一种快速鉴别胎儿弯曲菌和性病亚种的方法和试剂盒的制作方法
【专利摘要】本发明公开一种快速鉴别胎儿弯曲菌和性病亚种的方法和试剂盒。该方法通过以待检样品的基因组DNA为模板，在qPCR反应体系中还加入如SEQ?ID?NO.1、2、4和5所示的引物和如SEQ?ID?NO.3和6所示的探针进行双重实时荧光定量PCR，Ct值<35为阳性；35～40为可疑，需要重复试验一次；>40为阴性。实现该方法的试剂盒主要包括上述引物和探针。本发明具有如下优点：能极大地缩短检测时间，只需要1天时间即可完成整个检测；操作更加简单，只需要提取核酸和荧光PCR，无需额外操作；一次性能对待检样品进行胎儿弯曲菌和性病亚种的定性和定量检测；灵敏度高，结果准确可靠。
【专利说明】一种快速鉴别胎儿弯曲菌和性病亚种的方法和试剂盒
【技术领域】
[0001]本发明属于生物【技术领域】，特别涉及一种快速鉴别胎儿弯曲菌和性病亚种的方法和试剂盒。
【背景技术】
[0002]胎儿弯曲菌是一类革兰染色阴性、氧化酶阳性、触媒阳性、呈逗点或S形弯曲、动力活泼、嗜微需氧菌的人兽共患传染病病原体。胎儿弯曲菌常定居在野生动物、家禽、家畜及宠物的肠道或泌尿生殖道内，通过“粪-口”途径的方式感染人类，常导致人类肠外感染，如菌血症、脑膜炎、关节炎、蜂窝组织炎、动脉瘤感染等疾病。胎儿弯曲菌可分为胎儿亚种和性病亚种，性病亚种常存在于动物生殖道中，通过交配和人工授精等传播，常导致牛羊不育、流产和生殖道炎症。目前，胎儿弯曲菌国内有《GB/T18653-2002》对绵羊、牛的冷冻精液中胎儿弯曲菌的标准检验方法，这种方法仅适用于液体样品，对固体样品具有一定局限性；同时，弯曲菌培养条件苛刻、生长缓慢，从培养到生化鉴定需要7~9天，会延误相应的诊断和治疗；再者，弯曲菌培养操作繁琐，需要微需氧环境，培养到生化鉴定需要8种培养基，进行10次试验。
【发明内容】
[0003]本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种快速鉴别胎儿弯曲菌和性病亚种的方法。
[0004]本发明的另一目的在于提供实现上述方法的试剂盒。
[0005]本发明的目的通过下述技术方案实现:一种快速鉴别胎儿弯曲菌和性病亚种的方法，包括如下步骤:
[0006](I)设计双重实时荧光定量PCR的引物和探针:
[0007]①胎儿弯曲菌的检测引物和探针:
[0008]Sap-F:5’ -GGTGGAGAATTTACTGATAG-3’ ；
[0009]Sap-R:5，-GCCTTAGCCTCAAATATAG-3，；
[0010]Sap-P:5’ -FAM-TTAGACTCAGCACTACCGCCATT-BHQ1-3，；
[0011]②胎儿弯曲菌性病亚种检测引物:
[0012]Par-F:5’ -GTGGATCGGCATCTACTA-3’ ；
[0013]Par-R:5’ -ATCGCAATCTGCAATGAA-3’ ；
[0014]Par-P:5’ -HEX-TATCATCGCCGACGAGTGCC-BHQ1-3’ ；
[0015](2)提取待检样品中的基因组DNA ;
[0016](3)以步骤⑵得到的基因组DNA为模板，加入步骤(1)的引物和探针，进行双重实时荧光定量PCR;
[0017](4)结果判断:Ct值〈35为阳性；35~40为可疑，需要重复试验一次；>40为阴性；
[0018]步骤⑵中所述的待检样品包括粪便、生殖道涂抹物和血液；
[0019]步骤(2)中所述的待检样品可通过常规方法得到基因组DNA，如通过相应的基因组试剂盒提取基因组DNA ；
[0020]步骤⑵中所述的待检样品优选经过增菌，再进行基因组DNA的提取；
[0021]步骤(3)中所述的双重实时荧光定量PCR的体系优化为:qPCR MIX(2.5X) 10μ L、引物 Sap-F(1nM) 1.25 μ L、弓 I 物 Sap-R(1nM) 1.25 μ L、弓 I 物 Par-F(1nM) 1.25 μ L、弓 I 物Par-R(1nM) 1.25 μ L、探针 Sap-P (1nM) 0.5 μ L、探针 Par-P (1nM) 0.5 μ L、EnchancerSolut1n (增强剂，20 X) 1.25 μ L、模板DNA5 μ L，无菌水补足至25 μ L ；
[0022]步骤⑶中所述的双重实时荧光定量PCR的条件优选为:95°C 2min ；95°C 10s、56°C 30s, 40个循环；在退火阶段接受荧光信号；
[0023]步骤(4)中所述的阳性的解读如下:只出现sap扩增产物，表示待检样品含有胎儿弯曲菌胎儿亚种；若同时出现sap扩增产物和par扩增产物，比较FAM曲线和HEX曲线的ct值，若两者Ct值相同时，待检样品只含胎儿弯曲菌性病亚种，若两者Ct值不同时，待检样品含有胎儿弯曲菌胎儿亚种和性病亚种；
[0024]实现上述快速鉴别胎儿弯曲菌和性病亚种的方法的试剂盒，包括如下引物和探针:
[0025]Sap-F:5’ -GGTGGAGAATTTACTGATAG-3’ ；
[0026]Sap-R:5，-GCCTTAGCCTCAAATATAG-3，；
[0027]Sap-P:5’ -FAM-TTAGACTCAGCACTACCGCCATT-BHQ1-3，；
[0028]Par-F:5，-GTGGATCGGCATCTACTA-3，；
[0029]Par-R:5，-ATCGCAATCTGCAATGAA-3，；
[0030]Par-P: 5，-HEX-TATCATCGCCGACGAGTGCC-BHQ1-3，；
[0031]所述的试剂盒还包括阳性对照；
[0032]所述的阳性对照为胎儿弯曲菌的Sap基因或含有胎儿弯曲菌Sap基因的核酸序列；以及胎儿弯曲菌性病亚种的Par基因或含有胎儿弯曲菌性病亚种Par基因的核酸序列；
[0033]所述含有胎儿弯曲菌Sap基因的核酸序列优选为将胎儿弯曲菌Sap基因和克隆载体重组得到的质粒；
[0034]所述含有胎儿弯曲菌性病亚种Par基因的核酸序列优选为将胎儿弯曲菌性病亚种Par基因和克隆载体重组得到的质粒；
[0035]所述的试剂盒还含有qPCR所用的酶、缓冲液和增强剂等。
[0036]本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果:
[0037](I)本发明提供的方法和试剂盒，能极大地缩短检测时间，只需要I天时间即可完成整个检测。
[0038](2)操作更加简单，只需要提取核酸和荧光PCR，无需额外操作。
[0039](3) 一次性能对待检样品进行胎儿弯曲菌和性病亚种的定性和定量检测。
[0040](4)灵敏度高，结果准确可靠。
【专利附图】
【附图说明】
[0041]图1是Sap-阳性克隆标准曲线图。
[0042]图2是Par-阳性克隆标准曲线图。
[0043]图3是Sap-阳性克隆的灵敏度检测结果图。
[0044]图4是Par-阳性克隆的灵敏度检测结果图。
[0045]图5是特异性实验扩增曲线图；其中，曲线I是胎儿弯曲菌胎儿亚种ATCC27374，曲线2是胎儿弯曲菌性病亚种ATCC19438，曲线3是胎儿弯曲菌性病亚种ATCC19438。
[0046]图6是对比例I的扩增曲线图。
[0047]图7是对比例2的扩增曲线图。
【具体实施方式】
[0048]下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
[0049]实施例1:
[0050](I)设计双重实时荧光定量PCR的引物和探针:
[0051]①胎儿弯曲菌的检测引物和探针:
[0052]Sap-F:5’ -GGTGGAGAATTTACTGATAG-3’ ；
[0053]Sap-R:5，-GCCTTAGCCTCAAATATAG-3，；
[0054]Sap-P:5’ -FAM-TTAGACTCAGCACTACCGCCATT-BHQ1-3，；
[0055]以胎儿弯曲菌为模板，通过引物Sap-F和Sap-R扩增得到的产物的长度为137bp ；Sap-P 为 Taqman 探针。
[0056]②胎儿弯曲菌性病亚种检测引物:
[0057]Par-F:5’ -GTGGATCGGCATCTACTA-3’ ；
[0058]Par-R:5，-ATCGCAATCTGCAATGAA-3，；
[0059]Par-P: 5，-HEX-TATCATCGCCGACGAGTGCC-BHQ1-3 ’ ；
[0060]以胎儿弯曲菌性病亚种为模板，通过引物Par-F和Par-R扩增得到的产物的长度为 112bp ； Par-P 为 Taqman 探针。
[0061](2)阳性质粒的制备
[0062]I)通过细菌基因组提取试剂盒(天根生化科技(北京)有限公司)，按说明书的操作，分别抽提胎儿弯曲菌(ATCC27374)和胎儿弯曲菌性病亚种(ATCC19438)的基因组DNA。
[0063]2)以Sap-F和Sap-R为引物对，以胎儿弯曲菌(ATCC27374)的基因组DNA为模板进行PCR ；以Par-F和Par-R为引物对，以胎儿弯曲菌性病亚种(ATCC19438)的基因组DNA为模板进行PCR。PCR扩增条件为:预变性95°C 5min ;变性95°C 20sec、退火55°C 30sec、延伸72°C lmin，30个循环；终延伸72°C 5min。PCR扩增体系为:基因组DNA 2 μ L、引物对(浓度分别为ΙΟμ mol/L)各lyL、PCR MIX (天根生化科技公司)25 μ L，双蒸水补足至50 μ L。将得到的PCR产物通过2 %的琼脂糖凝胶电泳(100V，70min)分离，通过DNA凝胶回收试剂盒(Invitrogen Purelink0Quick Gel Extract1n Kit)回收，分别得到 Sap 片段(137bp)和 Par 片段(112bp)。
[0064]3)将步骤2)得到的Sap片段(137bp)和Par片段(112bp)分别末端平端化，再与平末端载体连接，具体如下:目的片段(Sap片段或Par片段)3 μ L,2XReact1nBuffer5μ L，DNA平端化酶0.5μ L，加水补足8.5μ L ；70°C反应5min，放在冰上冷却，再加入pZeroBack/blunt载体(2974bp,天根生化科技公司)I μ L和T4连接酶(天根生化科技公司)0.5yL，于22°C反应5min。反应结束后，置于冰上。
[0065]4)将步骤3)得到的连接产物分别转化大肠杆菌T0P10感受态细胞(天根生化科技公司)中，将转化液涂布于含100μ g/ml氨苄青霉素的LB平板上，得到初步筛选得到的克隆；接着通过菌落PCR对初步筛选得到的克隆进行复筛，反应条件同步骤2);将复筛阳性的克隆扩大培养并提取质粒，经上海美吉生物(广州)公司测序确定，分别得到Sap-阳性克隆和Par-阳性克隆。
[0066]Sap-阳性克隆含如下序列(划横线部分为目的序列):
[0067]GCGAACTCGATGGCTCGAGTTTTAGCAGATGGTGGAGAATTTACTGATAGTAAGGGTAATGTTATTAATGTTGCTAGTTTAAGCAAGGGTGATTTMTAGGTGCTATGATTGACTCTATGGTTAATGGTGGTAGTGCTGAGTCTAAGGCTATATTTGAGGCTAAGGCATCTTTCTAGAAGATCTCCTACAATATTCTCAGCTGCCATGGAAAATCGATGTTCTTAAAAT ；
[0068]Par-阳性克隆含如下序列(划横线部分为目的序列):
[0069]CGTATTGTAGAGACTTCTAGATGATGTGGATCGGCATCTACTAAAAGCGTATCATCGCCGACGAGTGCCAGCTTTATGGCTAAATTTATGGCGATATTTGTTTTGCCGCTACCGCCTTTTTCATTGCAGATTGCGATATCTTGCTGAAAAACTCGAGCCATCCGGAAGATCTGGCGGCCGCTCTCCCTATAGTGAGTCGA。
[0070]经Blast证实:重组的碱基没有变异和缺失。
[0071](3)标准曲线的绘制
[0072]I)使用质粒抽提试剂盒抽提得到Sap-阳性克隆质粒(3111bp)和Par-阳性克隆质粒(3086bp)。经Eppendorf核酸蛋白分析仪检测，Sap-阳性克隆质粒和Par-阳性克隆质粒溶液在260nm的吸光度值分别为0.0228ng/L、0.0317ng/L ;经如下公式计算其相应的质粒拷贝浓度为3.3 X 1ltl拷贝/ μ L，4.7 X 1ltl拷贝/yL。
[0073]
【权利要求】
1.一种快速鉴别胎儿弯曲菌和性病亚种的方法，其特征在于包括如下步骤: (1)设计双重实时荧光定量PCR的引物和探针: ①胎儿弯曲菌的检测引物和探针:
Sap-F:5’ -GGTGGAGAATTTACTGATAG-3’ ；
Sap-R:5，-GCCTTAGCCTCAAATATAG-3，；
Sap-P:5’ -FAM-TTAGACTCAGCACTACCGCCATT-BHQ1-3’ ； ②胎儿弯曲菌性病亚种检测引物:
Par-F:5’ -GTGGATCGGCATCTACTA-3’ ；
Par-R:5’ -ATCGCAATCTGCAATGAA-3’ ；
Par-P:5’ -HEX-TATCATCGCCGACGAGTGCC-BHQ1-3’ ； (2)提取待检样品中的基因组DNA； (3)以步骤⑵得到的基因组DNA为模板，加入步骤⑴的引物和探针，进行双重实时荧光定量PCR ； (4)结果判断:Ct值〈35为阳性；35~40为可疑，需要重复试验一次；>40为阴性。
2.根据权利要求1所述快速鉴别胎儿弯曲菌和性病亚种的方法，其特征在于:步骤(2)中所述的待检样品为粪便、生殖道涂抹物或血液。
3.根据权利要求1所述快速鉴别胎儿弯曲菌和性病亚种的方法，其特征在于:步骤(3)中所述的双重实时荧光定量PCR的体系为:2.5倍浓度的qPCR MIXlO μ L、浓度为1nM的引物Sap-F 1.25 μ L、浓度为1nM的引物Sap-R 1.25 μ L、浓度为1nM的引物Par-F1.25 μ L、浓度为1nM的引物Par-R 1.25 μ L、浓度为1nM的探针Sap-P 0.5 μ L、浓度为1nM的探针Par-P 0.5 μ L、20倍浓度的增强剂1.25 μ L、模板DNA 5 μ L，无菌水补足至25 μ L0
4.根据权利要求1所述快速鉴别胎儿弯曲菌和性病亚种的方法，其特征在于:步骤(3)中所述的双重实时荧光定量PCR的条件为:95°C 2min ；95°C 10s、56°C 30s，40个循环；在退火阶段接受荧光信号。
5.根据权利要求1所述快速鉴别胎儿弯曲菌和性病亚种的方法，其特征在于:步骤(4)中所述的阳性为:只出现sap扩增产物，表示待检样品含有胎儿弯曲菌胎儿亚种；若同时出现sap扩增产物和par扩增产物，比较FAM曲线和HEX曲线的ct值，若两者ct值相同时，待检样品只含胎儿弯曲菌性病亚种，若两者ct值不同时，待检样品含有胎儿弯曲菌胎儿亚种和性病亚种。
6.实现权利要求1~5任一项所述快速鉴别胎儿弯曲菌和性病亚种的方法的试剂盒，其特征在于包括如下引物和探针:
Sap-F:5’ -GGTGGAGAATTTACTGATAG-3’ ；
Sap-R:5，-GCCTTAGCCTCAAATATAG-3，；
Sap-P:5’ -FAM-TTAGACTCAGCACTACCGCCATT-BHQ1-3’ ；
Par-F:5’ -GTGGATCGGCATCTACTA-3’ ；
Par-R:5’ -ATCGCAATCTGCAATGAA-3’ ；
Par-P:5’ -HEX-TATCATCGCCGACGAGTGCC-BHQ1-3’。
7.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于:包括阳性对照；所述的阳性对照为胎儿弯曲菌的Sap基因或含有胎儿弯曲菌Sap基因的核酸序列；以及胎儿弯曲菌性病亚种的Par基因或含有胎儿弯曲菌性病亚种Par基因的核酸序列。
8.根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于:所述含有胎儿弯曲菌Sap基因的核酸序列为将胎儿弯曲菌Sap基因和克隆载体重组得到的质粒； 所述含有胎儿弯曲菌性病亚种Par基因的核酸序列为将胎儿弯曲菌性病亚种Par基因和克隆载体重组得到的质粒。
9.根据权利要求6~8任一项所述的试剂盒，其特征在于:还含有qPCR所用的酶、缓冲液和增强剂。
【文档编号】C12Q1/68GK104178575SQ201410437158
【公开日】2014年12月3日 申请日期:2014年8月29日 优先权日:2014年8月29日
【发明者】侯水平, 吴新伟, 陈守义, 杨智聪 申请人:广州市疾病预防控制中心