专利名称：一株乳酸乳球菌乳亚种及其在枯萎病防治中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一株乳酸乳球菌乳亚种及其在枯萎病防治中的应用，特别涉及乳酸乳球菌乳亚种抗枯2号及其在防治香蕉枯萎病中的应用。
背景技术：
植物枯萎病是一种世界性的真菌土传病害，病原菌从根部危害作物，引起维管束病害，造成植株枯死，在植株的整个生长期均可发病。植物枯萎病会严重影响作物的产量，以瓜类枯萎病为例，病田一般减产20% 30%，严重的情况下可减产50% 60%，甚至绝产。香蕉枯萎病(Fusarium oxysporum f. sp. cubense)是破坏香蕉维管束导致植株死亡的毁灭性病害。其病菌腐生能力很强，在土壤中可长期存活。香蕉枯萎病是典型的土传病害，侵染来源主要是带菌的吸芽、病株残体及带菌土壤。香蕉枯萎病1996年在广州市开始发生。近几年来，该病扩散蔓延速度快，发病程度逐年加重。2000年全市香蕉发病面积97. 33 hm2，主要发生在番禹区万顷沙镇；2001年发病面积377. 33hm2 ；2002年发病面积1266. 67hm2 ；2003年全市香蕉种植面积11666. 67hm2， 发病面积3855. 93hm2。广州市春植蕉香蕉枯萎病在6—7月开始发病，8—9月病害逐步加重，10—11月为发病高峰期；秋植蕉发病高峰期在翌年6月份，植株发病后死亡率高。香蕉外观发病症状往往表现在抽蕾期至挂果期，因而容易造成失收，经济损失较为严重。发病重的蕉田第一年发病率为10%，第二年发病率为20% — 30%，第三年发病率达70%以上，遭此危害的蕉田基本上不能继续种植香蕉。目前，主要通过选育抗菌新品种、轮作及最广泛的化学药剂防治。选育抗病新品种需要的时间长，得到的抗病品种不一定优质、高产，种植的经济效益低下。轮作同样受到经济、土地等因素的影响，难以实现。化学药剂防治会造成农药残留，且防治效果不佳。生物防治枯萎病具有环境友好，防治效果好等优点，越来越受到人们的欢迎。如木霉对多种病菌具有很好的抑制作用；丛枝菌根真菌(AM)可与植株根系建立互惠共生体，选择性抑制部分病原微生物，减少枯萎病的发生率，促进植株生产、提高产量、改善品质，提高植株的抗逆性。此外，还有非致病尖孢镰刀菌，可以诱导植株产生针对枯萎病原菌的抗性，可以减轻枯萎病的影响。但是非致病尖孢镰刀菌使用不当，则会引起更为严重的枯萎病，后果严重。江苏省农业科学院陈志谊等经过多年生物防治水稻病害的研究获得了防治水稻纹枯病的效果达50 .0% 81 .0 %的枯草芽孢杆菌B-916菌株，现已在江苏等地得到广泛推广。黑龙江省科学院应用微生物研究所研发的枯草芽孢杆菌水剂主要防治瓜类及保护地蔬菜枯萎病、立枯病和豆类根腐病，已在黑龙江等地进行推广应用。目前乳酸乳球菌乳亚种在生产实际中主要应用于如酸奶、硬干酪和软干酪等乳制品生产上的发酵环节。
国内外均未报导乳酸乳球菌乳亚种可用于枯萎病，特别是香蕉枯萎病的防治。
发明内容
本发明的目的在于提供一株乳酸乳球菌乳亚种。本发明的另一个目的在于提供上述乳酸乳球菌乳亚种在生物防治香蕉枯萎病中的应用。本发明的乳酸乳球菌乳亚种(ZaciococcM lactis subsp. Laciis)抗枯2号，于 2011年7月8日送至位于武汉大学的中国典型培养物保藏中心并登记入册，保藏号为CCTCC NO :M2011M4，培养物的活性由保藏中心于2011年7月14日检测完毕，结果为存活。本发明的菌株，易于培养，使用方便，对香蕉枯萎病有很好的防治作用。
图1是本发明菌株对香蕉枯萎病的抑制作用效果图。
具体实施例方式、菌株的筛选
该菌株分离来源于葱叶，在室内无菌条件下用75%酒精对新鲜葱叶进行表面消毒，后用镊子撕下一小块葱叶，再将葱叶放置于NA培养基(其成分如下蛋白胨10g/L、肉膏粉3g/ L、氯化钠5g/L、琼脂15g/L、pH7. 3士0. 2)上，放置时葱的叶肉组织贴于培养基，表面朝上。 后将培养皿倒置于培养箱内进行培养，2天后再进行培养物纯化，经过2-3次纯化后得到纯的单菌株培养物。抗枯2号的形态特征
1、菌落表面光滑半透明，边缘整齐；
2、球状或卵圆形，有时因细胞伸长而似杆状。抗枯2号的生理生化特征
1、革兰氏阳性；
2、厌氧生长试验呈阳(+)性；
3、接触酶实验呈阴(一)性；
4、氧化酶实验呈阴(一)性
5、明胶液化试验呈阴(一)性；
6、硝酸盐还原试验呈阴(一)性；
7、耐盐性试验4%NaCl呈阳(+)性，6. 5%NaCl呈阴(一)性；
8、淀粉水解实验呈阴(一)性；
9、乳糖、麦芽糖和核糖呈阳(+)性，甘露醇、棉籽糖、蜜二糖和松三糖呈阴(一)性；
10、生长温度在15°C时呈阴(一)性，37和40°C时呈阳(+)性，50°C时呈阴(一)性；
11、糖醇类发酵试验D-葡萄糖和L-阿拉伯糖呈阳性，D-甘露醇、D-木糖和葡萄糖产气呈阴(一)性；
12、精氨酸水解呈阳(+)性。根据以上形态特征及生理生化实验结果，查《伯杰细菌鉴定手册》及《常见细菌系统鉴定》可知抗枯2号与Zaciococctts lactis subsp. Lactis (乳酸乳球菌乳亚种)最相似。抗枯2号的分子分类学地位
提取抗枯2号的16S rRNA，测序，其序列如SEQ ID NO 1所示。实序承\与Lactococcus lactis subsp. Lactis (乳酸乳球菌乳亚种)的同源性达99. 9%，是一种乳酸乳球菌乳亚种菌株。抗枯2号的抗枯萎病实验
在室内无菌条件下将每ml含3. 7\107个乳酸乳球菌乳亚种03^%% lactis subsp. Lacii1S)的菌液涂在NA培养基上，盖上培养皿自然晾干后，取直径为0.8cm香蕉枯萎病菌放置于平板中央，并将放置在未涂乳酸乳球菌乳亚种(L^tococcm lactis subsp. Lactis)菌液的NA培养基上的处理作空白对照组。96小时后观察不同处理组的香蕉枯萎病病原菌的生长情况，并测量其直径的大小。表1乳酸乳球菌乳亚种(Laciococcws lactis subsp. Laciis )对香蕉枯萎病菌的生长抑制作用
权利要求
1.乳酸乳球菌乳亚种抗枯2号，其保藏号为CCTCCNO :M2011244o
2.权利要求1所述的乳酸乳球菌乳亚种抗枯2号在防治枯萎病中的应用。
3.权利要求1所述的乳酸乳球菌乳亚种抗枯2号在防治香蕉枯萎病中的应用。
全文摘要
本发明公开了乳酸乳球菌乳亚种抗枯2号，其保藏号为CCTCCNOM2011244。该菌株易于培养，使用方便，可很好的防治香蕉枯萎病。
文档编号C12R1/01GK102399716SQ20111031660
公开日2012年4月4日 申请日期2011年10月18日 优先权日2011年10月18日
发明者廖永林, 张扬, 张振飞, 李燕芳, 肖汉祥 申请人:广东省农业科学院植物保护研究所