可在乳酸乳球菌表面展示表达异源基因的载体及其制备方法与应用的制作方法

专利名称：可在乳酸乳球菌表面展示表达异源基因的载体及其制备方法与应用的制作方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域，涉及一种可在乳酸乳球菌中表达外源蛋白、且使表达蛋白展示于菌体表面的表达载体，同时还涉及该载体的制备方法与应用。
背景技术：
目前，对于一些消化道病原体感染，例如幽门螺杆菌(Helicobacter pylori, H.pylori)感染，由于采用抗菌素治疗可使细菌耐药性增加、且对重复感染无预防作用，故对这类疾病更有效的防治只能寄希望于疫苗的研究成功。在疫苗研究中，口服疫苗以其免疫途径安全、合理、方便等优点而受到关注[Levine MM. 〃IDEAL〃vaccines for resource poorsettings. Vaccine, 2011,29 Suppl 4:D116_25.]。但是，目前口服疫苗研究发展因缺乏理 想的疫苗载体而受到制约[Zhang S，Moise L, Moss SF. H. pylori vaccines:why we stilldon’t have any. Hum Vaccin, 2011, 7 (11) : 1153-7. ] 现有研究多米用减毒伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)作为口服疫苗载体[Becher D, Deutscher ME, SimpfendorferKR, Wijburg 0L, Pederson JS, Lew AM, Strugnell RA, Walduck AK. Local recallresponses in the stomach involving reduced regulation and expanded helpmediate vaccine-induced protection against Helicobacter pylori in mice. Eur JImmunol, 2010, 40 (10) : 2778-2790.]，结果显示，虽然此类候选疫苗株在动物体内可产生较好的免疫效果，但由于存在安全性问题，而不适用于婴幼儿、老年人及免疫缺陷者。探讨更安全有效的口服疫苗载体是该领域研究的发展趋势，对口服疫苗的研制起关键性作用。乳酸乳球菌(Lactococcus lactis, L. lactis)是乳酸菌类的一个菌种，在食品加工中的应用已有悠久的历史，属于食品级益生菌，安全性十分可靠，而且其生长迅速，易于培养，遗传背景和调控机制相对清楚，具有用作口服疫苗载体的很大潜力[Morello E, Bermudez-Humardn LG,Llull D, et al.Lactococcus lactis,anefficient cell factory for recombinant protein production and secretion.J Mol Microbiol Biotechnol, 2008，14 (1-3) : 48-58.]。目前应用最为广泛的乳酸菌表达系统是 NICE (Ni s in-control led expression)系统[Ribeiro LA, Azevedo V, LeLoirY, et al. Production and targeting of the Brucella abortus antigen L7/L12in Lactococcus lactis: a first step towards food-grade live vaccines againstbrucellosis. Appl Environ Microbiol, 2002, 68 (2) : 910-916.]。在此系统中，NisK是敏感激酶，NisR是反应蛋白，当有微量的乳酸链球菌素nisin加入该表达系统时，即可被蛋白激酶NisK识别并与之结合,而结合nisin的NisK通过磷酸化激活NisR,激活的NisR蛋白即诱导连接于nisA启动子后的目的基因表达。为了使用NICE系统进行基因表达，受体蛋白和反应因子基因即nisK和nisR被分离并整合到合适宿主菌的基因组中，而nisA启动子基因则整合到质粒上，当目的基因克隆到启动子下游且质粒转化入nisKR阳性菌株中，在宿主菌生长至对数生长期时加入微量nisin即可诱导目的基因表达[Mierau I, KleerebezemM.IOyears of the nisin-controlled gene expression system(NICE)in Lactococcuslactis. Appl Microbiol Biotechnol, 2005，68 (6) :705-17. ]。NICE 表达系统具有以下优点诱导剂nisin在食品工业中作为防腐剂应用已有多年，被认为是具有食品级安全性的添加剂；nisin价格低廉,而且用量很小；加入nisin后目的蛋白能达到较高的表达水平。[Kuipers OP, de Ruyter PG, Kleerebezem M, et al. Controlled overproduction ofproteins by lactic acid bacteria. Trends Biotechnol, 1997，15 (4) : 135-140.]。正是由于NICE系统的上述优点，该系统已成为乳酸菌类最有前途的诱导表达系统之一。在NICE表达系统中，PNZ8149与pNZ8110为常用的两个表达载体，采用的宿主菌NZ3900染色体基因组含有的nisK和nisR基因，载体pNZ8110和pNZ8149均含有nisA启动子PnisA。应用pNZ8110或pNZ8149为载体，将外源基因整合到启动子PnisA下游后，加入诱导剂即可诱导外源蛋白在乳酸乳球菌胞内或分泌表达，但不具有在菌体表面展示表达外源蛋白的功能[Sanchez B，Lopez P, Gonzalez-Rodrguez I, Suarez A, MargollesA,Urdaci MC.A f Iage11 in-producing Lactococcus strain:interactions with mucinand enteropathogens. FEMS Microbiol Lett, 2011, 318(2):101-7. //Zhang XJ, Duan G, Zhang R, Fan Q. Optimized expression of Helicobacter pylori ureB gene inthe Lactococcus lactis nisin-controlled gene expression (NICE)system andexperimental study of its immunoreactivity. Curr Microbiol. 2009, 58(4):308-14. //Chen S, Zhang R, Duan G, Shi J. Food-grade express ion of Helicobacterpylori ureB subunit in Lactococcus lactis and its immunoreactivity.CurrMicrobiol. 2011，62(6) : 1726-31.]。近年研究表明，作为口服疫苗载体，若能将表达的抗原展示于菌体表面则更有利于刺激胃肠黏膜免疫系统，而产生更好的免疫效果[翟伟强.减毒伤寒沙门氏菌作为表面展示疫苗载体的应用研究.华中农业大学，硕士学位论文，2011. 6，中国学术文献网络出版总库]。因此，作为口服疫苗抗原表达载体，PNZ8110或PNZ8149无表面展示表达外源蛋白功能，是一种技术缺陷。这不仅影响了该乳酸菌表达系统的应用范围，也对亟需疫苗载体的口服疫苗研究发展不利。应用分子生物学技术，将PNZ8110或pNZ8149改造成具有在菌体表面展示表达外源蛋白功能的新载体，是口服疫苗研制中技术发展的需要。

发明内容
针对上述问题，本发明的目的提供了一种可表面展示表达外源蛋白的乳酸乳球菌表达载体。同时，本发明的目的还提供了该载体的构建方法与应用。为了实现上述目的，本发明的技术方案采用了一种乳酸乳球菌表达载体，其核苷酸序列是序列表中SEQ ID NO. I所示的核苷酸序列，或与SEQ ID NO. I所示核苷酸序列存在至少95%同源性，或与SEQ ID NO. I所示核苷酸序列存在至少90%同源性。本发明提供的乳酸乳球菌表达载体pNZ8110_lysM(SEQ ID NO. I)，其含有以下元件来自乳酸乳球菌NZ3900基因组的IysM基因序列(SEQ ID NO. 2)和来自菌株乳酸乳球菌表达载体pNZ8110(SEQ ID NO. 3)的启动子Pnis、分泌信号肽序列ssusp45、多克隆酶切位点、复制子repC和repA及氯霉素抗性基因cm。
IysM元件是乳酸乳球菌自溶素(AcmA)锚定区基因序列，具有SEQ ID NO. 2所示的核苷酸序列。外源基因插入表达载体pNZ81 IO-IysM多克隆位点后,可与分泌信号肽序列ssusp45、IysM基因融合表达。ssusp45序列编码的信号肽可引导融合蛋白分泌至胞外,而IysM基因编码的锚定肽具有与细胞壁结合功能，因此融合蛋白可与细胞壁结合，而实现外源蛋白在菌体表面的展示表达。本发明的技术方案还采用了一种DNA序列，包含有SEQ ID NO. I所示的核苷酸序列。本发明的技术方案还采用了一种大肠埃希氏菌(Escherichia coli)MC1061/pNZ8110-lysM，于2012年5月16日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO. 6116。另外，本发明的技术方案还米用了一种乳酸乳球菌表达载体pNZ8110_lysM的构建方法，包括以下步骤
I)提取乳酸乳球菌NZ3900菌株的基因组DNA，根据Genbank数据库IysM基因序列(Genbank:AM406671. I)设计PCR引物，PCR扩增得到IysM基因；2)分别双酶切IysM及表达载体pNZ8110，回收纯化酶切片段，并用T4DNA连接酶进行定向连接，连接产物用于转化大肠杆菌Escherichia coli MC1061 ；3)通过氯霉素抗性筛选和PCR、酶切及测序鉴定，得到阳性转化菌株；4)培养得到的阳性转化菌，提取重组质粒，该重组质粒即为构建的乳酸乳球菌表达载体，将其命名为pNZ8110-lysM。本发明提供的乳酸乳球菌表达载体的构建方法中，用于扩增IysM基因的PCR引物是根据 GenBank 数据库中 L. lactis NZ3900 菌株的 IysM 基因序列(Genbank: AM406671. I),应用生物软件Primer 5. 0设计的，上游引物Pl的核苷酸序列为5’ -ACATGCATGCGACGGACGGAGCTTCTTCAGC-3’ (SEQ ID NO. 4);下游引物 P2 的核苷酸序列为:5，-GCTCTAGATTATGAACCACCTGAATTTGTAGAAG-3’ (SEQ ID NO. 5)。在上游引物5，端含Sph I酶切位点，在下游引物5，端含Xba I酶切位点。本发明提供的L. Iactis表达载体的构建方法中，所述的分别双酶切IysM和表达载体pNZ8110所采用的内切酶为Sph I和Xba I。本发明提供的L. Iactis表达载体pNZ8110_lysM的构建方法中，所述的用IysM与pNZ8110连接产物转化E. coli MC1061菌株的方法为常规大肠杆菌CaCl2转化法[J.萨姆布鲁克和D. W拉塞尔著，分子克隆实验指南，第三版，科学出版社，2002];用含氯霉素(10 u g/ml)的LB培养基筛选阳性转化菌，从平板上刮取阳性转化菌菌落，培养并提取质粒进行限制性酶切及测序鉴定，鉴定结果显示序列正确的重组质粒，即为构建的L. Iactis表达载体，将其命名为pNZ8110-lysM，本发明中将含有pNZ8110_lySM的E. coli菌株命名为Escherichia coli MC1061/pNZ8IIO-IysM0为鉴定表达载体pNZ8110-lysM的表面展示表达外源蛋白的功能，在实施例3中，以质粒PIRES2-EGFP(美国BD Biosciences Corporation)为模板，采用PCR方法扩增得到增强型绿色突光蛋白(Enhanced green florescence protein, EGFP)基因，通过限制性酶切和定向连接的方法，将EGFP基因与表达载体pNZ81 IO-IysM连接，并用连接产物电转化感受态L. lactis NZ3900菌株。经过氯霉素抗性筛选和限制性酶切、PCR及测序鉴定，获得携带EGFP基因的L. lactis重组菌，将其命名为Lactococcus lactis NZ3900/pNZ81IO-EGFP-IysM0该重组菌经培养和乳酸链球菌素nisin诱导表达后，取菌液涂片，用荧光显微镜检测EGFP的表达。结果显示，在荧光显微镜下可以清楚地观察到菌株L. IactisNZ3900/pNZ81IO-EGFP-IysM 所产生绿色荧光。在实施例3中，扩增EGFP基因的PCR引物是根据Genbank数据库中EGFP基因序列(GenBank:JN255744. I)，应用生物软件Primer 5. 0设计的，上游引物P3的核苷酸序列为5-ATAGCCGGCATGGTGAGCAAGGGCGAGG-3，(SEQ ID NO. 6),其 5’端含 Nae I 酶切位点；下游引物 P4 核苷酸序列为 5-ACAT GCATGCCTTGTACAGCTCGTCCATGCCG-3，(SEQ ID NO. 7)，其 5’端含Sph I酶切位点。本发明具有的有益效果由于表面展示表达疫苗抗原的疫苗株的口服免疫效果显著优于目前常用的胞内表达抗原的疫苗株，因此，作为疫苗载体，本发明提供的能够在L. Iactis表面展示表达 疫苗抗原的L. Iactis表达载体pNZ8110-lysM，比不具有表面展示表达功能的表达载体PNZ8110或pNZ8149，在理论上更为合理，在技术上有实质性进步，可以使疫苗产生更好的免疫效果，因而pNZ8110-lysM作为疫苗抗原表达载体，在口服疫苗制备中具有很大应用价值。本发明通过实验证明以L. lactis NZ3900为表达宿主菌、以pNZ81 IO-IysM为表达载体的表达系统能表面展示表达外源蛋白，例如，表达EGFP。在口服疫苗研制中，此表达系统比目前常用的以减毒伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)为宿主菌的表达系统安全性更可靠；同时又比现有的以L. lactis NZ3900为表达宿主菌、以pNZ8110为表达载体的表达系统，在技术上有显著进步，因为应用以L. lactis NZ3900为宿主菌、pNZ81 IO-IysM为表达载体的表达系统可实现将外源蛋白在菌体表面展示表达，可以提高免疫效果[翟伟强.减毒伤寒沙门氏菌作为表面展示疫苗载体的应用研究.华中农业大学，硕士学位论文，2011. 6，见于中国学术文献网络出版总库]。因此，本发明提供的以L. lactis NZ3900为宿主菌、以pNZ8110-lysM为表达载体的表达系统以其安全高效为明显优势和特点，在口服疫苗的制备中有非常大的应用价值。采用以L. lactis NZ3900为宿主菌、pNZ81 IO-IysM为表达载体构建的抗幽门螺杆菌等消化道病原体的口服疫苗菌株，不仅可用于疫苗的制备，还可以作为发酵菌株，用于乳制品或食品加工，可望产生具有巨大社会和经济效益。总之，在目前口服疫苗研制亟需安全有效疫苗载体的情况下，本发明提供的乳酸乳球菌表达载体PNZ81 IO-IysM及应用该载体构建的乳酸乳球菌表达系统具有深远应用前
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图I为L. Iactis表达载体pNZ8110_lysM构建示意图；图2为IysM基因PCR扩增产物电泳图；图中第I泳道为阴性对照，第2 5泳道为IysM基因扩增产物，第6泳道为DNA Marker ；图3为重组质粒pNZ8110_lysM的酶切鉴定图；图中泳道I为pNZ8110用Xba I酶切，泳道2为pNZ81 IO-IysM用Xba I酶切，泳道3为pNZ81 IO-IysM用Sph I和XbaI双酶切,泳道4为IysM的PCR产物，泳道5为DNA Marker ；图4为L. Iactis表达载体pNZ8110_EGFP_lysM构建示意图；图5为EGFP基因的PCR扩增产物电泳图；图中I 4为EGFP基因片段的扩增产物，5 为 DNAMarker ；图6为重组菌株MC1061/pNZ81 IO-EGFP-IysM的菌液PCR产物电泳图；图中I为阴性对照，2 5为EGFP基因片段扩增产物，6为DNAMarker ；
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图7为L. lactis NZ3900/pNZ81IO-EGFP-IysM中重组质粒酶切产物电泳图；图中I 为 Sph I 酶切 pNZ8110，2 为 Sph I 酶切 pNZ8110_EGFP_lysM，3 为 Sph I 与 Nae I 双酶切pNZ8110-EGFP-lysM，4 为 EGFP 基因片段的 PCR 产物，5 为 DNA ladder ；图8 为重组菌株 L. lactis NZ3900/pNZ81IO-EGFP-IysM 中 EGFP 的表达分析；图中A和C分别是荧光显微镜绿色光源下观察到的重组菌株NZ3900/pNZ81IO-EGFP-IysM和阴性对照NZ3900菌株；B和D分别是荧光显微镜白色光源下观察到的的重组菌株NZ3900/pNZ81IO-EGFP-IysM和阴性对照NZ3900菌株；表面表达EGFP的重组菌株与阴性对照菌株存在明显差异；证实重组菌株L. lactis NZ3900/pNZ81IO-EGFP-IysM构建成功。
具体实施例方式(一)本发明实验中使用的细菌菌株和质粒L. lactis NZ3900 菌株(lacF, pepN: :nisRnisK)购自荷兰 NIZO FoodResearch (Kernhemseweg，Netherlands) o 也可从德国 Mobitec 公司(Gottingen,Germany)购得。采用含150ml/L甘油的GM17培养基于_80°C保存L. lactis NZ3900菌种。L. Iactis 表达载体 pNZSllO 购自荷兰 NIZO Food Research (Kernhemseweg,Netherlands) 0其核苷酸序列为SEQ ID NO. 3所示，含启动子Pnis、分泌信号肽序列ssusp45、多克隆酶切位点、复制子repC和repA及氯霉素抗性基因cm等元件。pNZ8110为大肠杆菌-乳酸乳球菌穿梭载体(Shuttle vector)。质粒pIRES2_EGFP 是美国 BD Biosciences Corporation 公司销售产品。PIRES2-EGFP内含增强型绿色荧光蛋白EGFP基因。E.coli MClO6I 菌株(r araD139A (ara-leu) 7696 galE15 galK16 A (Iacc) X74rprpsL(Strr)hsdR2 (rK_ mK+)mcrA mcrBl)是常用基因工程菌株，属于公知技术,可于美国Boca Scientific Inc.公司或 Sigma-Aldrich 公司购得。( 二)本发明实验中使用的培养基及其配制⑴LB培养基LB液体培养基称取I. Og胰蛋白胨,0. 5g酵母浸粉,I. Og氯化钠，溶于IOOml蒸馏水中，用10mol/LNa0H调pH值至7. 2，121 °C高压灭菌20min，置4°C保存备用。LB固体培养基称取I. Og胰蛋白胨，0. 5g酵母浸粉，I. Og氯化钠，I. 5g琼脂粉，溶于IOOml蒸馏水中，用10mol/L NaOH调pH值至7. 2，121 °C高压灭菌20min，冷却至约50°C时倾注平板备用。⑵乳酸菌培养基GM17培养基称取4. 25g M17培养基，溶于80ml蒸馏水中，用10mol/LNa0H调pH值至7. 2，定容至100ml，121 °C高压灭菌20min，冷却后加入葡萄糖至终浓度为5. 0g/L。
GM17培养基平板称取4. 25g GM17培养基，I. 5g琼脂粉，溶于80ml蒸馏水中，用10mol/LNa0H调pH值至7. 2，定容至100ml，121 °C高压灭菌20min，冷却至约60°C时加入葡萄糖至终浓度为5. Og/L，混匀后将培养基倒入培养皿中，制成培养基平板。GSGM17培养基 称取85. 50g蔗糖，12. 50g甘氨酸，18. 63g M17培养基，溶于400ml蒸馏水中，用lOmol/LNaOH调pH值至7. 2，定容至500ml，高压灭菌。冷却后加入葡萄糖至终浓度为5. 0g/L。GM17MC 恢复培养基称取 3. 73g M17 培养基，0. 19g MgCl2, 0. 02g CaCl2，溶于 80ml蒸馏水中，用lOmol/LNaOH调pH至7. 2，定容至100ml，高压灭菌。冷却后加入葡萄糖至终浓度为5. 0g/L。(三)本发明实验中涉及的主要试剂M17培养基(青岛海博生物技术有限公司产品)、氯霉素(美国Amresco公司)、T4DNA连接酶和限制性内切酶Xba I和Sph I等(美国Fermentas公司)、凝胶回收试剂盒(杭州爱思进(AxyGen)生物技术有限公司)、质粒提取试剂盒和DNA Marker III (北京康为世纪生物科技有限公司)、RNA酶(RNase A)和PCR反应试剂盒(北京天根生化科技有限公司)、其他常用试剂均为国产分析纯级试剂。未作特别说明的实验材料与方法属于公知技术，在生物技术领域常用工具书，例如，分子克隆实验指南(J萨姆布鲁克和D. W拉塞尔著，第三版，科学出版社，2002)，中可查到。实施例1L. Iactis表达载体pNZ8110_lysM的构建L. Iactis表达载体pNZ8110_lysM的构建参见图I.I. L. lactis IysM 基因的制备I. 1L. lactis NZ3900 菌株基因组 DNA 的提取⑴从_80°C冰箱取出L. lactis NZ3900菌种保存管，从中取100 菌液接种到5mlGM17培养基中，于30°C、5%C02培养箱中静置培养12h 14h，取I. 5ml 3ml菌液，5000r/min离心5min，收集菌体。⑵用500 u I TE 缓冲液(IOmM Tris-Cl, ImM EDTA, pH8. 0)洗涤菌体一次。⑶用50iU TE缓冲液重悬菌体，加入溶菌酶至终浓度为10mg/ml，37°C水浴60mino⑷加入蛋白酶K至终浓度50 u g/ml，混匀后加入SDS溶液至终浓度10g/L，37°C水浴2h。(5)补充300 U I TE缓冲液，依次分别用等体积的苯酚、酚氯仿(苯酚与氯仿等体积混合物)、氯仿各抽提蛋白一次，10000r/min,离心15min。(6)加入2倍体积的无水乙醇和1/10体积的2. 5mol/L乙酸钠，轻柔颠倒离心管数次至出现絮状沉淀。(7) 10000r/min离心5min收集DNA，将沉淀用70%乙醇洗涤。(8)自然干燥后，用50 ill TE缓冲液溶解DNA。(9)用终浓度为50 u g/ml的RNaseA在37°C水浴中处理30min，得到基因组DNA。I. 2引物设计与合成根据GenBank核酸数据库中乳酸菌的IysM基因序列(Genbank:AM406671. 1)，利用生物软件Primer 5. O设计PCR引物，上游引物Pl序列为5’ -ACATGCATGCGACGGACGGAGCTTCTTCAGC-3’ (SEQ ID NO. 4);下游引物 P2 序列为:5’ -GCTCTAGATTATGAACCACCTGAATTTGTAGAAG-3’ (SEQ ID NO. 5)。在上游引物5’端含Sph I限制性酶切位点(下划线部分)，在下游引物5’端含Xba I限制性酶切位点(下划线部分)。由上海捷瑞生物工程有限公司合成。I. 3基因片段IysM的PCR扩增⑴PCR反应体系按PCR反应试剂盒(北京天根生化科技公司)说明，配制50 U I反应体系20iiM的上游引物liil，20iiM的下游引物liil，2XTaq PCR Master Mix25iil，NZ3900基因组DNA模板2iil，加去离子水至50 yl。⑵PCR循环条件95°C预变性2min，95°C变性30s，56 V退火30s，72°C延伸45s，共40个循环，最后72°C延伸5min。⑶PCR产物分析取3 ill PCR反应产物，于20g/L琼脂糖凝胶中电泳，电压为5V/ cm,用DNAMarker做分子量标记，电泳20min,用凝胶图像扫描仪分析。2. IysM基因及表达载体pNZ8110的双酶切分别将IysM基因和表达载体pNZ8110用限制性内切酶Sph I和Xba I进行双酶切。酶切体系质粒 PNZ8110 或 IysM基因 25 ii I，10XBuffer 5 ii I，SphI I u I,XbaI I u I,去离子水18ul。37°C酶切12h，65°C水浴20min灭活内切酶。取IysM基因双酶切产物5 yl于20gL的琼脂糖凝胶中电泳，取质粒PNZ8110双酶切产物5 ill用IOgL的琼脂糖凝胶进行电泳分析。4. IysM基因与质粒pNZ8110酶切产物的回收用凝胶回收试剂盒(杭州爱思进生物技术有限公司)回收纯化酶切片段，参照产品说明，步骤如下⑴取50 U I双酶切产物在琼脂糖凝胶中电泳20min，依据DNA Marker条带的相应位置，在紫外灯下切下含有目的片段的琼脂糖凝胶，用滤纸将凝胶表面液体吸干，然后装入I. 5ml的EP管中，称其重量，根据凝胶的重量估算凝胶体积(IOOmg的凝胶按100 U I体积估算)；⑵加入3个凝胶体积的溶液DE-A，混合均匀后于75°C水浴，间断混合，直到凝胶完
全熔化。⑶加入0. 5个Buffer DE-A体积的Buffer DE-B,混合均匀(在处理IysM基因双酶切产物时，需再加I个凝胶体积的异丙醇)。⑷将步骤三的混合液转移到DNA制备管中，12000r/min离心Imin,弃滤液。(5)将制备管置回2ml离心管,加500 ii I Buffer Wl, 12000r/min离心30s,弃滤液。(6)将制备管置回2ml离心管，加700 u I Buffer W2, 12000r/min离心30s，弃滤液。以同样的方法再用700 ii I Buffer W2洗漆一次，12000r/min离心lmin。⑴将制备管置回2ml离心管中，12000r/min离心lmin。⑶将制备管置于I. 5ml离心管中，在制备膜中央加30iil去离子水，室温静置lmin。12000r/min 离心 2min 洗脱 DNA, DNA 置 _20°C保存。5. IysM基因与表达载体pNZ8110的连接将凝胶回收得到的IysM基因与表达载体pNZ8110的双酶切产物进行连接。连接反应体系10XBuffer 2 u I, T4 DNA 连接酶 I yl，IysM 基因 8 yl，pNZ8110 载体 2 yl，去离子水7 ill。于16°C进行连接反应16h。6. E. coli MC1061感受态细胞的制备6. I从培养E. coli MC1061菌株16h的LB培养板上取单菌落，接种于5ml LB培养液中，220r/min摇振，37°C培养16h。6. 2取Iml菌液加入100ml LB培养液中，37°C，220r/min摇振培养至对数生长期(约 I. 5h 2h)。6. 3无菌条件下，将菌液转移至两个用冰预冷的无菌50ml离心管中，冰水中放置IOmin06. 4 于 4°C，4000r/min 离心 lOmin，倒出上清，用 IOml 冰预冷的 0. lmol/L CaCl2 重悬菌体沉淀，置冰水中放置30min。 6. 54°C, 4000r/min离心IOmin,倒出上清,将管倒置lmin,使液体流尽。6. 6每管加2ml 0. lmol/L用冰预冷的CaCl2，重悬沉淀，分装感受态细胞，每I. 5mlEp管中200iil，4°C贮存12h 24h使用。7. E. coli MC1061感受态细胞的转化7. I取IysM基因与载体pNZ8110的连接产物10 iil，加入装有200 ill E.coliMC1061感受态细胞的I. 5ml Ep管中，混匀后于冰水中放置30min。7. 2将此1.5ml Ep管静置于42°C水浴中，90s。将Ep管快速转移到冰浴中，冷却3min。7. 3每管加800 u I LB液体培养基，37°C水浴IOmin后，将管放入摇床，120r/min振荡培养45min使细菌复苏。7. 44000r/min离心5min，吸出800 U I液体培养基，剩余液体混匀后涂含氯霉素(10 u g/ml)的LB固体培养板。室温放约30min，待菌液被吸收后，倒置培养基平板，于培养箱中，37°C培养16h。8.阳性转化菌的鉴定(I)菌液特异PCR鉴定从LB培养基上挑取单菌落过夜摇菌，以菌液为PCR模板，采用引物Pl和P2，PCR扩增IysM基因，PCR体系:20iiM的上游引物liil，20iiM的下游引物liil，2XTaqPCRMasterMix 25 iil，菌液2 iil，加去离子水至50 ill。PCR反应条件95°C预变性4min，95°C变性30s，56°C退火30s，72°C延伸45s，共40个循环，最后72°C延伸5min。用20g/L琼脂糖凝胶电泳分析PCR产物。(2)重组质粒的酶切鉴定应用常规大肠杆菌质粒提取法(碱裂解法)从E. coli转化菌中提取质粒[J.萨姆布鲁克和D. W拉塞尔著，分子克隆实验指南，第三版，科学出版社，2002]，分别采用XbaI单酶切和SphI、XbaI双酶切鉴定提取的质粒，37°C酶切12h，65°C灭活20min，用20g/L琼脂糖凝胶电泳。(3)重组质粒的测序鉴定重组质粒由上海捷瑞生物工程有限公司测序，将测序结果和GenBank上公布的IysM 基因序列(Genbank:AM406671. I)进行 BLAST 比对。结果如下
I. L. lactis IysM基因序列的PCR扩增结果L. lactis IysM基因序列的PCR扩增产物电泳结果如图2，扩增片段长度与预期长度一致，结果表明IysM基因的PCR扩增成功。2. E. coli阳性转化菌的菌液PCR鉴定E. coli阳性转化菌的菌液为模板，PCR扩增IysM基因得到的片段长度与预期长度一致。3. E. coli阳性转化菌的酶切鉴定取经过PCR鉴定为阳性转化菌的菌液，用碱裂解法提取质粒，进行酶切鉴定，结果显示质粒单酶切产物片段长度和双酶切产物片段长度均与预期片段长度一致(图3)。 4. E.coli阳性转化菌的测序鉴定对从E. coli阳性转化菌中提取的重组质粒中IysM基因测序的结果为SEQ ID NO. 2所示的核苷酸序列，将该序列与Genbank上公布的IysM基因序列(Genbank:AM406671. I)进行BLAST比对，结果显示，二者相同。证实此重组质粒即为构建成功的L. Iactis表达载体，将其命名为pNZ81 IO-IysM,将含有pNZ81 IO-IysM的E. coliMC1061 重组菌命名为 E. coli MC1061/pNZ8110-lysM(保藏编号为 CGMCC NO. 6116)。采用含150ml/L甘油和10 u g/ml氯霉素的LB培养基于_80°C保存该菌株。实施例2重组菌株L. lactis NZ3900/pNZ8110的构建重组菌株L. lactis NZ3900/pNZ8110既可以按照菌株L. lactis NZ3900销售方荷兰NIZO Food Research或德国Mobitec公司提供的技术方法制备,也可以采用如下方法制备I.制备 L. lactis NZ3900 感受态细胞I. I从-80°C贮存的L. lactis NZ3900菌种保存管中取200 U I菌液接种于5ml液体GSGM17培养基中，放入CO2培养箱，30°C、5%C02静置培养过夜(本说明书中，过夜指时长为 12h 14h)。I. 2取5ml菌液加入50ml GSGM17培养基中，30°C、5%C02静置培养12h。I. 3取50ml菌液转种于400ml GSGM17培养基中，30°C、5%C02静置培养至OD6tltl约为0. 3。1.4将菌液 40001'/1^11、41离心20111111，收集菌液；I. 5用冰冷的400ml的洗液I (0. 5mol/L蔗糖，100ml/L甘油)洗涤一次，4000r/min、4°C离心20min,收集菌液；I. 6 用冰冷的 200ml 洗液 II (0. 5mol/L 蔗糖，100ml/L 甘油，50mM EDTA)重悬菌体，冰上静置15min ;4000r/min、4°C离心20min,收集菌体；I. 7再用冰冷的洗液1(0. 5M蔗糖，100ml/L甘油)100ml重悬菌体，4000r/min、4°C离心20min，收集菌体；I. 8用4ml冰冷的洗液I (0. 5M蔗糖，100ml/L甘油)悬浮菌体，分装入事先冰浴的0.5ml EP管中，每管40 iil，储存于-80°C。2.电转化L. lactis NZ3900菌株感受态细胞取IiU 购置的表达载体 pNZ8110(10 20ng)与 40 y 1L. lactis NZ3900 感受态细胞混合，转入冰浴的0. 2cm电转化杯中，设置电击参数为2. 0KV、25ii F、200Q，用纸巾擦干电转化杯金属电极片上水分，然后将转化杯置于电击槽中电击。电击后立即加入SOOiilGM17MC恢复培养基，冰浴5min后转入I. 5ml EP管中，恢复培养2h，将菌液涂布于含氯霉素(10 u g/ml)的GM17培养板上，待菌液吸收完全后，于30°C、5%C02静止培养40h，筛选阳性转化菌。3. L. Iactis阳性转化菌的鉴定3. 1L. Iactis阳性转化菌中质粒的提取采用质粒小提试剂盒(北京康为世纪生物科技有限公司)，参照产品说明，步骤如下
(I)从上一步筛选阳性转化菌的GM17培养板上挑取单菌落接种于5ml GM17培养基，放入CO2培养箱，30°C、5%C02静止12h。(2)取3ml菌液,加入离心管中，13000r/min离心lmin,弃上清。(3)向菌体沉淀中加入250 u I Buffer Pl和100 u I 100g/L的溶菌酶，用涡旋振
荡器悬浮细菌沉淀。(4)向离心管中加入250 U I Buffer P2，温和地上下颠倒混匀4 6次，使菌体充分裂解。此时菌液应变得粘稠。所用时间不应超过5min，以免质粒受损伤。(5)向离心管中加入350iil Buffer N3，上下颠倒混匀4_6次，此时出现白色絮状沉淀。(6) 13000r/min 离心 IOmin,吸取上清，加入到已装入 Collection Tube 的 SpinColumn CM中，注意不要吸出沉淀。(7) 13000r/min 离心 30_60s,倒掉 Collection Tube 中的废液,将 Spin Column CM放回 Collection Tube 中。(8)向 Spin Column CM 加入 500iil Buffer PB, 13000r/min 离心 30_60s,倒掉Collection Tube 中的废液,将 SpinColumn CM 重新放回 Collection Tube 中。(9)向 Spin Column CM 中加入 700iil Buffer PW, 13000r/min 离心 30_60s,倒掉Collection Tube 中的废液,将 Spin Column CM 重新放回收 Collection Tube 中。(10)向 Spin Column CM 中加入 500iil Buffer PW, 13000r/min 离心 lmin,倒掉Collection Tube 中的废液,将 Spin Column CM 重新放回收 Collection Tube 中。(11) 13000r/min离心lmin,倒掉废液。将Spin Column CM置于室温数分钟，以彻底晾干吸附膜上残余的Buffer PW。(12)将Spin Column CM置于一个新的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加50 u I Buffer EB,室温放置I 2min, 13000r/min离心lmin,将质粒溶液收集到离心管中。3. 2分别用NaeI和Sph I单酶切提取的质粒。NaeI酶切体系为NaeI lul,IOXBuffer 2 yl、质粒10 yl、去离子水9 yl。37 °C酶切4h。Sph I酶切体系为SphI I Iu IUOXBuffer 2 yl、质粒10 yl、去离子水9 yl。37°C酶切4h。酶切产物用10g/L的琼脂糖凝胶进行电泳分析。结果显示从筛选的阳性转化菌中提取的质粒经酶切得到片段长度与预期片段长度3459bp符合，证明该阳性转化菌为构建正确的重组L. Iactis菌株，将其命名为L. lactis NZ3900/pNZ8110。采用含 150ml/L甘油和 10 y g/ml 氯霉素的 GM17 培养基于-80°C保存该菌株。
实施例3构建表面展示表达EGFP的L. Iactis表达载体表面展示表达EGFP的L. Iactis表达载体的构建参见图4I EGFP基因的PCR扩增根据Genbank核酸数据库中EGFP基因序列(GenBank: JN255744. I)，应用生物软件Primer5. 0 设计 PCR 引物，上游引物 P3 序列为 5-ATAGCCGGCATG GTGAGCAAGGGCGAGG-3’ (SEQID NO. 6)，在其5’端引入Nae I限制件酶切位点下游引物P4序列为5-ACATGCATGCCTTGTACAGCTCGTCCATGCCG-3’ (SEQ ID NO. 7)，在下游引物5’端引入Sph I限制性酶切位点。PCR反应体系以质粒pIRES2_EGFP(美国BD Biosciences Corporation)为模板，配制反应体系20iiM的上游引物liil，20iiM的下游引物liil，2XTaq PCR Master Mix25 u 1，pIRES2-EGFP 质粒 Iu I，加去离子水至 50u I0PCR循环条件97°C预变性 5min，94°C变性 45s，62°C退火 45s，72°C延伸 60s，共 30 个循环，最后72°C延伸IOmin。PCR产物分析取3 ill PCR反应产物，于I. 0%琼脂糖凝胶中电泳，电压为5V/cm，用DNA Marker做分子量标记，电泳20min,用凝胶图像分析仪进行分析。2. EGFP基因及表达载体pNZ81 IO-IysM的双酶切用Nael+SphI分别双酶切EGFP基因和表达载体pNZ8110_lysM。酶切体系质粒pNZ81 IO-IysM 或 EGFP 基因 25 ii I，10XBuffer 5 u I, Sph I I u I, Nae I liU，去离子水18 u I037°C酶切12h，65°C水浴20min灭活内切酶。采用10g/L琼脂糖凝胶对EGFP基因和pNZ81 IO-IysM双酶切产物进行电泳分析。3.参照凝胶回收试剂盒(杭州爱思进生物技术有限公司)说明回收EGFP基因和质粒pNZ81 IO-IysM的双酶切产物。4.￡6 基因与口似8110-178] 的连接将凝胶回收的EGFP基因与载体pNZ8110-lysM的酶切产物用T4 DNA连接酶进行连接。连接反应体系10 X Buffer 2 yl，T4DNA 连接酶 I yl，EGFP 基因 8 iil，pNZ8110-lysM载体2iil，去离子水7iil。于16°C进行连接反应16h。5. E. coli MC1061菌株感受态细胞的转化采用的技术方法与实施例I相同。6. E. coli阳性转化菌的PCR鉴定从LB培养基上挑取单菌落接种到LB液体培养基中，培养约14h，取菌液为PCR模板。PCR反应体系20iiM EGFP上游引物I iil，20 ii M EGFP下游引物I yl，2XTaq PCRMaster Mix 25 yl，菌液2 yl，加去离子水至50 iU。产物用1.0%琼脂糖电泳。PCR反应条件97°C预变性5min，94°C变性45s，62。。退火45s，72。。延伸60s，共30个循环，最后72°C延伸lOmin。用10g/L的琼脂糖凝胶电泳分析PCR产物。7. L. lactis NZ3900菌株的转化与阳性转化菌的鉴定取经PCR鉴定为构建正确的E. coli阳性转化菌的菌液，采用常规大肠杆菌质粒提取法(碱裂解法)提取质粒[J.萨姆布鲁克和D. W拉塞尔著，分子克隆实验指南，第三版，科学出版社，2002]，将Iiil提取的质粒与40 ill L. lactis NZ3900感受态细胞混合，进行电转化，电击参数为2. 0KV,25 u F、200 Q，电击后立即加入800 U I恢复培养基，恢复培养2h，取适量菌液涂于含氯霉素(10 U g/ml)的GM17培养板上，待菌液吸收完全后，于30°C、5%C02培养箱静置培养40h，筛选鉴定阳性转化菌。挑取单菌落接种于含氯霉素(IOi1 g/ml)的GM17液体培养基中培养12h。取菌液按照实施例2所述的L. Iactis阳性转化菌中质粒提取方法提取质粒，取10 ii I质粒用Sph I进行单酶切，另取10 ii I质粒,用Nae I和Sph I进行双酶切，37°C酶切12h，65°C灭活20min，用10g/L的琼脂糖凝胶进行电泳分析。取酶切鉴定结果为构建正确的质粒，送交北京华大基因公司，对质粒中EGFP基因进行测序。结果如下以pIRES2-EGFP质粒为模板，PCR扩增EGFP基因，取扩增产物3iil于10g/L的琼脂糖凝胶中电泳。结果显示，扩增的片段长度与预期的长度723bp符合(图5)。E. coli阳性转化菌的菌液PCR鉴定结果显示，扩增片段长度与预期长度723bp符 合(图6)。从培养的L. Iactis转化菌中提取重组质粒，并进行酶切鉴定，结果显示，重组质粒经酶切产生的片段大小均与预期大小一致(图7);对该重组质粒中EGFP基因进行测序的结果显示，该重组质粒中含有SEQ ID NO. 8所示的核苷酸序列，该核苷酸序列与报道的EGFP基因序列(GenBank:JN255744. I) 一致，证明此重组质粒即为构建成功的可表面展示表达EGFP的L. Iactis表达载体，将此表达载体命名为pNZ8110-EGFP_lysM，将含有pNZ81 IO-EGFP-IysM 的乳酸乳球菌命名为 L. lactis NZ3900/pNZ81IO-EGFP-IysM0 采用含150ml/L甘油和10 u g/ml氯霉素的GM17培养基于_80°C保存该菌株。实施例4L. lactis NZ3900/pNZ81IO-EGFP-IysM 的诱导表达I. L. lactis NZ3900/pNZ81 lO-EGFP-lysM 的活化取-80°C 冻存的菌株 L. lactis NZ3900/pNZ8110-EGFP-lysM,划线接种于含10 U g/ml氯霉素的GM17培养基平板上，在30°C、5%C02培养箱中培养约40h。挑取单菌落接种于4ml含IOii g/ml氯霉素GM17液体培养基中，30°C、5%C02培养箱中静置培养12h，即成为活化种子菌液。2. L. lactis NZ3900/pNZ81IO-EGFP-IysM 菌株的诱导表达取活化种子菌液400 ill转种于IOml含IOii g/ml氯霉素的GM17液体培养基，30°C、5%C02培养箱中静置培养至OD6tltl为0. 3 0. 4时，加入诱导剂Nisin至终浓度为40ng/ml，诱导 5h。同时以菌株 L. lactis NZ3900 和 L. lactis NZ3900/pNZ8110 为阴性对照。3. L. lactis NZ3900/pNZ8110-EGFP_lysM 菌株表达 EGFP 的鉴定取100 U I 菌体,4°C, 3000r/min,离心 IOmin,菌体沉淀用 PBS( IOmM Na2HPO4, 2. 7mMKCl,137mM NaCl，2mM KH2PO4, pH 7. 4)洗涤 3 次，菌体重悬于 100 yl PBS 中，涂 Iyl 于载玻片上，突光显微镜下观察。结果如下在荧光显微镜下观察L. lactis NZ3900/pNZ8110-EGFP_lysM有明显的绿色荧光出现，而阴性对照菌株无明显荧光出现(图8)，证实以L. lactis NZ3900为宿主菌、pNZ81 IO-IysM为表达载体的表达系统可以表面展示表达外源蛋白。序列表SEQUENCE LISTING<110> 郑州大学
权利要求
1.一种可在乳酸乳球菌表面展不表达异源基因的载体，其特征在于包含有SEQ IDNO. I所示的核苷酸序列。
2.—种DNA序列，其特征在于包含有SEQ ID NO. I所示的核苷酸序列。
3.一种大肠埃希氏菌(Escherichia coli)MC1061/pNZ8110_lysM,其特征在于保藏编号为 CGMCC NO. 6116。
4.一种如权利要求I所述可在乳酸乳球菌表面展示表达异源基因的载体的构建方法，其特征在于包括以下步骤 1)以乳酸乳球菌NZ3900菌株基因组DNA为PCR模板，应用PCR技术扩增乳酸乳球菌自溶素(AcmA)锚定区基因lysM，IysM具有序列表中SEQ ID NO. 2所述的核苷酸序列； 2)分别将IysM基因与表达载体pNZ8110(SEQID NO. 3)进行酶切，酶切产物经回收纯化后用于定向连接； 3)用IysM与载体pNZ8110的连接产物转化大肠杆菌Escherichiacoii MC1061菌株； 4)通过氯霉素抗性筛选和PCR、酶切、测序鉴定，得到阳性转化菌株； 5)培养得到的阳性转化菌株，提取质粒，得到可在乳酸乳球菌表面展示表达异源基因的载体，将其命名为pNZ8110-lysM。
5.一种如权利要求I所述乳酸乳球菌表达载体在表达外源蛋白中的应用。
6.根据权利要求5所述乳酸乳球菌表达载体在表达外源蛋白中的应用，其特征在于所述外源蛋白的编码基因是幽门螺杆菌(Helicobacter pylori)基因，包括采用PCR方法以幽门螺杆菌DNA为模板扩增得到的基因或基因片段。
7.一种利用如权利要求I所述的乳酸乳球菌表达载体的乳酸乳球菌表达系统，其特征在于以所述乳酸乳球菌表达载体为外源蛋白表达载体，以L. lactis NZ3900菌株为表达宿主菌。
8.—种如权利要求7所述的乳酸乳球菌表达系统在表达外源蛋白方面的应用。
9.一种如权利要求3所述的大肠杆菌重组菌(Escherichia coli)MC1061/pNZ8110-lysM在用于从培养的细菌中提取乳酸乳球菌表达载体pNZ8110-lysM方面的应用。
全文摘要
本发明涉及一种可在乳酸乳球菌表面展示表达异源基因的载体及其制备方法与应用。该载体具有序列表中SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列，含启动子Pnis、lysM基因、分泌信号肽序列ssusp45、多克隆酶切位点、复制子repA和repC元件。该载体的构建方法应用PCR技术扩增乳酸乳球菌NZ3900菌株自溶素(AcmA)锚定区基因lysM，将lysM与载体pNZ8110经酶切后进行连接，连接产物用于转化E.coli MC1061菌株，阳性转化菌经酶切和测序鉴定后，提取重组质粒，得到本发明提供的表达载体。该载体功能将外源基因与该载体连接，转入乳酸乳球菌NZ3900中，经乳酸链球菌素(nisin)诱导可实现外源基因的表达和表达蛋白与宿主细胞壁的结合。该载体可用于包括疫苗抗原在内的外源蛋白的表达，具有广泛的应用范围。
文档编号C12N15/66GK102796756SQ20121021828
公开日2012年11月28日 申请日期2012年6月28日 优先权日2012年6月28日
发明者段广才, 张荣光, 程文滨, 范清堂, 张卫东, 郗园林, 陈帅印 申请人:郑州大学