-4431和CNCM 1-4434进行的这种分析的结果显示于表1中，并且包括了对照:约氏乳杆菌CNCM 1-1225、具有GMO失活的D-乳酸脱氢酶基因的约氏乳杆菌NCC9006，以及认为是L-乳酸产生菌株的类干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei )NCC2461和鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)NCC4007。
[0125]类干酪乳杆菌NCC2461 (登记号=CNCM 1-2116)于1999年I月12日在布达佩斯条约下保藏于CNCM (地址已经提及)。鼠李糖乳杆菌NCC4007 (登记号:CGMCC1.3724)于2004年10月在布达佩斯条约下保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心(China GeneralMicrobiological Culture Collection Center)(CGMCC),微生物学研究所(Institute ofMicrobiology),中国科学院(Chinese Academy of Sciences),北辰西路(West BeichenRoad) I 号，朝阳区(Chaoyang District),北京 100101,中国。如在 Lapierre 等人，标题为“D-Lactate Dehydrogenase Gene (IdhD) Inactivation and Resulting MetabolicEffects in the Lactobacillus johnsonii Strains Laland N312:(Appl.Environ.Microbiol.1999,65 (9):4002)的文章中所述，约氏乳杆菌NCC9006是来源于约氏乳杆菌Lal的菌株。
[0126]表1.从无细胞培养物中测定的CNCM 1-1225、CNCM 1-4431和CNCM 1-4434的D-和L-乳酸的值。对照包括菌株NCC9006 (具有GMO失活的D-乳酸脱氢酶基因的约氏乳杆菌菌株)、认为是L-乳酸产生菌株的类干酪乳杆菌NCC2461和鼠李糖乳杆菌NCC4007。实验一式三份地进行，并表示为平均值加上括号内的标准差。
[0127]
【权利要求】
1.约氏乳杆菌菌株CNCM1-1225的天然衍生物，其中所述约氏乳杆菌菌株CNCM1-1225的衍生物缺失D-乳酸产生。
2.权利要求1的约氏乳杆菌菌株CNCM1-1225的天然衍生物，其中所述约氏乳杆菌菌株CNCM 1-1225的天然衍生物的D-乳酸脱氢酶序列在氨基酸位置153处包含甘氨酸至天冬氨酸的氨基酸改变和/或在氨基酸位置204处包含丝氨酸至亮氨酸的氨基酸改变。
3.权利要求1或权利要求2的约氏乳杆菌菌株CNCM1-1225的天然衍生物，其中所述约氏乳杆菌菌株CNCM 1-1225的天然衍生物中的D-乳酸脱氢酶基因的核酸序列在核酸位置498处包含G至A的转变和/或在核酸位置651处包含C至T的转变。
4.权利要求1-3中任一项的约氏乳杆菌菌株CNCM1-1225的天然衍生物，其选自约氏乳杆菌菌株CNCM 1-4434和约氏乳杆菌菌株CNCM 1-4441。
5.权利要求1-4中任一项的约氏乳杆菌菌株CNCM1-1225的天然衍生物，其中所述约氏乳杆菌菌株CNCM 1-1225的天然衍生物以生物学上纯的培养物存在。
6.无细胞培养上清液，其分离自权利要求1-4中任一项的约氏乳杆菌菌株CNCM1-1225的天然衍生物的生物学上纯的培养物。
7.包含权利要求1-5中任一项的约氏乳杆菌菌株CNCM1-1225的天然衍生物和/或权利要求6的无细胞培养上清液的组合物的用途，用于制备在通过治疗处理人体或动物体的方法中使用的组合物。
8.包含权利要求1-5中任一项的约氏乳杆菌菌株CNCM1-1225的天然衍生物和/或权利要求6的无细胞培养上清液的组合物的用途，用于治疗或预防与减弱的免疫系统相关的病症。
9.权利要求8的组合物的用途，其中所述与减弱的免疫系统相关的病症选自流感、鼻炎、普通感冒及其组合。
10.包含权利要求1-5中任一项的约氏乳杆菌菌株CNCM1-1225的天然衍生物和/或权利要求6的无细胞培养上清液的组合物的用途，用于治疗或预防与肠道毒性细菌或病毒的细胞附着和细胞入侵相关的疾病。
11.权利要求10的组合物的用途，其中所述与肠道毒性细菌或病毒物种的细胞附着和细胞入侵相关的疾病选自下呼吸道感染、胃肠道感染、中耳炎及其组合，并且其中所述肠道毒性物种优选地选自沙门氏菌属(Salmonella);弯曲杆菌属(Campylobacter);利斯特氏菌属(Listeria);大肠杆菌菌株，如ETEC、EHEC, EPEC或EIEC菌株；耶尔森氏菌属(Yersinia);志贺氏菌属(Shigella);产毒素细菌，如金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、肉毒梭状芽胞杆菌(Clostridium botulinum)或腊状芽抱杆菌(Bacilluscereus) ；Vibrio vulnifucus/parahaemoIyticus (副溶血弧菌);轮状病毒属(rotavirus);诺瓦克病毒(norovirus)；肠出血型大肠杆菌(verotoxigenic E.coli)；阪崎肠杆菌(Enterobacter sakazakii);产毒的产气荚膜梭菌(toxigenic C.perfringens) (A 型和B型)；食源性寄生虫，如棘球蝴(Echinococcus)、弓形体(Toxoplasma)或贾第虫属(Giardia);幽门螺杆菌(Helicobacter pylori);艰难梭菌(Clostridium difficile);破伤风梭菌(Clostridium tetani)及其组合。
12.权利要求7-11中任一项的组合物的用途，其中所述组合物选自食品组合物、宠物食品组合物、饮料、乳制品、营养制剂、婴儿配方食品、食品添加剂、营养制品、药物组合物、食品成分和/或化妆品组合物。
13.权利要求7-12中任一项的组合物的用途，其中所述组合物选自酸化的乳制品，例如酸奶或酸奶饮料；或者基于乳的粉末。
14.权利要求7-13中任一项的组合物的用途，其中所述组合物以每日剂量IO6-1O12Cfu的量包含权利要求1-5中任一项的约氏乳杆菌菌株CNCM 1-1225的天然衍生物。
15.权利要求7-14中任一项的组合物的用途，其含有每日剂量约0.005mg - 5000mg权利要求1-5中任一项的约氏乳杆菌菌株CNCM 1-1225的天然衍生物。
【文档编号】C12N1/20GK103582698SQ201280025966
【公开日】2014年2月12日 申请日期:2012年3月29日 优先权日:2011年3月29日
【发明者】R-D·普里德莫尔, F·法塔, M·戴雷, I·扬科维奇 申请人:雀巢产品技术援助有限公司