专利名称：：源于德氏乳杆菌的质粒的制作方法该发明涉及一种来源于德氏乳杆菌(Lactobacillusdelbrueckiisp.)的新质粒，一种包含上述质粒的重组载体，被上述质粒和/或载体转化的微生物，以及该质粒和/或载体转化微生物的应用。一个对机体成功的生物转化必须满足下列三个原则1.用于转化的DNA必须通过诸如电转化，无机离子处理，原生质体融合等物理的或者化学的方法被导入有机体。2.应用一种或一种以上的选择标记，如以与转化DNA连锁的抗生素抗性基因为标记，使转化体能够从非转化细胞群体中被选择出来。无论是通过从该靶宿主分离某种抗生素抗性基因，还是设计一种已知的带有为靶宿主相容的表达顺序(启动子和终止区)的抗性基因，这个目的将会被很好地实现。3.转化的DNA必须被复制(自主地或者作为宿主基因组的一部分)。通过从被转化的宿主分离复制的质粒，然后在微生物，如大肠杆菌(E.Coli)或乳球菌(LC.lactis)，及其一种特殊的靶机体如德氏乳杆菌保加利亚亚种(L.bulgaricus)中构建复制型载体，就能很好地实现此目的。国际专利申请WO92/14825描述了从德氏乳杆菌保加利亚亚种M-878菌株中分离得到的长度大约为7.9kb质粒pBULI及其衍生质粒。这种质粒的限制性酶谱的特征为缺少BamHI、EcoRI、KpnI及PstI限制性酶位点。这种质粒被用作培育各种微生物如乳酸细菌(Lacticacidbacteria)的载体;它的衍生质粒被用作(乳酸细菌和大肠杆菌之间的)一种穿梭载体。其它穿梭载体，在CanadianJournalofMicrobio-logy(Vol.38(1992)pp.69-74)，ACTAMICROBI-OLOGICABULGARICA(Vol.27(1991)pp.3-8)，及日本专利申请JP-A-4.218.381中有所描述。本发明的目的在于提供一种新的来源于德氏乳杆菌的质粒，该质粒能被用来转化特异的微生物，尤其是保加利亚乳杆菌，(Lactobacillusbulgaricus)。本发明的另一个目的是获得一种包含上述质粒的重组载体，此种载体能够在大肠杆菌和乳酸乳球菌中复制，并且能够转化特异的微生物，尤其是保加利亚乳杆菌。本发明涉及一种来源于德氏乳杆菌的新质粒，至少包括如图1所示的限制性图谱或它的某些部分。本发明的质粒至少包括DNA序列SEQIDNO.1和/或它的互补链，或者它的某些部分。而且，该发明涉及一种包含本发明质粒的重组载体，它至少有一能够在大肠杆菌和/或在乳酸乳球菌中复制的DNA顺序，并且至少有一选择标记。此能够在大肠杆菌和/或乳酸乳球菌中复制的DNA顺序，用一个特异的质粒来构建，如pDP193，此质粒允许重组载体在大肠杆菌或者乳酸乳球菌中自由扩增以便于分子操作。依据本发明，包含在重组载体中的选择标记是一段被用作分析之用的参考DNA片段(如一个已知表型和定位的基因)，并且它是一段能够在被该载体转化的微生物中表达的DNA片段。此DNA片段也可用来转化微生物，以获得下列结果-噬菌体的耐受菌株，-粘液菌株(改良结构特性)，-前生命期的菌株(Probioticstrains)，-产生新的或改良的酶(脂酶，脱氢酶等)，产生芳香化合物等的菌株。本发明也涉及被该质粒和/或重组载体转化的微生物，优选保加利亚乳杆菌。最后，本发明涉及该质粒和/或载体转化微生物的应用。图1表示德氏乳杆菌的质粒PN42的限制性酶谱。图2表示从pJDC9质粒和PN42质粒构建的质粒PN42-SubCB的结构。图3表示从质粒pJDC9和pN42构建的质粒pN42-SubCE的结构。图4表示从质粒pUC19和pN42构建的质粒pN42-SubW和pN42-SubX的结构。图5表示质粒pDP352的氯霉素乙酰基转移酶基因的结构。图6表示质粒pDP193的结构。图7表示质粒pDP359的结构。依据本发明，作为大肠杆菌/乳酸乳球菌和德氏乳杆菌之间的穿梭载体，质粒pDP359的结构具有如下特征第一，pDP193的掺入使质粒在大肠杆菌或乳酸乳球菌中自由扩增以便于分子操作，例如基因的附加物在德氏乳杆菌保加利亚亚种中被表达。第二，如此完整地包含了德氏乳杆菌的质粒，能够保证质粒pDP359拥有pN42复制所必需的全部顺序，并且保证质粒pDP359以pN42在其宿主N42体内同样的方式在保加利亚乳杆菌中进行复制。第三，设计在pDP352中的氯霉素抗性基因能够保证有一种手段在德氏乳杆菌保加利亚亚种中选择转化体。分析来自Nestlé培养物保藏中心的五十多个德氏乳杆菌菌株，确定一株，N42，包含一个染色体外的复制型质粒。此质粒被命名为pN42(其限制性酶谱如图1所示)，并被选作分析，因为它包含质粒在德氏乳杆菌保加利亚亚种中复制必需的，由质粒编码的全部反式和顺式元件。通过API试验和与德氏乳杆菌的特异性探针的杂交试验(DelleyM.，MolletB.，和HottingerH.，1990，DNAprobeforL.delbrueckii，Appl.Environ.Microbiol，56∶1967-1970)，N42作为一个德氏乳杆菌的菌株，其完备性得到证实。pN42质粒DNA是通过氯化铯溴化乙锭浮力密度梯度离心分离提取的，以便用于限制性酶谱分析和亚克隆。质粒pN42在几个确定的单一的限制性酶位点以完整的形式被克隆进大肠杆菌载体pJDC9(J.-D.ChenandD.A.Morrisson1987，CloningofStreptococcusPneumonlaeDNAFragmentsinEscherichiacoliRequiresVectorProtectedbyStrongTransciptionalTerminators，Gene55，179-187)在PstI位点克隆得pN42-SubCB，在AvrⅡ位点克隆得pN42-SubCE，或者被克隆到pUC/pK质粒，以进行DNA序列分析。pN42质粒DNA用限制性内切酶PstI酶切，然后与同样经PstI酶切并且脱磷酸的pJDC9载体混合，连接后转入大肠杆菌中。菌落用限制性酶酶切进行分析，得一阳性克隆命名为pN42-SubCB(如图2-所示)。pN42质粒DNA用限制性酶AvrⅡ酶切，然后与经XbaI酶切并且脱磷酸的pJDC9载体混合，连接后再转入大肠杆菌，菌落用限制性酶酶切分析，得一阳性克隆命名为pN42-SubCE(如图3所示)。pN42质粒DNA用限制性酶EcoRV和PstI双酶切，在琼脂糖凝胶上分离DNA片段，得到纯化的3.1kb和5.1kb两片段。两片段分别与经限制酶SmaI和PstI双酶切并且脱磷酸的pUC19载体混合，连接后转入大肠杆菌，菌落用限制性酶酶切分析，其阳性克隆分别命名为pN42-SubW和pN42-SubX(分别对应于5.1kb和3.1kb片段)，如图4所示。再以Pharmacia公司的TSequencing试剂盒和35SdATP为材料，应用双脱氧链终止反应在双链上合成寡核苷酸引物，进行亚克隆，测定其DNA序列，得pN42DNA全序列。pN42为环状双链质粒，由8140对碱基组成，根据GCG库中计算机“读码框架”程序确定pN42至少包含编码50个或更多氨基酸的五个开放读码框架(ORF1-ORF5)，[计算机软件来自GeneticsComputerGroupInc.(GCG)，DevereuxJ.，HaeberliP.andSmithiesO.(1984)，AcomprehensivesetofsequenceanalysisprogramsfortheVAX.NucleicAcideRes.12∶387-395]。计算机“重复”程序确定一个直接重复三次的21对碱基，它可能是复制的起点。pN42的限制性酶谱如图1所示，其DNA全序列见序列表1(SEQIDNO.1)。pN42的DNA序列分析，使基因组的结构特征得到了明确，这些特征对于质粒在德氏乳杆菌体内的复制可能是重要的。同时也明确了穿梭载体的结构，它完整地保留这些特征(通过在下列限制性位点AVrⅡ、NsiI、SphI克隆pN42可以获得基因的一般特征，来自德氏乳杆菌的Nb质粒DNA仅仅在五个SphI位点中的一个位点被切割，即在7882bp处)。这就能保证，当被转入德氏乳杆菌保加利亚亚种菌体后，上述穿梭载体能够得到复制。可以断定，由某一确定的抗性基因决定的抗生素抗性可以传导给任何其它的生物体，如果它包含有合适的翻译/转录的控制信号的话。因此，明确的革兰氏阳性氯霉素抗性基因[氯霉素乙酰基转移酶(CAT)来自金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)]来自具有广泛宿主范围的质粒pNZ12(W.M.deVos.198)GeneCloningandExpressioninLacticstreptococci，FEMSMicrobiol，Review，46，281-295)，并用其构造一个完整的来自Lac-Z操纵子的德氏乳杆菌保加利亚亚种的启动子(P.Leong-Morgenthaler，M.C.ZwahlenandH.Hottinger，1991，LactoseMetabolisminLactobacillusbulgaricusAnalysisofthePrimaryStructuneandExpressionoftheGenesInvolved，J.Bacteriol.，173，1951-1957)。其下游接一个乳酸乳球菌菌株NCDO2054的乳糖一半乳糖操纵子的革兰氏阳性茎-环状终止子。其完整的结构如图5所示。质粒pKN19为大肠杆菌克隆载体pK19(R.D.Pridmore，1987，NewandVersatileCloningVectorswithKanamysin-Resistance，Gene，56，309-312)，在此，其非必需区的单一BspHI限制性酶位点经限制性酶切被破坏，其末端突出的四个碱基用四种单核苷酸和Klenow酶修复(T.Maniatis，E.F.FritchandJ.Sawbrook，Molec-ularCloningalaboratorgmanual，ColdSpringHarborLaboratory，ColdSprinyHarbor，NV，1982)。pNZ12的氯霉素抗性基因用PCR抗增得到(SaikiR.K.，GelfandD.H.，StoffelS.，ScharfS.J.HiguchiR.，HornG.T.，MullisK.B.，andEhrlichH.A.1988，primer-directedenzymaticamplif-icationofDNAwithathermostableDNAPolgmerase.Sciencc，239∶487-491;SalkiR.K.，ScharfS.，FaloonaF.，MullisK.B.，HornG.T.，EhrlichH.A.andArnheimN.，1985，Enzymaticamplificationofβ-globingenomicsepueucesandRestrictionsiteanalysisfordiagnosisofsicklecellanemia，Science230∶1350-1354)，其中使用突变引物A(5＇-AGGAGGATCCTCTCATGAACTTTAATAAAATTG)，其引进一个BspHI限制性位点与CAT基因的起始密码ATG重叠，和引物B(5＇-TACAGTATCGATTATCTCATATATTATA)，其在CAT基因下游9bp处引进一个ClaI限制性位点。PCR扩增程序如下，50ng的BglⅡ酶切的pNZ12DNA，加寡核苷酸引物A和B各0.3μm、200μm的四种单核苷酸，PCR循环94℃0.5分钟-50℃0.5分钟-72℃0.5分钟，共30个循环。PCR扩增产物用限制性酶ClaI和BamHI双酶切，用琼脂糖凝胶回收并纯化660bp片段，然后把它克隆在已经ClaI和BamHI酶切并脱磷酸的大肠杆菌载体pBSKS+上(StratageneCorp.)。连接后的片段转入大肠杆菌，然后把转化菌铺在含有氨苄青霉素、5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-吡喃半乳糖苷(X-Gal)和异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)的LB平板上。用限制性酶酶切分析来筛选克隆，得一阳性克隆命名为克隆A(CloneA)。克隆A是一个氯霉素和氨苄青霉素双耐受株。克隆A用限制酶MfeI和StuI酶切并脱磷酸，此片段被来源于pNZ12等价CATMfeI-StuI酶切片段所置换，这将消除CAT基因内由PCR产生的突变，于是得到克隆B(CloneB)(此步在图5中没有表示出来)。克隆B再用限制性酶BamHI和ClaI酶切，用琼脂糖凝胶回收纯化660bp片段。pKN19/galT-末端就是在pKN19中包含有来自乳酸乳球菌NCDO2054的乳糖-半乳糖操纵子的终止子(作为SpeI-SacI限制性片段)，并且如上所述原pK19内部的BspHI酶位点已被消除。pKN19/galT-末端用限制性酶SfuI和SacI酶切(对此片段而言此两位点原就存在)，用琼脂糖凝胶纯化190bp的片段。混合上述两片段，再加上用限制性酶SacI和BamHI酶切并脱磷酸的载体pKN19，连接后转入大肠杆菌。克隆应用限制性酶酶切筛选，得一阳性克隆，命名为克隆C(CloneC)。已发表的德氏乳杆菌保加利亚亚种的lacS启动子被用来设计两个突变的寡核苷酸，引物C(5＇-ATTGGAAGAATTCACCAACGCTTTTCATTTC)在起始密码ATG上游240bp处引入一个EcoRI限制性酶位点。引物D(5＇-GGTGGTGACGAAGACGATA)引导lacS基因的ATG下游的110bp，lacS基因包含一个BspHI限制性酶位点与起始密码相重叠。PCR扩增按下列程序进行德氏乳杆菌基因组DNA100ng，加寡核苷酸引物C和D各0.3μM，再加四种单核苷酸200μM。PCR循环94℃0.5分钟-50℃0.5分钟-72℃0.5分钟，共进行30个循环。PCR产物用限制性酶EcoRI和BspHI酶切，用琼脂糖凝胶纯化250bp的片段。克隆C用限制性内切酶BspHI和SacI酶切，用琼脂糖凝胶纯化780bp的片段。把上述两片段连接到经EcoRI和SacI酶切并脱磷酸的pKN19载体上，转入大肠杆菌，把它铺在含有卡那霉素的LB平板上，克隆用限制性酶酶切分析来筛选，得一阳性克隆命名为pDP352，序列表2(SEQIDNO.2)为其DNA全序列。被组建在pDP352上的氯霉素抗性基因在完整的德氏乳杆菌保加利亚亚种从启动子开始被转录，此启动子在某宿主体内被组成性表达。此包括原启动子元件-35区和-10区，核糖体结合位点和氯霉素抗性基因起始密码ATG的相对位置与其和原lacS基因起始密码ATG的相对位置完全一致。这就能保证氯霉素抗性基因能在正确的位置上起始转录和翻译，并且能够保证抗性基因起作用。大肠杆菌和乳酸乳球菌的穿梭载体pDP193是从大肠杆菌载体pUC18[R.D.Pridmore，1987，NewandVersatileCloningVectorwithKaramycin-Resistonce，Gene，56，309-312)和质粒pVA749(F.L.Macrina，J.A.Tobian，K.R.JonesandR.P.Evans，MolecularCloningintheStreptococci，inAHallaender，R.DeMoss，S.Kaplan，S.Konisky，D.SavageandR.Wolue(Eds.)Geneticengineeringofmicqoorga-nismsforChemicals，Plenum，NewYork，1982，pp.195-210)构建而来。pVA749取自于嵌合质粒pVA838(F.L.Macrina，J.A.Tobian，B.R.Jones，R.P.EvansandD.B.Clewell，1982，ACloningVectorabletoReplicateinEscherichiacoliandStreptococcusSanguis，Gene，19，345-353)，其作为pVA838的一个HindⅢ限制性片段，并把它克隆到pUC18的HindⅢ位点。与pUC多克隆位点反向的第二个HindⅢ位点经Klenow酶末端修补而被消除。pUA749自身包含一个来源于粪链球菌(streptococcusfaecalis)的革兰氏阳性的质粒复制起点(在乳酸乳球菌体内能够复制)和来源于pAMβ1的红霉素抗性基因。pDP193的结构如图6所示。质粒pVA838用限制性酶HindⅢ酶切，用琼脂糖凝胶分离片段，并纯化5.2kb的pUA749片段。载体pUC18用HindⅢ酶切并脱磷酸，再与pVA749片段混合，连接后转入大肠杆菌。应用限制性酶酶切分析来筛选菌落，一阳性克隆被命名为克隆D(CloneD)。在有50μg/ml溴化乙锭存在下(M.Osterlund，H.Luthman，S.V.NilssonandG.Magnusson(1982)，Ethidiumbromide-inhibitedrestrictionendonucleasesCleaveonestrandofcircularDNA，Gene，20，121-125)，克隆D用HindⅢ酶切，用琼脂糖凝胶分离并纯化7.9kb的线性片段。在线性克隆D中由HindⅢ产生的末端突出的4个碱基，根据Maniatis等方法在有四种单核苷酸存在时被Klenow酶补齐(T.Maniatis，E.F.FritchandJ.Sambrook，MohecularCloningaCaboratorgmanual，ClodSpringHarborLaboratorg，ClodSpringHarbor，NY，1982)，再连接并转入大肠杆菌，菌落用限制性酶酶切分析，得一阳性克隆命名为pDP193。质粒pDP193用限制性酶SacI和EcoRI双酶切并脱磷酸。pDP352也用限制性酶SacI和EcoRI双酶切，用琼脂糖凝胶纯化1100bp的CAT基因。混合此两质粒，连结后被电转化到不含质粒的乳酸乳球菌菌株LMO230，以经霉素和氯霉素抗性来确定阳性菌落，再用限制性酶酶切确证。选择出阳性克隆，命名为pDP193-CAT352。pDP193-CAT352用限制性酶SseI和BamHI酶切并脱磷酸。质粒pN42-SubCE也用SseI和BamHI(两位点来自接头)酶切，用琼脂糖凝胶纯化9.3kb片段。混合这两个片段，连结后被电转化在乳酸乳球菌LMO230中。用限制性酶酶切来筛选克隆，得一阳性克隆，命名为pDP359，如图7所示。载体pDP359满足作为德氏乳杆菌保加利亚亚种的穿梭载体的要求，因为它能够在该宿主体内工作。它包含一个以德氏乳杆菌中分离并定性的完整的复制型质粒，加上一个在德氏乳杆菌保加利亚亚种启动子操纵下进行转录的氯霉素抗性基因。如此就能保证当被转入德氏乳杆菌保加利亚亚种体内时，上述质粒pDP359能够在其中复制。序列表关于序列SEQIDNO.1的信息(ⅰ)序列特征(A)长度8140bp(B)类型核酸(C)链式双(D)拓朴学环状(ⅱ)分子类型DNA(质粒)(ⅹⅰ)特征(ⅵ)来源保加利亚乳杆菌N42菌株(A)名称/关键质粒pN42(B)定位1～8140(Ⅺ)特征(A)名称/关键复制起点(B)定位5694～5758(Ⅺ)特征(A)名称/关键ORF1(B)定位1344～169(Ⅺ)特征(A)名称/关键ORF2(B)定位5965～7806(Ⅺ)特征(A)名称/关键ORF3(B)定位4718～5668(Ⅺ)特征(A)名称/关键ORF4(B)定位3116～3637(Ⅺ)特征(A)名称/关键ORF5(B)定位1779～2360关于序列SEQIDNO.2的信息(ⅰ)序列特征(A)长度1202bp(B)类型核酸(C)链式双(D)拓朴学线性(ⅱ)分子类型DNA(合成的)(ⅹⅰ)特征(ⅵ)来源保加利亚乳杆菌(A)名称/关键lacS启动子(B)定位1～239(ⅸ)特征(ⅵ)来源金黄色葡萄球菌(A)名称/关键氯霉素乙酰基转移酶肽(B)定位240～890(ⅸ)特征(ⅵ)来源乳酸乳球菌(A)名称/关键galT基因后的茎-环状终止子(B)定位903～1102权利要求1.来源于德氏乳杆菌(Lactobacillusdehorueckiisp.)的质粒，其至少包含如图1所示的限制性酶谱或者它的某些部分。2.根据权利要求1的质粒，其至少包含DNA序列SEQIDNO.1和/或它的互补链或它的某些部分。3.含有权利要求1或2的质粒的重组载体，其含有至少一种在大肠杆菌和/或乳酸乳球菌体内能够复制的DNA顺序，并且至少有一个选择标志。4.被权利要求1或2的质粒和/或被权利要求3的重组载体转化的微生物。5.被权利要求1或2的质粒和/或被权利要求3的重组载体转化的保加利亚乳杆菌(Lactobacillusbulgaricus)。6.权利要求1或2的质粒和/或权利要求3的重组载体转化微生物的用途。全文摘要本发明涉及一个来源于德氏乳杆菌的质粒，它至少包含如图1所示的限制性酶谱或者它的某些部分；一个包含上述质粒的重组载体，它至少包含一种能够在大肠杆菌和/或乳酸乳球菌体内复制的DNA顺序及至少一个选择标记。本发明还涉及被上述质粒和/或重组载体转化的微生物。文档编号C12N15/74GK1104253SQ9411571公开日1995年6月28日申请日期1994年8月25日优先权日1993年8月26日发明者B·莫莱特,D·普里德莫申请人:雀巢制品有限公司