一种利用Nisin发酵废菌体抑制乙醇发酵过程中乳酸菌生长的方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及一种利用Nisin发酵废菌体抑制乙醇发酵过程中乳酸菌生长的方法。
【背景技术】
[0002] 乳酸链球菌素(英文名称Nisin)亦称乳酸链球菌肤，是乳酸链球菌产生的一种多 肤物质，由34个氨基酸残基组成，分子量约为3500化。由于Nisin可抑制大多数革兰氏阳性 细菌，如肉毒梭菌、金黄色葡萄球菌、溶血链球菌、利斯特氏菌，并对芽抱杆菌的芽抱有强烈 的抑制作用，因此被作为食品防腐剂广泛应用于食品行业。通常，产芽抱的细菌耐热性很 强，如鲜乳采用135°C、2秒超高溫瞬时灭菌，非芽抱细菌的死亡率为100%，芽抱细菌的死亡 率90%，还有10%的芽抱细菌不能杀灭。若鲜乳中添加0.03-0.05g/kg Nisin就可抑制芽抱 杆菌和梭状芽抱杆菌抱子的发芽和繁殖。根据研究结果表明，乳酸链球菌素的抗菌作用是 通过干扰细胞V膜的正常功能，造成细胞膜的渗透，养分流失和膜电位下降，从而导致致病 菌和腐败菌细胞的死亡。
[0003] 在现代发酵工业中要得到理想的发酵产物一般是进行纯种培养，不仅前期种子所 在的斜面W及培养基要求严格无菌，而且在发酵过程中也要求经过严格灭菌处理。但是目 前与酵母相关发酵行业生产的一个重大问题是如何保持在较长的发酵周期内不污染杂菌， 尤其是革兰氏阳性的乳酸菌和芽抱杆菌，即如何很好地控制和解决在发酵过程中的染菌问 题。因为一旦在发酵过程中污染杂菌，轻则会影响最终乙醇的产量和质量，严重时甚至要倒 罐，使企业蒙受重大的经济损失。酵母相关发酵行业，比如活性酵母发酵剂、燃料乙醇、食用 酒精、啤酒酿造等，在发酵生产过程中经常受到醋酸菌、乳酸菌和芽抱杆菌等革兰式阳性杂 菌的污染。
[0004] 酵母相关发酵过程中的污染杂菌问题会给相关企业造成严重经济损失。比如工业 乙醇行业，会造成乙醇产量显著降低。革兰氏阳性杂菌在发酵过程中对酵母菌的影响主要 通过W下两种方式:首先是杂菌与酵母菌本身竞争环境中的碳源、氮源、维生素和微量元素 等营养成分，运将使酵母细胞自身的生长繁殖和生理代谢产生严重威胁;其次是乳酸菌产 生的各种副产物(如乳酸和乙酸)将会对酵母菌自身菌体的生长和预期终产物(如乙醇）的 合成带来极大的抑制作用，从而造成产品产量和质量的严重下降。
[0005] 在酵母相关发酵行业中污染的杂菌主要是细菌，而在染菌的发酵罐中乳酸含量常 常会有明显的升高，也已证明乳酸菌是酵母相关发酵行业中最常见的杂菌。乳酸菌(lactic acid bacteria,LAB)是一类能利用可发酵碳水化合物产生大量乳酸的革兰式阳性细菌的 通称，依据代谢途径的不同，分为同型发酵乳酸菌和异型发酵乳酸菌。同型发酵乳酸菌在发 酵过程中主要产生乳酸;而异型发酵乳酸菌不仅产生乳酸，还产生乙酸等有机酸。在酵母发 酵相关工业中主要杂菌是异型乳酸菌。Skinne和Leathers发现酵母生长繁殖过程中的杂菌 W乳酸杆菌为主。化ang和Kim则发现在工业乙醇发酵过程中主要污染菌是植物乳杆和干酪 乳杆菌。乳酸菌自身繁殖速度极快，而且对一定的酒精度和低pH值都有不同程度的耐受性， 现有的乙醇发酵条件同样适合某些乳酸菌的生长和代谢。
[0006] 目前酵母相关发酵行业中抑制杂菌污染的主要措施是添加青霉素等抗生素，并且 在实际应用中发挥了很大的作用。但是随着青霉素的使用，多抗性菌株也相继出现，运给发 酵染菌带来了更大的压力。另一方面，虽然人们一直认为青霉素性质活泼，在后期的蒸馈过 程中可W得到分解并不会残留，但是大量的数据证明，目前工业中抗生素的滥用不可避免 的会给周边的生态环境带来不良影响。滥用抗生素所引起的环境问题，W及耐药菌大量出 现等问题已经引起各国政府及普通民众的日益关注。因此，寻找更为安全有效的替代方法 已经成为酵母发酵相关业者越来越迫切的愿望，尤其是与食品相关的发酵行业。
[0007] 除了添加青霉素等抗生素，有些厂家还会采取添加酸性物质，从而降低培养基pH 的方法。运主要是基于细菌在抑低于4.0时不能再继续良好生长，而酵母菌则仍可W正常生 长。酵母最适的生长pH为4.0~6.0,而大多数乳酸菌的最适抑为5.0~7.0。例如，在工业乙 醇发酵中经常会加入硫酸，W起到降低pH的作用。然而目前在发酵过程中采用加酸抑菌的 方式只能用在燃料乙醇的生产中。由于加入的硫酸最终不能彻底分离出来，残留的硫酸会 对人体健康造成不利影响，因此在饮料酒、食用酒精和食品酵母发酵剂发酵过程中不能应 用；另一方面，随着硫酸加入量的增加，会加大对发酵设备的腐蚀性。而NisMno等对工厂发 酵液pH对乙醇产量的影响进行研究时发现，一般情况下发酵液的pH会维持在4.0~4.5。
[0008] 另外，还有一些研究采用生物防控的方式。例如，筛选可W耐受乳酸、乙酸等有机 酸的酵母菌株，或筛选可W针对某种乳酸杆菌的隧菌体，但运些方法均有很大的局限性。比 如，筛选耐受乳酸和乙酸的菌株，仍不能解决革兰氏阳性杂菌与酵母竞争营养物质的问题； 而筛选到的隧菌体只能针对一种乳酸菌进行有效地抑制作用，而对其他种类的乳酸菌却不 能起到良好的杀灭作用，而且生产足够量的隧菌体本身就是个技术难题。
[0009] 酒精作为一种可再生生物能源倍受世界各国的关注。由于酒精发酵过程没有高溫 灭菌步骤，主要通过抑等工艺调节来抑制杂菌污染，受到原料品质、地区气候等影响。一些 产家曾通过添加一定量抗生素来增强抑制作用，但是滥用抗生素会带来环境污染等一系列 负面影响，已被禁止添加。
[0010] 乙醇生产过程中，酵母活性至关重要。营养物的浓度W及污染菌的控制水平影响 酵母活性的两大因素。W乳酸和乙酸为典型产物的杂菌含量也影响到酵母活性W及乙醇转 化效率。通常条件下，乙醇生产中乳酸含量在1. Og/LW下，乙酸含量在0.5g/LW下。杂菌含 量过高会争夺发酵液中营养元素 W及糖分，降低发酵pH，降低酵母细胞数W及酵母活性，最 终影响到总糖转化率和乙醇产量。在受到杂菌污染的乙醇发酵液中经常能够分离到异型发 酵的乳酸菌，运些乳酸菌是导致乳酸和乙酸等杂酸副产物积累的主要原因。添加抗生素可 有效抑制乳酸菌等杂菌的生长，但容易产生耐药性菌株并可能会导致副产物饲料产生抗生 素残留，进而影响人类食物链。因此寻找替代抗生素的抑菌剂是提高燃料乙醇工厂产品品 质的重要工作内容之一。
[00川当发酵液中初始乳酸菌数量达到IO8C即/血时，乙醇的产量会有明显的减少，而且 一定浓度的乳酸和乙酸都会抑制酵母菌的生长。染菌发生的时间不同对发酵生产的影响也 不同，若在开始发酵之前就染菌比在接种时染菌对于乙醇产量的负面影响大得多，而且残 留在发酵液中的乳酸、乙酸也会对酵母菌产生更大的抑制作用。因此在工业上常常通过测 定乳酸和乙酸的浓度来判断污染的严重程度。
[0012] 成品Nisin目前在市场上售价仍然较高，因此虽然直接添加 Nisin也会对乙醇发酵 过程中污染的乳酸菌起到抑制作用，但由于其较高的成本必将限制商品Nisin在乙醇发酵 工业中的应用。目前国内Nisin年产能已经达到1500吨，生产出来的废菌体超过500吨。目前 的Nisin生产废菌体主要被无害化处理了，不仅附加值不高，而且为生产企业增加了环保处 理成本。废菌体中仍然含有较高的没有提取干净的Nisin。如果是湿菌体，残留的Nisin为 200~2000IU/mg;如果是干菌体，残留的Nisin为50~500IU/mg。如果将之利用起来，将为生 产企业创造数百万元的价值，变废为宝。此外，利用Nisin发酵废菌体生产酵母及其相关发 酵产品还有一个好处，那就是在发酵过程中可W增加额外的迟效微生物氮源，从而提高乙 醇产量。
【发明内容】
[0013] 本发明主要目的是为了解决抗生素对乙醇发酵行业所带来的各种问题，如食用乙 醇生产过程中禁止添加抗生素，而目前尚无成本低廉而不会造成食品安全问题的合适的乳 酸菌抑制办法;再比如，在燃料乙醇发酵过程中由于长期添加青霉素，导致生产环境中耐药 性细菌的增加，而导致青霉素添加量正在逐年上升，进一步造成了环境问题。因此，寻找可 W替代抗生素的可W有效抑制乙醇发酵过程中乳酸菌污染的抑菌物质，从而提高乙醇发酵 产量和质量。
[0014] 本发明的一种利用Nisin发酵废菌体抑制乙醇发酵过程中乳酸菌生长的方法，它 是按照W下步骤进行：
[0015] 在乙醇发酵接种的同时，向乙醇发酵培养基中直接添加含水量为1 %~20 %的 Nisin发酵废菌体，Nisin发酵废菌体的添加量为占乙醇发酵培养基重量0.05%。~0.50% ;
[0016] 其中，Nisin发酵废菌体的制备方法为：
[0017] -、利用陶瓷膜对Nisin发酵液进行废菌体分离，分离得到含废菌体浓浆，该废菌 体浓浆为原发酵液的1/20~1/25,其固形物含量为10%~15%，水分含量为85%~90% ;
[0018] 二、利用=项转鼓离屯、分离机对步骤一的废菌体浓浆进行离屯、，离屯、转速为8000 ~100(K)r/min，离屯、时间为5~lOmin，离屯、后收集固相物即为湿废菌体，湿废菌体水分含量 为 20%~30%;
[0019] S、向步骤二离屯、后的湿废菌体中混入质量百分含量为1.0%~3.0%的吐溫80、 质量百分含量为0.1 %~1.0%维生素 C钢盐，得混料;其中，湿废菌体:吐溫80的质量比为1: 0.01~0.03;湿废菌体:维生素 C钢盐的质量比为1:0.0 Ol~0.01;
[0020] 四、将步骤=得到的混料在溫度为20~50°C、0.6~0.9个大气压条件下进行真空 低溫干燥，物料添加量为30%~40%，干燥时间为50~60min，干废菌体出料的水分含量为 3%~15%，即得到NiSin发酵废菌体。
[0021] 处理好的干废菌体，应该在乙醇发酵的前期，即从封罐到发酵的前12h，最优化的 是在灭菌后接种前加入Nisin发酵废菌体。
[0022] 步骤四中所述的物料添加量是指每次干燥时向真空低溫干燥箱中填料的比例，及 工作体积为