专利名称：一种面包乳杆菌菌株及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种微生物菌株，特别涉及一种面包乳杆菌菌株及其应用。
背景技术：
皂苷的毒性主要表现为溶血性，一般认为，溶血性是其苷元可以与红细胞壁上胆甾醇结合生成不溶于水的复合物沉淀，破坏细胞渗透压，使红细胞发生崩解，进而导致溶血现象。皂苷有无溶血活性与皂苷元有关，活性强弱与糖分子的大小、糖分子之间的连接、糖分子上的取代基等有关，此外还与皂苷的浓度有关。 茶皂素的结构如附图I所示，属于三萜类皂苷，由糖体、配基和有机酸组成。从分子结构看，茶皂素是一种非离子表面活性剂。其亲水基团是强电负性的含氧基团组成，这些基团集中在茶皂素的糖体配体，有机酸配体及皂苷配基的连接部位，构成亲水部分。其中配基是由非极性的碳氢环链构成，在水溶液中呈现憎水的倾向，成为亲油的主体，所以茶阜素的结构分为亲水和亲油两部分。Sobolewska等在发表于2010年9月(9卷,3期)《Phytochemistry Review》(植物化学评论)425-474 页的《Saponins as cytotoxicagents a review》(综述阜苷一细胞毒素)一文中称利用酶解法去除阜苷的糖体配体，会降低皂苷的溶血性。酶水解工业化应用成本较高，如能利用微生物发酵来降低茶籽柏的毒性，将更有工业化应用前景。
发明内容
本发明的目的在于提供一种面包乳杆菌菌株，以及利用该菌株进行茶籽柏固态发酵脱毒的方法，经发酵脱毒后的茶籽柏溶血作用明显下降，降低了茶籽柏的毒性。为解决上述问题，本发明采用以下技术方案一种面包乳杆菌菌株，所述菌株的分类命名为面包乳杆菌(Lactobacilluscrustorum)，保藏编号为CGMCC No. 6304,保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏单位地址为北京市朝阳区北辰两路I号院3号中国科学院微生物研究所，保藏日期为2012年6月28日。所述面包乳杆菌菌株的16s rDNA碱基序列如SEQ ID NO 1所示。本发明还公开了所述面包乳杆菌菌株的筛选和应用于茶籽柏发酵脱毒的方法，包括以下步骤I、种子培养将所述面包乳杆菌菌株于MRS固体培养基上涂布，然后于37°C厌氧培养2-3天，挑取单菌落接种到种子培养基中，继续37°C培养24h，使菌液的0D_值达到
0.8，备用，所述种子培养基成分为蛋白胨10. 0g，牛肉膏10. 0g，酵母抽提物5. 0g，纤维二糖 20. Og,吐温-80lml，柠檬酸三铵 2. 0g，K2HP042. 0g，MgSO4 ·7Η20 0. 2g，MnSO4 ·2Η20 0. 05g，蒸懼水1000ml。2、茶籽柏9g，加入含葡萄糖I. 5% (w/w)、半乳糖I. 5% (w/w)和硫酸铵2% (w/w)的pH5. O的磷酸盐缓冲溶液7. 2ml，混合均匀后高压灭菌备用，得到未发酵的固体培养基。
3、按接种量10% (菌液/茶籽柏，ml/g)将步骤I中经种子培养后的所述面包乳杆菌菌株接种于步骤2所述未发酵的固体培养基中，固液比I : 0.8( 八)，371发酵3611，得发酵的固体培养基。4、茶籽柏发酵脱毒往步骤3中所述发酵的固体培养基中加入50ml70% (v/v)乙醇，80°C振摇4h，抽滤，滤液旋转蒸发浓缩，浓缩至干，将所得产物称重并用生理盐水配制成100 μ g/ml的茶皂素固形物溶液A，备用；往步骤2中所述未发酵的固体培养基中加入50ml70% (v/v)乙醇，80°C振摇4h，抽滤，滤液旋转蒸发浓缩，浓缩至干，将所得产物称重并用生理盐水配制成100 μ g/ml的茶皂素固形物溶液B，作为对照，备用。5、溶血实验验证发酵效果(I)取血将肝素钠和装有生理盐水的盛血容器置于冰箱中冷藏15min以上；用75% (v/v)酒精对动物的取血部位进行消毒；用一次性注射器吸取少量的肝素钠溶液，抗凝Iml血液不少于15IU肝素钠；用注射器从动物静脉中取血后，去除针头，将血慢慢推到装有冰生理盐水的试管中，制得血样。·(2)血样处理将所述血样于4°C冷冻离心，300rmp/5min ;离心后去除上清液，保留沉淀，再加入少量4°C生理盐水，用移液枪轻吹，使血溶解；重复本步骤至所述血样上清无色，然后用生理盐水稀释到2% (v/v)，得稀释后的血样。(3)溶血实验分别取所述茶皂素固形物溶液A和B各40μ 1、60μ 1、80μ I、100μ I和120 μ 1，分别用生理盐水定容至500 μ 1，再分别加入500 μ I所述稀释后的血样，37°C溶血Ih，IOOOOrpm离心5min，从各管中取上清液600 μ 1，混匀后，于540nm测定OD，空白对照为500 μ I生理盐水和500 μ I所述稀释后的血样的混合液。本发明的优点是利用面包乳杆菌发酵的茶籽柏溶血作用明显下降，降低了茶籽柏的毒性，从而弥补了茶籽柏在冷血动物饲料应用方面的不足。
图I为茶皂素结构图Rp R2 :反(侧)白芷酸和醛酸；R1 = CHO, CH2OH, CH3 ；R2 = CHO, CH3。图2为发酵前后茶籽柏提取物的溶血效果。
具体实施例方式实施例I :I.配制培养基平板培养(MRS固体培养基)蛋白胨lO.Og，牛肉膏lO.Og，酵母抽提物5.0g，葡萄糖 20. Og,吐温-801ml,乙酸钠 5g，柠檬酸三铵 2. 0g, K2HP042. 0g, MgSO4 · 7Η20 0. 2g，MnSO4 · 2H20 0. 05g，碳酸隹丐IOg,琼脂15g,蒸懼水1000ml。121°C灭菌，倒平板。种子培养蛋白胨10.0g，牛肉膏10. 0g，酵母抽提物5. 0g，纤维二糖20. Ogji:温-801ml，柠檬酸三铵 2. Og, Κ2ΗΡ042· 0g, MgSO4 · 7Η20 0. 2g，MnSO4 · 2H20 0. 05g,蒸馏水IOOOml02.茶籽柏固态发酵
取100 μ L保藏号为CGMCC No. 6304的面包乳杆菌菌液，于MRS固体培养基上涂布，将涂布好的平板37°C厌氧培养2-3天，挑取单菌落接种到种子培养基中，继续37°C培养24h，使菌液的OD6tltl值达到O. 8，备用。取部分脱去茶皂素的茶籽柏(含2. 3% (w/w)茶皂素)9g，加入7. 2ml的pH5. O磷酸盐缓冲溶液(添加葡萄糖I. 5% (w/w)、半乳糖I. 5% (w/w)、硫酸铵2% (w/w))。搅拌均匀后12rC，15min高压灭菌，备用，得到未发酵的固体培养基。在超净台中移取O. 9ml经种子培养后的菌液于上述未发酵的固体培养基中，搅拌均匀，真空脱气，密封，置于37°C恒温培养36h，得发酵的固体培养基。3.提取茶皂素 往发酵的固体培养基中加入50ml 70% (v/v)乙醇，80°C振摇4h，抽滤，滤液旋转蒸发浓缩，浓缩至干，将所得产物称重并用生理盐水配制成茶皂素固形物浓度为100 μ g/ml的溶液A，备用；往未发酵的固体培养基中加入50ml 70% (v/v)乙醇，80°C振摇4h，抽滤，滤液旋转蒸发浓缩至干，将所得产物称重并用生理盐水配制成茶皂素固形物浓度同样为100 μ g/ml的溶液B，作为对照，备用，所述茶皂素的结构如图I所示。4.溶血实验验证发酵效果(I)取血将肝素钠和装有生理盐水的盛血容器置于冰箱中冷藏15min以上；用75% (v/v)酒精对动物取血部位进行消毒；用一次性注射器吸取少量的肝素钠溶液，抗凝Iml血液不少于15IU肝素钠；用注射器从动物静脉中取血后，去除针头，将血慢慢推到装有冰生理盐水的试管中。(2)血样处理将血样于4°C冷冻离心，300rmp/5min ;离心后去除上清液，保留沉淀，再加入少量4°C生理盐水，用移液枪轻吹，使血溶解；重复上述实验至血样上清无色，将血样用生理盐水稀释到2% (v/v)，得稀释后的血样。(3)溶血实验分别于上述稀释后的血样500 μ I中分别添加上述溶液A和B各40μ 1、60μ 1、80μ 1、100μ I和120 μ 1，用生理盐水补充至总体积为1ml，于37°C溶血Ih后，IOOOOrpm离心5min,从各管中取上清液600 μ I，混匀后，于540nm测定0D,空白对照为500 μ I生理盐水和500 μ I所述稀释后的血样的混合液。OD表示被检测物吸收掉的光密度。纤细胞溶血量越高，则离心后的血样颜色越深，血样的OD54tl越高，因此可以用OD值来反应溶血量。计算半数溶血量(HD5tl),即表示在规定时间内，通过茶皂素作用，使一定量的血红细胞半数破裂所需最小茶皂素的量。即OD54tl值达到完全溶血时的50%时所需要茶皂素的量。实验结果如附图2所示。从图上可明显看出发酵后的茶籽柏溶血效果有明显降低，未发酵茶籽柏的HD5tl为7. 96 μ g，发酵后的茶籽柏的HD5tl为13. 18 μ g，发酵前后HD5tl值增加了 65. 58%oHD50 = (13. 18-7. 96) /7. 96 X 100%= 65. 58 %。
权利要求
1.一种面包乳杆菌菌株，其特征在于，所述菌株的保藏编号为CGMCCNo. 6304。
2.如权利要求I所述的面包乳杆菌菌株在茶籽柏发酵脱毒中的应用。
3.一种应用权利要求I所述的面包乳杆菌菌株进行茶籽柏发酵脱毒的方法，包括以下具体步骤 (1)种子培养将所述面包乳杆菌菌株进行种子培养，使菌液的0D_值达到O.8，备用； (2)按固液比I: O. 8(w/v)往茶籽柏中加入含葡萄糖I. 5% (w/w)、半乳糖I. 5% (w/w)和硫酸铵2% (w/w)的pH5. O的磷酸盐缓冲溶液，混合均匀后高压灭菌备用，得到未发酵的固体培养基； (3)将经种子培养后的所述面包乳杆菌菌株接种于(2)中所述未发酵的固体培养基中，37 °C发酵36h，得发酵的固体培养基； (4)茶籽柏发酵脱毒往(3)中所述发酵的固体培养基中加入乙醇，80°C振摇4h，抽滤，滤液旋转蒸发浓缩，浓缩至干，制得脱毒的茶籽素。
4.如权利要求3所述的方法，其中所述种子培养的具体操作为将所述面包乳杆菌菌株于MRS固体培养基上涂布，然后于37°C厌氧培养2-3天，挑取单菌落接种到种子培养基中，继续37°C培养24h，使菌液的OD6tltl值达到O. 8，备用，所述种子培养基成分为蛋白胨10. Og，牛肉膏10. Og，酵母抽提物5. Og，纤维二糖20. 0g，吐温-801. 0ml，柠檬酸三铵2. Og,Κ2ΗΡ042· Og, MgSO4 · 7Η20 O. 2g, MnSO4 · 2H20 0. 05g，蒸馏水 1000ml。
5.如权利要求3所述的方法，其中(3)中所述菌株的接种量为10%(ml/g)。
6.如权利要求3所述的方法，其中(4)中所述乙醇的浓度为70%(v/v)。
全文摘要
本发明涉及一种面包乳杆菌菌株及其应用，所述的菌株面包乳杆菌(Lactobacillus crustorum)，保藏编号为CGMCC No.6304，本发明还涉及将所述菌株用于茶籽粕的固态发酵脱毒的方法，具体步骤为(1)斜面培养；(2)种子培养；(3)固态发酵；本发明的有益效果是利用面包乳杆菌发酵的茶籽粕溶血作用明显下降，降低了茶籽粕的毒性，从而弥补了茶籽粕在冷血动物饲料应用方面的不足。
文档编号C12N1/20GK102965301SQ20121035913
公开日2013年3月13日 申请日期2012年9月24日 优先权日2012年9月24日
发明者张建华, 尹丽茸, 黄蓓, 吴秉宇, 李双双, 林立 申请人:上海交通大学, 福建天生农业股份有限公司