一种基于同源重组的乳酸片球菌dq2的无标记基因敲除方法

一种基于同源重组的乳酸片球菌dq2的无标记基因敲除方法
【专利摘要】本发明涉及一种基于同源重组的乳酸片球菌DQ2的无标记基因敲除方法，步骤包括温度敏感型穿梭质粒pSET4E和含有所要敲除靶基因上下游同源片段的敲除质粒的构建，敲除质粒电转化进入乳酸片球菌，发生第一次同源重组单交换和发生第二次同源重组双交换突变株的筛选和鉴定。该发明首先实现了乳酸片球菌的无标记基因敲除，获得的敲除菌株不携带任何抗性基因，既可以作为出发菌株进行后续基因敲除和改造，还可以安全用于大规模工业生产。利用该方法分别敲除了乳酸片球菌DQ2(保藏号为CGMCC NO.7471)的L-乳酸脱氢酶基因和D-乳酸脱氢酶基因，得到的敲除菌株分别命名为乳酸片球菌ZP26、TY112，其保藏号分别为CGMCC NO.8665和CGMCC NO.8664，它们能够分别产生光学纯的D-乳酸、L-乳酸。CGMCC NO.747120130412
【专利说明】
一种基于同源重组的乳酸片球菌DQ2的无标记基因敲除方 法
技术领域
[0001] 本发明涉及一种基于同源重组原理的基因敲除方法，尤其涉及一种基于同源重组 的乳酸片球菌DQ2的无标记基因敲除方法及敲除乳酸片球菌DQ2的ldh、ldhD基因制备的 产光学纯D-乳酸、L-乳酸的菌株。
【背景技术】
[0002] 乳酸片球菌（Pediococcus acidilactici，简称 P. acidilactici)是一类兼性厌 氧的革兰氏阳性细菌，属于一种乳酸菌，它进行同型乳酸发酵，可以耐受很低的pH值，在较 高温度和渗透压下也可以生长。该类菌有益生菌的潜能，产生的乳酸和片球菌素会抑制其 他微生物的生长，并且在目前发表的文章中未发现其有毒性效应。
[0003] 乳酸片球菌P. acidilactici DQ2 (保藏号为CGMCC N0. 7471)为本实验室在纤维 素乙醇发酵过程中分离得到的一株耐高温，同时对木质纤维素预处理过程中产生的抑制物 有较高耐受性的乳酸高产菌株。此菌能够在48°C的高温下进行正常的发酵，并且最高能够 产生100g/L以上的乳酸，基本没有其他副产物的产生，具有极大的构建纤维素乳酸工业生 产模式菌的潜力。然而该菌株所产的乳酸为D，L-混合型乳酸，限制了产品的应用。
[0004] 乳酸是一种手性分子，根据其旋光性可分为D-乳酸、L-乳酸和D，L-乳酸。目 前乳酸最重要的用途是生产可以取代聚乙烯和聚丙烯等聚合材料的可降解聚乳酸产品 (Polymeric lactic acid，PLA)，这被看作是解决目前日益严重的白色污染的重要途径。合 成性能好的聚乳酸需要光学纯的乳酸单体，有必要对P. acidilactici DQ2进行菌株改造， 使其产生光学纯的乳酸。该菌株产生L-乳酸最主要依靠的是L-乳酸脱氢酶（由ldh基因 编码），产D-乳酸最主要依靠的是D-乳酸脱氢酶（由ldhD基因编码），考虑采取基因敲除 的手段改造菌株使得其产生光学纯的乳酸。
[0005] 基因敲除技术是20世纪80年代发展起来的一项重要的分子生物学技术，是通过 一定的方法使细胞中特定的基因失活或缺失的技术。它具有定位性强、插入基因随染色体 DNA稳定遗传等优点。基因的敲除通常所用的基本原理为同源重组，即外源基因片段如果同 宿主菌的基因组上某片段具有很高的同源度的话两者将会发生交换。
[0006] 通常采用自杀质粒为载体构建敲除系统，将靶基因上游以及下游片段或者不完整 的靶基因连接到自杀质粒上并转入宿主菌中，以敲除或者破坏靶基因。目前对大肠杆菌的 研究非常多，所以其基因敲除系统也比较成熟，如Red重组系统就非常地高效。而作为革兰 氏阳性菌的乳酸菌的基因敲除系统则相对不是那么地完善，大部分的敲除还是采用自杀质 粒。而近年来出现了比较高效的热敏性敲除系统，此系统是基于能够在敲除宿主中进行条 件复制的复制子，即在低于某一温度下该质粒能够进行复制，而在高于某一温度条件下该 质粒的复制将会被关闭。
[0007] Maguin E 等（Maguin E，Duwat P，Hege T，Ehrl ich D，GrussA. New thermosensitive plasmid for gram-positive bacteria. Journal of bacteriology， 1992,174(17) :5633-5638.)筛选得到一种突变质粒pVE6002。对其进行在没有抗生素条件 下的热敏性实验，发现该质粒在37°C以上的温度下培养8h后将会全部丢失，而在30°C以下 培养时几乎不会出现丢失。接着在此质粒上插入一段多克隆位点，构建便于进行克隆的载 体pVE6004〇 Biswas I 等（Biswas I，Gruss A, Ehrlich SD，Maguin E. High-efficiency gene inactivation and replacement system for gram-positive bacteria. Journal of bacteriology，1993,175 (11) :3628-3635.)对该套系统进行了实际验证，并且构建了大 肠杆菌-乳酸菌穿梭敲除质粒pGhost5以便于在大肠杆菌中进行同源片段的克隆。Gory L 等（Gory L，Montel MC，Zagorec M. Use of green fluorescent protein to monitor Lactobacillus sakei in fermented meat products. FEMS microbiology letters，2001， 194(2) : 127-133.)以半乳糖苷酶基因作为靶基因通过热敏性敲除质粒pGhost5将gfp片 段整合到染色体上进行了表达。
[0008] OKano K 等（OKano K，Zhang Q，ShinKawa S，Yoshida S，TanaKa T，FuKuda H， Kondo A. Efficient production of optically pure D-lactic acid from raw corn starch by using a genetically modified L-lactate dehydrogenase gene-deficient and a-amylase-secreting Lactobacillus plantarum strain.Applied and environmental microbiology，2009, 75(2) :462_467.)通过 pGhost9 敲除质粒成功地对 L.plantarum上的L-乳酸脱氢酶基因（ldhL)进行了敲除，达到产光学纯D-乳酸的目的。
[0009] TaKamatsu D 等（TaKamatsu D，OsaKi M，SeKizaKi T. Thermosensitive suicide vectors for gene replacement in Streptococcus suis. Plasmid，2001，46 (2)： 140-148.)对pGhost3进行改造，构建了一系列更加实用的猪链球菌敲除质粒。在pGhost3 上插入来源于PUC19的复制子、多克隆位点以及壮观霉素抗性标记从而得到敲除质粒 PSET4S。在大肠杆菌中培养温度为37°C时该质粒能够复制，而在猪链球菌中37°C时该质粒 不能够复制。用此质粒对S. equi的溶血素基因sly进行了敲除（将其替换成氯霉素抗性 基因）。
[0010] 目前还没有对乳酸片球菌进行基因敲除的报道，因此建立一种乳酸片球菌的敲除 方法很有必要。

【发明内容】

[0011] 本发明的目的在于提供一种P. acidilactici DQ2的基因敲除方法。
[0012] 本发明的另一个目的在于通过敲除P. acidilactici DQ2的ldh、ldhD基因，获得 可以生产光学纯D-乳酸、L-乳酸的菌株。
[0013] 本发明实现P. acidilactici DQ2的基因敲除所采用的技术方案是：构建含有红 霉素抗性基因的PSET4E质粒，将要敲除的靶基因上下游同源片段分别按一定方向连接到 PSET4E上，获得靶基因的敲除质粒，将敲除质粒通过电转化进入P.acidilactici DQ2中， 得到含敲除质粒的菌株，之后在质粒不能复制的较高温度42°C下培养，在含红霉素的选择 平板上获得发生第一次同源重组使质粒整合到受体菌染色体上的单交换子，然后将单交换 子在无红霉素条件下质粒可以复制的较低温度28°C培养，连续转接1-10次，在同样条件下 培养，直至筛选得到发生第二次同源重组的无红霉素抗性实现靶基因敲除的菌株。
[0014] 上述pSET4E质粒携带能在大肠杆菌中复制的复制原点、在革兰氏阳性细菌中温 敏型复制的复制原点、多克隆位点MCS、红霉素抗性基因。
[0015] 上述敲除质粒是通过将P. acidilactici DQ2染色体上要敲除的革E基因上游和下 游、大小约为lkb的同源序列片段分别按一定方向酶切连接至pSET4E的多克隆位点上。
[0016] 上述敲除质粒通过电转化进入P. acidilactici DQ2得到含敲除质粒的菌株的方 法是将1 y g敲除质粒（大约10 y L)与80 y L乳酸片球菌感受态细胞混合，在2000V、200 Q、 25 y F (1mm电击杯）条件下电击，电击后迅速将菌液转移到lmL的复苏液里冰置5min，后转 移到28°C培养箱中培养2. 5h，5000rpm离心4min，吸取800 y L上清，剩下的混匀后涂布含 红霉素的MRS平板，28°C培养3d左右长出转化子，挑取阳性克隆进行PCR验证。
[0017] 上述发生第一次同源重组使质粒整合到受体菌染色体上的单交换子的验证方法 是将含敲除质粒的P. acidilactici DQ2接种至添加红霉素的MRS培养基中28°C、150rpm 条件下培养到对数期，以获得大量含敲除质粒的菌株，然后以1%的接种量将上述菌液接种 到MRS培养基中，42°C (在该温度下，质粒不能进行复制，筛选得到的对红霉素有抗性的菌 株即为发生单交换的菌株）、150rpm条件下培养到稳定期，将上述菌液稀释10 6倍后涂布含 有红霉素的MRS平板42°C培养，获得发生第一次同源重组使质粒整合到受体菌染色体上的 单交换子，将单交换子在含红霉素的MRS培养基中42°C培养，提取基因组DNA，设计引物进 行PCR验证。
[0018] 上述筛选发生第二次同源重组实现靶基因敲除的菌株的方法是将单交换子接种 到含红霉素的液体MRS培养基中42°C、150rpm培养至稳定期，以1 %的接种量将上述菌液 接种到MRS培养基中，28°C (在低温下激活整合到基因组上的质粒片段进行滚环复制，通过 同源重组方式发生剪切）、150rpm条件下培养到稳定期以获得第一次培养液。之后同样以 1 %的接种量接种到MRS培养基中进行培养，从而获得第二次的培养液，最多转接10次直至 筛选到发生第二次同源重组实现靶基因敲除的菌株。将每次培养的菌液稀释1〇 6倍后涂布 MRS平板，42°C培养，用牙签挑取长出的单菌落，分别点种在含有红霉素和不含有红霉素的 MRS平板上，42°C培养。对于在不含有红霉素的平板上可以生长而在含红霉素平板上不能生 长的菌株，应该是发生双交换同源重组的菌株。将双交换菌株在MRS培养基中42°C培养，提 取基因组DNA，设计引物进行PCR验证，从而得到靶基因敲除的突变株。
[0019] 本发明提供了一种基于同源重组的无标记基因敲除方法，在国际上率先把无标记 基因敲除技术应用于P. acidilactici，可以实现P. acidilactici中任何一个基因和多基 因的敲除，且不残留任何抗生素抗性基因。
[0020] 本发明能快速、稳定、高效地敲除P. acidilactici的基因，不仅可用于研究 P. acidilactici基因的功能和代谢机制，实现P. acidilactici的遗传性状改造，而且所获 得的突变株不携带任何抗生素抗性基因，既可以作为出发菌株进行基因改造，还可以安全 地用于大规模工业生产。
[0021] 使用该敲除方法敲除P. acidilactici DQ2的ldh基因得到了产光学纯D-乳酸的 菌株ZP26,敲除P. acidilactici DQ2的ldhD基因得到了产光学纯L-乳酸的菌株TY112,这 两个菌株已于2013年12月31日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心 (简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所），保藏 登记号分别为CGMCC N0. 8665和CGMCC N0. 8664,其分类命名为乳酸片球菌（Pediococcus acidilactici)〇 【【附图说明】】
[0022] 图1.用于基因敲除的pSET4E质粒的构建；
[0023] 图2?敲除质粒pSET4E- A ldh的构建；
[0024] 图3?敲除质粒pSET4E- A ldhD的构建；
[0025] 图4. P. acidilactici DQ21dh基因敲除的构建流程示意图；
[0026] 图5. P. acidilactici DQ21dhD基因敲除的构建流程示意图；
[0027] 图 6. P. acidilactici ZP26、P. acidilactici TY112 基因敲除的 PCR 验证图；
[0028] 附图6中的标记为：M，DL5, 000DNA Marker ;1，利用引物ldh-F和ldh-R扩 增P. acidilactici DQ2基因组的ldh基因；2,利用引物up-F-ldh和down-R-ldh扩增 P. acidilactici DQ2基因组中ldh基因及其上下游同源臂；3,利用引物ldhD-F和ldhD-R 扩增P. acidilactici DQ2基因组中ldhD基因的部分区域；4,利用引物up-F-ldhD和 down-R-ldhD扩增P. acidilactici DQ2基因组中ldhD基因及其上下游同源臂；5,利用引 物ldh-F和ldh-R扩增P. acidilactici ZP26基因组的ldh基因；6,利用引物up-F-ldh和 down-R-ldh扩增P. acidilactici ZP26基因组中ldh基因及其上下游同源臂；7,利用引物 ldhD-F和ldhD-R扩增P. acidilactici TY112基因组中ldhD基因的部分区域；8,利用引 物up-F-ldhD和down-R-ldhD扩增P. acidilactici TY112基因组中ldhD基因及其上下游 同源臂；
[0029] 图 7. P. acidilactici DQ2、P. acidilactici ZP26、P. acidilactici TY112在简化 MRS培养基中的生长曲线；
[0030] 图8. P. acidilactici DQ2、P. acidilactici ZP26、P. acidilactici TY112在添加 碳酸钙的简化MRS培养基中的葡萄糖消耗和乳酸生成曲线。 【【具体实施方式】】
[0031] 以下提供本发明"一种基于同源重组的乳酸片球菌DQ2的无标记基因敲除方法" 的【具体实施方式】。
[0032] 试验材料：
[0033] 本发明所用乳酸片球菌P. acidilactici DQ2由本实验室筛选获得，已于2013 年4月12日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（简称CGMCC，地 址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所），保藏登记号为 CGMCC N0. 7471，其分类命名为乳酸片球菌（Pediococcus acidilactici)。所用大肠杆 菌XLl-blue由实验室保藏。所述pMG36e质粒的来源见M van de Guchte，J M van der Vossen, J KoK and G Venema, Construction of a Lactococcal Expression Vector ： Expression of Hen Egg White Lysozyme in Lactococcus lactis subsp. Lactis, Applied and environmental microbiology，1989,55(l) :224_228。所述 pSET4S 质粒的来 源见 TaKamatsu D，OsaKi M，SeKizaKi T, Thermosensitive suicide vectors for gene replacement in Streptococcus suis，Plasmid，2001，46(2) :140_148〇
[0034] 一、试剂及培养基
[0035] PrimeSTAR HS DNA聚合酶、T4DNA连接酶购自TaKara生物工程公司；Pst I、EcoR I、Hind III、BamH I、Spe I等限制性内切酶购自Fermentas公司；质粒小抽试剂盒、DNA 凝胶回收试剂盒购自上海捷瑞生物工程有限公司；细菌基因组抽提试剂盒购自Omega生物 工程公司；PCR产物纯化试剂盒购自生工生物工程有限公司；Megazyme D-/L_Lactic acid Kit试剂盒购自Megazyme公司；红霉素、壮观霉素购自博尊生物科技有限公司；其它药品、 试剂如无特殊说明均购自上海凌峰化学试剂公司或上海国药化学试剂集团，并都为分析 纯；引物合成在上海捷瑞生物工程有限公司完成。
[0036] MRS 培养基（g/L):
[0037] 液体：葡萄糖20,蛋白胨10,酵母粉4,牛肉膏8,乙酸钠3,柠檬酸氢二铵2,磷酸氢 二钾2,七水硫酸镁0. 2, 一水硫酸锰0. 05,吐温801 mL/L ;固体：在液体培养基中额外添加 15g/L的琼脂，115°C高压蒸汽灭菌20min ;
[0038] 含红霉素的MRS培养基：在MRS培养基基础上加入终浓度5 y g/mL的红霉素；
[0039] 简化MRS液体培养基（g/L):葡萄糖20,蛋白胨10,酵母粉10,乙酸钠5,柠檬酸氢 二铵2,磷酸氢二钾2,七水硫酸镁0. 58, 一水硫酸锰0. 25,115 °C高压蒸汽灭菌20min ;
[0040] 复苏液（g/L):蔗糖171，葡萄糖20,蛋白胨10,酵母粉4,牛肉膏8,乙酸钠3,柠檬 酸氢二铵2,磷酸氢二钾2,七水硫酸镁0. 2, 一水硫酸锰0. 05,吐温801 mL/L，115°C高压蒸 汽灭菌20min ;
[0041] LB 培养基（g/L):
[0042] 液体：酵母浸粉5,蛋白胨10,氯化钠10 ;固体：在液体培养基中额外添加15g/L的 琼脂，115°C高压蒸汽灭菌20min ;
[0043] 含红霉素的LB培养基：在LB培养基基础上加入终浓度150 y g/mL的红霉素；含壮 观霉素的LB培养基：在LB培养基基础上加入终浓度200 y g/mL的壮观霉素。
[0044] 二、所用主要仪器：
[0045] Mastercycler 型 PCR 仪（Eppendorf 公司）；Gene Pulser Xcell?型电穿孔仪 (Bio-Rad公司）；EPS-100型DNA电泳系统（上海天能公司）；FR-200A型全自动紫外与可 见分析装置（复日科技公司）；DU-800型核酸蛋白质分析仪（Beckman公司）；HZ-2111KB型 落地恒温振荡摇床（太仓华利达有限公司）；5415R型台式冷冻离心机（Eppendorf公司）； LC-20AD型高效液相色谱（岛津公司）；SDC-6型低温水槽（宁波新芝生物科技有限公司）； DK-8D型三孔电热恒温水槽（上海一恒科学仪器有限公司）；GHP-9160型隔水式恒温培养 箱（上海一恒科学仪器有限公司）；F 〇rma-86C型超低温冰箱（Thermo公司）。
[0046] 实施例1 :pSET4E质粒的构建
[0047] 热敏性自杀质粒pSET4S是一种大肠杆菌-革兰氏阳性细菌宽宿主范围穿梭 型质粒，该质粒的来源见 DaisuKe TaKamatsu，MaKoto 0saKi，and Tsutomu SeKizaKi， Thermosensitive Suicide Vectors for Gene Replacement in Streptococcus suis， Plasmid，2001，46(2) :140 - 148。该质粒在大肠杆菌中培养温度为37°C时能够复制，从而 便于同源片段的克隆，而在猪链球菌中37°C时不能够复制。该质粒不仅可用于猪链球菌的 基因敲除，还可用于其他一些革兰氏阳性细菌的基因敲除，因此考虑用该质粒作为初始质 粒构建合适的敲除质粒来进行P. acidilactici的基因敲除。
[0048] 发现P. acidilactici DQ2对壮观霉素具有很高的抗性（>150 yg/mL)，而对红霉 素敏感，所以考虑将PSET4S上的壮观霉素抗性基因更换成红霉素抗性基因。
[0049] 根据质粒 pMG36e 的序列（SEQ ID N0:1)设计引物 Emr-F(SEQ ID N0:2)和 Emr-R(SEQID N0:3)扩增其中的红霉素抗性基因Emr序列（SEQ ID N0:4)，以质粒pMG36e 为模版PCR扩增得到红霉素抗性基因片段Emr，PCR扩增体系如下：
[0050] 5xPrimeSTAR Bul'lcr ( 5 mM plus'* !0 0 jal.； 上游引物i.〇 pl; 下游引物（10(iM) l.OixLi 10 mM dNTP mixture 4 0 jil ; 模版 DNA 0 5 nL； PrimcSTAR HS DNA Polymerase 0.5 pL，加水补个:50 )iL;
[0051] PCR 反应条件：94°C预变性 3min，94°C变性 30s，55°C退火 15s，72°C延伸 lmin，30 个循环后72°C延伸lOmin。分别用Spe I限制性内切酶对纯化后的Emr基因片段以及质粒 pSET4S(SEQ ID N0:5)进行单酶切，然后切胶回收目的片段。为了避免连接过程中单酶切的 质粒片段发生自连，对单酶切后的质粒进行去磷酸化处理。去磷酸化体系如下（50yL):
[0052] DNA 30 nL 10XBAP buffer 5 (.iL 碱性磷酸裂解酶 2 pL
[0053] 无菌超纯水 13 pL
[0054] 在PCR仪中设定程序进行反应，65°C反应lOmin，反应结束后用PCR产物纯化试剂 盒进行纯化。最后进行目的基因片段与质粒片段的连接，转化大肠杆菌XLl-blue，挑选阳性 菌落进行菌落PCR，提取质粒进行酶切鉴定，得到构建成功的pSET4E(SEQ ID N0:6)(见图 1)〇
[0055] 将 1 y g pSET4E 质粒（大约 10 y L)与 80 y L P. acidilactici DQ2 感受态细胞混 合，在2000V、200 Q、25 y F (1mm电击杯）条件下电击，电击后迅速将菌液转移到lmL的复苏 液里冰置5min，后转移到28°C培养箱中培养2. 5h，然后5000rpm离心4min，吸取800 y L上 清，剩下的混匀后涂布在含5 y g/mL红霉素的MRS培养基平板上，28°C培养3d左右长出转 化子，用引物Emr-F和Emr-R进行PCR验证。
[0056] 实施例2 :P. acidilactici DQ21dh基因的无标记敲除
[0057] (1) ldh基因敲除质粒pSET4E- A ldh的构建
[0058] 根据 Pediococcus acidilactici 的模式菌株 DSM20284 中 ldh 基因（NCBI-GI =304328039)的上下游 DNA 序列，设计相应引物 up-F-ldh、up-R-ldh、down-F-ldh、 down-R-ldh(SEQ ID N0:7-10)PCR扩增ldh基因上下游序列up-ldh(L-乳酸脱氢酶基因起 始密码子上游的大约lkb大小的序列）（SEQ ID NO:ll)、down-ldh(L-乳酸脱氢酶基因终止 密码子下游的大约lkb大小的序列）（SEQ ID NO: 12)。
[0059] 以 P. acidilactici DQ2 的基因组 DNA 为模板，用引物 up-F-ldh、up-R-ldh 和 down-F-ldh、down-R-ldh 分别 PCR 克隆 ldh 基因的上下游同源序列 up-ldh、down-ldh，PCR 扩增体系与之前一致。
[0060] ?〇?的扩增条件如下：94°(：预变性3111111，94°(：变性308,58°(：退火158,72°(：延伸 70s，30个循环后72°C延伸lOmin。所得的PCR产物经0. 7%的琼脂糖凝胶电泳检测，得到 大小约为lkb左右的电泳条带，将PCR产物纯化。利用BamH I和Pst I分别双酶切up-ldh 和质粒PSET4E，之后将酶切产物进行连接，转化大肠杆菌XLl-blue，经PCR及酶切鉴定获 得阳性菌株，得到将up-ldh克隆至pSET4E多克隆位点的质粒pSET4E-up-ldh，然后再用 EcoR I和BamH I分别双酶切down-ldh和pSET4E-up-ldh，将酶切产物连接后转化大肠杆 菌XLl-blue，经PCR及酶切鉴定获得阳性菌株，成功得到将ldh基因上下游同源序列克隆至 PSET4E的L-乳酸脱氢酶基因敲除质粒pSET4E-A ldh(SEQ ID N0:13)(见图2)。
[0061] (2)发生第一次同源重组的单交换菌株的筛选
[0062] 将构建好的基因敲除质粒pSET4E_Aldh电转化入P.acidilactici DQ2的感 受态细胞，其转化条件与之前保持一致，将菌液涂布在含5 y g/mL红霉素的MRS平板上 28°C培养约3d，挑选阳性菌落，用引物Emr-F和Emr-R进行PCR验证。将含敲除质粒的 P. acidilactici DQ2单菌落接种至添加5 y g/mL红霉素的MRS培养基中28°C、150rpm条 件下培养约24h至对数期，然后以1 %的接种量将上述菌液接种到MRS培养基中，42°C、 150rpm条件下培养约12h到稳定期，将菌液稀释106倍涂布含5 y g/mL红霉素的MRS平板， 42°C培养。长出的抗性单菌落即为单交换菌株。挑取抗性单菌落接至含5 yg/mL红霉素的 MRS培养基中42°C、150rpm条件下培养，提取基因组DNA，设计引物单交换1 (ldh)-F、单交 换l(ldh)-R(SEQ ID N0:14-15)检测通过up-ldh重组的第一种单交换的形式，引物单交换 2 (ldh)-F、单交换2 (ldh)-R(SEQ ID N0:16-17)检测通过down-ldh重组的第二种单交换的 形式（见图4)。
[0063] (3)发生第二次同源重组的基因敲除菌株的筛选
[0064] 将单交换子接种到含红霉素的液体MRS培养基中42°C、150rpm培养约12h至稳定 期，以1 %的接种量将上述菌液接种到MRS培养基中，28°C、150rpm培养约24h至稳定期，之 后再以1 %的接种量转接至新鲜的MRS培养基中同样条件下培养24h，最多转接10次，直 至筛选到发生基因敲除的菌株。收集每次培养的一部分菌液，用生理盐水稀释1〇 6倍后涂 布在不含抗生素的MRS平板上，42°C培养，用牙签挑取平板上长出的单菌落，分别点种在不 含有红霉素和含有5 y g/mL红霉素的MRS平板上，42°C培养。对于在不含抗生素的平板上 可以生长，而在含有抗生素的平板上不能生长的菌落，应该是发生第二次同源重组的菌株。 将菌株接种至MRS液体培养基中42°C、150rpm培养，提取基因组DNA，用引物up-F-ldh和 down-R-ldh进行PCR扩增，另外用扩增ldh基因的引物ldh-F、ldh-R(SEQ ID N0:18-19)进 行PCR扩增。
[0065] 在发生第二次同源重组的双交换子中，一种是回复突变成野生型，另一种就是ldh 基因敲除突变株（原理见图4)。
[0066] 对于用引物up-F-ldh和down-R-ldh只能扩增出约2kb大小的PCR产物（含 up-ldh和down-ldh)，ldh-F和ldh-R扩增不出相应大小产物的菌株，即为发生第二次同源 重组ldh基因敲除的菌株。
[0067] 通过该方法得到的一株ldh基因敲除的菌株命名为Pediococcus acidilactici ZP26(PCR验证见图6)，已于2013年12月31日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会 普通微生物中心（简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院 微生物研究所），保藏登记号为CGMCC N0. 8665,其分类命名为乳酸片球菌（Pediococcus acidilactici)〇
[0068] 实施例3 :P. acidilactici DQ21dhD基因的无标记敲除
[0069] (1) ldhD基因敲除质粒pSET4E- A ldhD的构建
[0070] 根据Pediococcus acidilactici DSM20284 中 ldhD基因（NCBI-GI = 304329050) 上下游 DNA 序列，设计相应引物 up-F-ldhD、up-R-ldhD、down-F_ldhD、down-R-ldhD(SEQ ID 勵:20-23)?〇?扩增其上下游序列即-1(1110(0-乳酸脱氢酶基因起始密码子上游的大约11* 大小的序列）（SEQ ID N0:24)、down-ldhD(D-乳酸脱氢酶基因终止密码子下游的大约lkb 大小的序列）（SEQ ID N0:25)。
[0071] 以 P. acidilactici DQ2 的基因组 DNA 为模板，用引物 up-F-ldhD、up-R-ldhD 和down-F-ldhD、down-R-ldhD分别PCR克隆ldhD基因的上下游同源序列up-ldhD和 down-ldhD，PCR扩增体系与之前保持一致。
[0072] ?〇?的扩增条件如下：94°(：预变性3111111，94°(：变性308,58°(：退火158,72°(：延伸 60s，30个循环后72°C延伸10min。所得的PCR产物经0. 7 %的琼脂糖凝胶电泳检测，得到 大小约为lkb左右的电泳条带，将PCR产物纯化。利用Hind III和BamH I分别双酶切 up-ldhD和质粒pSET4E，将酶切产物连接后转化大肠杆菌XLl-blue，经PCR及酶切鉴定获得 阳性菌株，得到将up-ldhD克隆至pSET4E多克隆位点的重组质粒pSET4E-up-ldhD，然后再 用BamH I和EcoR I分别双酶切down-ldhD和pSET4E-up-ldhD，酶切产物连接后转化大肠 杆菌XLl-blue，经PCR及酶切鉴定获得阳性菌株，成功地获得D-乳酸脱氢酶基因敲除质粒 pSET4E-AldhD(SEQ ID N0:26)(见图 3)。
[0073] (2)发生第一次同源重组的单交换菌株的筛选
[0074] 与ldh基因发生第一次同源重组的单交换菌株筛选步骤一致，不过进行单交换子 验证时所用引物不同，设计引物单交换1 (ldhD) -F、单交换1 (ldhD) -R(SEQ ID N0:27-28)检 测通过up-ldhD重组的第一种单交换的形式，单交换2 (ldhD) -F、单交换2 (ldhD) -R (SEQ ID NO:29-30)检测通过down-ldhD重组的第二种单交换的形式（见图5)。
[0075] (3)发生第二次同源重组的基因敲除菌株的筛选
[0076] 与ldh基因发生第二次同源重组的基因敲除菌株的筛选过程一致，不同的是进行 PCR验证时用引物up-F-ldhD和down-R-ldhD进行PCR扩增，另外用扩增ldhD基因部分区 域的引物 ldhD-F、ldhD-R(SEQ ID N0:31-32)进行 PCR 验证。
[0077] 对于用up-F-ldhD和down-R-ldhD只能扩增出约2kb大小PCR产物（含up_ldhD 和down-ldhD)，ldhD-F和ldhD-R扩增不出相应大小产物的菌株，即为发生第二次同源重组 ldhD基因敲除的菌株。
[0078] 通过该方法得到一株ldhD基因敲除的菌株命名为Pediococcus acidilactici TY112 (PCR验证见图6)，已于2013年12月31日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会 普通微生物中心（简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院 微生物研究所），保藏登记号为0611〇：勵.8664，其分类命名为乳酸片球菌（?6(11〇(3〇(^1^ acidilactici)〇
[0079] 实施例4 :基因敲除菌株的应用
[0080] 构建得到两株基因敲除菌株后，需要将其与原始菌株的基本性能进行比较。
[0081] 乳酸构型的测定：将 P. acidilactici DQ2、P. acidilactici ZP26、 P. acidi 1 actici TY112-80 °C冻存的甘油管分别接种至20mL简化MRS培养基中，42 °C、 150印111培养1211后，以10%接种量转接至501^简化1?3液体培养基（添加128/10 &〇)3) 中，42°C、150rpm培养，取12h样品利用Megazyme D-/L_Lactic acid Kit试剂盒测定乳酸 的光学纯度，结果如表1，P. acidilactici ZP26、P. acidilactici TY112可以产光学纯度超 过99%的乳酸，说明了 D、L-乳酸脱氢酶基因的敲除发挥了应有作用。
[0082] 生长曲线的比较：将 P. acidilactici DQ2、P. acidilactici ZP26、 P. acidi 1 actici TY 112-80 °C冻存的甘油管分别接种至20mL简化MRS培养基中，42 °C、 150rpm培养12h，之后以10 %接种量转接至50mL简化MRS液体培养基中，42°C、150rpm培 养，测生长曲线，如图7。从图中可以看出P. acidilactici DQ2、P. acidilactici ZP26生 长差别不大，P. acidilactici TY112稍差，说明这两个基因的敲除对菌株的生长影响较小。
[0083] 生成乳酸的比较：将 P. acidilactici DQ2、P. acidilactici ZP26、 P. acidi 1 actici TY 112-80 °C冻存的甘油管分别接种于20mL简化MRS培养基中，42 °C、 150rpm培养12h，之后以10%接种量转接至50mL简化MRS液体培养基（添加12g/L CaC03) 中，42°C、150rpm培养，定期取样测定乳酸及葡萄糖浓度，如图8。DQ2的糖耗要稍快一点，其 他两种菌稍慢。l〇h时DQ2消耗完糖，ZP26和TY112还有残糖存在，DQ2、ZP26、TY112的乳 酸得率分别为85%、82. 3%和95. 4%。以上结果说明这两个基因的敲除对乳酸的生产影响 也较小。
[0084] 表1突变株乳酸构型的测定
[0086] 以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人 员，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为 本发明的保护范围内。
【主权项】
1. 一种基于同源重组的乳酸片球菌DQ2的无标记基因敲除方法，步骤包括： (1) pSET4E质粒的构建：pSET4S质粒是一种温度敏感型大肠杆菌-革兰氏阳性细菌 宽宿主范围穿梭型质粒，37°C下该质粒可在大肠杆菌中复制，但是在一些链球菌如猪链球 菌、马链球菌、停乳链球菌中会很快丢失；PSET4S质粒含有壮观霉素抗性基因，而乳酸片 球菌DQ2对壮观霉素具有很高的抗性，但对红霉素非常敏感，因此用红霉素抗性基因取代 PSET4S的壮观霉素抗性基因得到pSET4E质粒； (2) 将要敲除的靶基因上下游同源片段各约lkb分别克隆至pSET4E上，获得靶基因的 敲除质粒； (3) 将敲除质粒通过电转化进入乳酸片球菌DQ2中，得到含敲除质粒的菌株； (4) 将含敲除质粒的菌株在质粒复制受阻的较高温度42°C下培养，在含红霉素的选择 平板上筛选发生第一次同源重组即质粒整合到受体菌染色体上的单交换子； (5) 将单交换子在无红霉素且较低温度28°C下培养，连续转接1-10次并在同样条件下 培养，直至筛选得到发生第二次同源重组无红霉素抗性实现靶基因敲除的菌株； 其特征是： 步骤（1)所述的PSET4E质粒的构建方法是：用红霉素抗性基因取代pSET4S的壮观霉 素抗性基因；以pMG36e质粒（SEQIDNO:l)作为模板，设计引物Emr-F(SEQIDNO :2)和 Emr-R(SEQ ID NO:3)PCR扩增红霉素抗性基因 Emr(SEQ ID N0:4);分别用限制性内切酶Spe I对Emr基因片段以及质粒pSET4S进行单酶切，为了避免连接过程中单酶切的质粒片段发 生自连，对单酶切后的质粒进行去磷酸化处理，之后将目的基因片段与质粒进行连接，转化 大肠杆菌XLl-blue，利用引物Emr-F和Emr-R进行PCR验证，同时酶切验证得到正确质粒 PSET4E ； 步骤⑵所述的获得靶基因敲除质粒的方法是：设计引物用PCR方法分别扩增乳酸片 球菌靶基因的上游和下游、大小约为lkb的同源片段，先后按一定方向克隆至pSET4E的多 克隆位点，得到该靶基因的敲除质粒； 步骤（3)将敲除质粒通过电转化进入乳酸片球菌DQ2得到含敲除质粒的菌株方法是： 将1 μ g质粒（大约10 μ U与80 μ L乳酸片球菌DQ2感受态细胞混合，在2000V、200 Ω、 25 μ F (1mm电击杯）条件下电击，电击后迅速将菌液转移到lmL的复苏液里冰置5min，后转 移到28°C培养箱中培养2. 5h，5000rpm离心4min，吸取800 yL上清，剩下的混匀后涂布于 含红霉素的MRS平板，28°C培养3d左右长出转化子，挑取阳性克隆进行PCR验证； 步骤（4)所述发生第一次同源重组使质粒整合到受体菌染色体上的单交换子的验证 方法是：将含敲除质粒的乳酸片球菌DQ2接种至添加红霉素的MRS培养基中28°C、150rpm 条件下培养到对数期，以获得大量含敲除质粒的菌株，然后以1%的接种量将上述菌液接种 到不含红霉素的MRS培养基中，42°C (在该温度下，质粒不能进行复制，筛选得到的对红霉 素有抗性的菌株即为发生单交换的菌株）、150rpm条件下培养到稳定期，上述菌液稀释10 6 倍后涂布于含有红霉素的MRS平板上42°C培养，获得发生第一次同源重组使质粒整合到受 体菌染色体上的单交换子，设计引物进行PCR验证； 步骤（5)所述筛选发生第二次同源重组实现靶基因敲除的菌株的方法是：将单交换子 接种到含红霉素的液体MRS培养基中42°C、150rpm培养至稳定期，以1 %的接种量将上述菌 液接种到MRS培养基中，28°C (在低温下激活整合到基因组上的质粒片段进行滚环复制，通 过同源重组方式发生剪切）、150rpm条件下培养到稳定期，将培养液以1 %的接种量接种到 MRS培养基中，相同条件培养以获得第二次培养液，长到稳定期后同样接种到MRS培养基中 进行培养，从而获得第三次的培养液，最多转接10次直至筛选到发生第二次同源重组实现 靶基因敲除的菌株；将每次培养的菌液稀释1〇 6倍后涂布MRS平板，42°C培养，用牙签挑取 长出的单菌落，分别点种在含有红霉素和不含有红霉素的MRS平板上，42°C培养；对于在不 含有红霉素的平板上可以生长而在含红霉素平板上不能生长的菌株，应该是发生双交换同 源重组的菌株；设计引物进行PCR验证，从而得到靶基因敲除的突变株。2. 根据权利要求1所述的一种基于同源重组的乳酸片球菌DQ2的无标记基因敲除方 法，其特征是：所述PSET4E质粒为pSET4S质粒的Spc基因被Emr基因替换得到的。3. 根据权利要求1所述的一种基于同源重组的乳酸片球菌DQ2的无标记基因敲除方 法，其特征是：所述敲除质粒的构建是把要敲除基因的上游和下游大小约为lkb的同源片 段分别按一定方向克隆到PSET4E的多克隆位点。4. 通过这种基因敲除方法制备的乳酸片球菌DQ2的L、D-乳酸脱氢酶基因敲除菌株 P.acidilactici ZP26、P.acidilactici TY112,其保藏号分别为 CGMCC N0.8665、CGMCC NO. 8664。5. 根据权利要求4所述的L、D-乳酸脱氢酶基因敲除菌株P. acidilactici ZP26和 P.acidilactici TY112,其特征在于发酵生产光学纯D-乳酸、L-乳酸，基因敲除对这两株 菌的生长影响较小，对发酵性能的影响也较小。
【文档编号】C12N15/74GK105821071SQ201510006121
【公开日】2016年8月3日
【申请日】2015年1月6日
【发明人】鲍杰, 张鹏, 涂毅, 高秋强, 张建
【申请人】华东理工大学