专利名称：一种天然黄色素生产方法及其生产菌株的制作方法
技术领域：
本发明涉及天然黄色素的生产技术方法及其生产菌株，尤其是低能耗清洁生产天然黄色素的技术方法，属于生物化工及着色剂生物技术领域。
背景技术：
色素，也称着色剂，广泛应用于日化、医药、印染、食品等行业领域，能够在很大程度上改善产品性状及影响产品品质。人工合成色素和天然色素是两类应用广泛的主要色素。尽管人工合成色素色泽鲜艳，价格低廉，着色性及稳定性良好，但鉴于其对人体健康普遍存在一定程度的毒性，甚至具有致畸、致突变、致癌作用。许多国家已对人工合成色素的使用种类、应用范围、添加剂量等作出明确规定，有些国家甚至完全禁止使用合成色素。天然色素与合成色素相比，具有天然、健康以及安全性相对较高的最大优点，并且能赋予食品许多新功能，符合人们对“安全、天然、营养、多功能”色素产品的需求。世界天然色素市场 正以每年10%的速度快速增长，市场前景非常乐观。
现今生产天然黄色素的方法主要有抽提法和微生物发酵法，通过抽提法生产的黄色素主要有姜黄色素、叶黄素、桅子黄色素、红花黄色素、玉米黄色素等。这种生产方法主要是从植物里抽提，受季节影响很大，且抽提过程中引入了有机试剂，成本较高(杨萌，吴振强.食用天然黄色素的研究近况.中国调味品，2008，(2):67-71.)。微生物发酵方法生产天然黄色素不受季节影响，成本较低，转化率高，且已知的微生物代谢产生的色素基本安全无毒，发展前景十分广阔。但由于菌种资源缺乏，到目前为止，通过微生物发酵生产黄色素的相关研究报道很少，主要集中在红曲霉菌株的利用上。红曲霉菌本身安全性较高，而且红曲霉菌不仅产红色素，也产黄色素，红曲黄色素的蛋白着色能力很强，热稳定性好。有报道称绿色木霉也能发酵产黄色素(张晓毅，崔英德，陆宁等.绿色木霉菌产黄色素液态发酵条件的优化·化工学报，2010，61 (12) :3205-3212.) ο
目前能代谢合成黄色素的微生物资源比较少，大都处于实验室研究阶段，只有日本实现了一种微生物黄色素(红曲黄色素)的商品化生产。泰国在红曲黄色素方面的研究较多，已经进入中试研究阶段，但据证实还没实现工业化生产(周波，吴吉林，朱明军等.微生物黄色素的研究进展.微生物学通报，2010，37(9) :1362-1368.)。
黄色素是一类主要的食用着色剂，天然黄色素国内市场需求量占色素总需求量的60%以上，加上旺盛的国际市场需求，天然黄色素呈现出供不应求的局面，因此研究开发食用天然黄色素将具有广阔的市场前景及巨大的经济潜力。
发明内容
本发明的目的是提供一种能够产生大量胞外黄色素的细菌菌株，通过发酵提取制备大量天然黄色素粗制品及精制品。
本发明提供了一种黄色素产生菌-突光假单胞菌iPsoudomorms fluorescens
BMG-1)菌株，同时提供利用该菌株生产天然黄色素的发酵及制备工艺方法。本发明所提供的产黄色素突光假单胞菌iPsGudomorms fluorescens BMG-1)已于2012年5月3日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏号为CGMCC No. 6060。
该菌株呈短杆状，无芽胞、荚膜，革兰氏阴性，好氧，4°C下生长，41°C下不生长。该菌株氧化酶、接触酶反应呈阳性；D，L-丙氨酸、L-天冬氨酸(酰胺)、L-谷氨酸、L-丝氨酸、L-脯氨酸、L-亮氨酸、L-组氨酸、羟脯氨酸代谢阳性，而L-鸟氨酸、L-苯丙氨酸、D-丝氨酸及尿苷、胸苷代谢阴性。不能利用糊精、糖原、N-乙酰葡萄糖胺、N-乙酰半乳糖胺、核糖醇、D-纤维二糖、L-果糖、龙胆二糖、a -D-乳糖、麦芽糖、D-棉子糖、L-鼠李糖、D-海藻糖及木糖醇；能够利用葡萄糖(产酸)、L-阿拉伯糖、D-阿糖醇、D-山梨醇、甘油、D-果糖、D-半乳糖、D-甘露糖、D-甘露醇、蔗糖、D-葡糖酸、丙酸、丙二酸、D, L-乳酸、D-己糖酸、丁二酸及朽1檬酸。结合16S rDNA序列比对分析确定该菌株为突光假单胞菌iPseudomonasfluorescens)(中国科学院微生物研究所检测鉴定报告(2010)微检字第223号)。在固体PDA培养基(马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂粉20g，蒸馏水IOOOmL)上菌落圆形，表面湿润光滑，边缘整齐，最初白色，随后中心变蓝，蓝色随菌落生长而向外扩展，菌落生长处的培养基变为黄绿色。菌株适宜产色素温度为20°C -28°C。·
突光假单胞菌iPseudomonas fl uorescens BMG-1)可以米用冻干管或土壤法保藏。冻干管法保藏的菌种可在-20°C保存I年以上。土壤保藏法是刮取在固体PDA培养基上于220C -28°C恒温培养36-48小时的菌落，接种于湿润无菌土壤中，于同样温度下培养36-48小时，然后将接菌土壤转入4°C恒温保藏，该法可以保藏菌种I年左右。
长期保藏的菌种在发酵培养之前需要进行活化培养。以无菌水制备荧光假单胞菌{Pseudomonas fl uorescens BMG-1)保藏土的土悬液，以土悬液作IO2-IO4倍稀释后涂布MKB平板进行复壮培养。MKB培养基含有下述物质5. O克酪蛋白氨基酸，15mL甘油，2. 5克K2HPO4, 2. 5 克 MgSO4 · 7H20，加蒸馏水至 1000 毫升，115°C灭菌 20 分钟，pH 为 7. 2。
本发明继提供产黄色素菌株之外，也提供了由本发明菌株生产黄色素的方法。
由本发明所提供菌株生产黄色素的步骤如下
1)发酵培养挑取复壮培养的突光假单胞菌(Pseudomonasfluorescens BMG-1)CGMCC No. 6060培养物转接于PDA培养基。待PDA培养基平板上的菌苔变为深蓝色后，以每个直径0 9cm平板用IOmL PD液的比例配制发酵用种子液，以2%_8%的接种量将种子液接种于发酵H)培养液中，在20°C _28°C静置发酵培养48小时。本发明采用浅盘静置培养发酵方式，浅盘中培养液层厚度为l_2cm。
2)色素制备离心除去发酵培养液中的菌体,收集上清液并低温真空浓缩至原体积的1/5-1/10。以5-10倍乙醇浸提浓缩液，合并乙醇浸提液并真空浓缩干燥可制得黄色素粗制品。合并乙醇浸提液过硅胶柱层析可制得黄色素精制品。
所选PDA培养基含有下述物质20克葡萄糖，200克新鲜马铃薯的沸水浸出物，18克琼脂粉，加蒸馏水至1000毫升，121。。灭菌20分钟，pH为7. O。
所选发酵生产黄色素的H)培养液含有下述物质20克葡萄糖，200克新鲜马铃薯的沸水浸出物，加蒸馏水至1000毫升，121°C灭菌20分钟，pH为7. O。
本发明制备的黄色素，易溶于水，在250nm处有一个最大吸收峰，在pH2. 2-10. O范围内较为稳定，具有非常良好的热稳定性和自然光稳定性，具有一定程度的抗氧化能力。本发明的生产菌株生长速度快，在20°C _28°C温度范围内都可发酵产色素，发酵产色素过程为浅盘静置、自然通气培养方式，培养条件及设备要求粗放，能耗低，色素产量大(黄色素粗品产量可以达到I. 6-1. 9克/升发酵液，黄色素精制品产量可以达到I. 0-1. 5克/升发酵液)，制备工艺简单，便于产业化规模生产。发酵制得的黄色素为纯天然色素产品，对动物体无任何毒副作用，可以广泛应用于日化、医药、印染、食品等行业领域。
图I所示为本发明的黄色素产生菌-突光假单胞菌fluorescens
BMG-1) CGMCC No. 6060。
图2所示为荧光假单胞BGM-I菌株所产黄色素的吸收光谱曲线图。
图3所示为不同温度对荧光假单胞BGM-I菌株所产黄色素稳定性的影响曲线图。
图4所示为pH2. 2-8. O值对荧光假单胞BGM-I菌株所产黄色素稳定性的影响曲线图。
图5所示为pH9. 0-10. 6值对荧光假单胞BGM-I菌株所产黄色素稳定性的影响曲线图。
图6所示为pHll. 0-12. O值对荧光假单胞BGM-I菌株所产黄色素稳定性的影响曲线图。
图7所示为不同光照条件对荧光假单胞BGM-I菌株所产黄色素稳定性的影响曲线图。
具体实施例方式实施例I、荧光假单胞菌BMG-1 (CGMCC No. 6060)的培养
将活化复壮的突光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens BMG-1) CGMCC No. 6060 在PDA培养基上培养，检测菌落颜色及培养基颜色的变化；刮取变为深蓝色的菌苔接种于ro培养液中，分散均匀，制备成种子液。将种子液接种于发酵ro培养液中浅盘静置、自然通气方式培养，培养液层厚度为l-2cm，26°C恒温培养，至整个培养液颜色变为深黄绿色时结束培养过程。
实施例2、菌种发酵培养及黄色素提取制备
1、菌种发酵培养
将由复壮的BMG-I菌种制备的ro种子液以2%的接种量接入ro发酵培养液，浅盘静置、自然通气培养方式，培养液层厚度lcm，22°c恒温培养，至72小时整个培养液颜色变为深黄绿色时结束培养过程。
2、黄色素的提取制备
收集发酵培养液在8000r/min下离心15min,合并上清液在40°C下真空浓缩至原体积的1/10。以7倍体积无水乙醇浸提浓缩液，合并无水乙醇浸提液并在40°C下真空浓缩、干燥可制得黄色素粗制品，得率为I. 68g/L发酵液。将此黄色素粗制品过60-100目硅胶柱层析，以蒸馏水为洗脱剂，收集黄色洗脱组分，浓缩干燥后可制得黄色素精制品，得率为I. 27g/L发酵液。
实施例3、菌种发酵培养及黄色素提取制备
I、菌种发酵培养
将由复壮的BMG-I菌种制备的ro种子液以5%的接种量接入ro发酵培养液，浅盘静置、自然通气培养方式，培养液层厚度I. 5cm，24°C恒温培养，至60小时整个培养液颜色变为深黄绿色时结束培养过程。2、黄色素的提取制备
收集发酵培养液在8000r/min下离心15min,合并上清液在40°C下真空浓缩至原体积的1/8。以8倍体积无水乙醇浸提浓缩液，合并无水乙醇浸提液并在40°C下真空浓缩、干燥可制得黄色素粗制品，得率为I. 91g/L发酵液。将此黄色素粗制品过60-100目硅胶柱层析，以蒸馏水为洗脱剂，收集黄色洗脱组分，浓缩干燥后可制得黄色素精制品，得率为1.43g/L发酵液。
实施例4、菌种发酵培养及黄色素提取制备
1、菌种发酵培养
将由复壮的BMG-I菌种制备的ro种子液以7%的接种量接入ro发酵培养液，浅盘静置、自然通气培养方式，培养液层厚度2. 0cm, 26°C恒温培养，至48小时整个培养液颜色变为深黄绿色时结束培养过程。· 2、黄色素的提取制备
收集发酵培养液在8000r/min下离心15min,合并上清液在40°C下真空浓缩至原体积的1/7。以10倍体积无水乙醇浸提浓缩液，合并无水乙醇浸提液并在40°C下真空浓缩、干燥可制得黄色素粗制品，得率为I. 73g/L发酵液。将此黄色素粗制品过60-100目硅胶柱层析，以蒸馏水为洗脱剂，收集黄色洗脱组分，浓缩干燥后可制得黄色素精制品，得率为I. 35g/L发酵液。
权利要求
1.一株产黄色素突光假单胞菌 iPseudomonas fluorescens BMG-1) CGMCC No. 6060。
2.根据权利要求I所述的突光假单胞菌(Pseudomonasfluorescens BMG-1) CGMCCNo. 6060发酵生产提取黄色素的方法，包括如下步骤 1).将保藏的突光假单胞菌fluorescensBMG-1) CGMCC No. 6060 使用MKB培养基活化、扩大培养； 2).将步骤I)的菌株培养物以2%-8%的接种量接种于H)培养液中，200C-280C浅盘静置、自然通气方式培养36-60小时； 3).将步骤2)的培养液除去菌体，收集上清液，以乙醇提取其中的黄色素，经浓缩干燥后获得黄色素粗制品及精制品。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于活化复壮荧光假单胞菌的MKB培养基含有下述物质5. O克酪蛋白氨基酸，15mL甘油，2. 5克K2HPO4, 2. 5克MgSO4 · 7H20，加蒸馏水至1000毫升，115°C灭菌20分钟，pH为7. 2。
4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于所选发酵生产黄色素的H)培养液含有下述物质20克葡萄糖，200克新鲜马铃薯的沸水浸出物，加蒸馏水至1000毫升，121°C灭菌20分钟，pH为7. O。
5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于所述黄色素生产采用浅盘静置、自然通气方式。
6.根据权利要求2所述的方法，其特征在于所述含黄色素上清液是通过离心除去培养液中的菌体后得到的，离心转速为3000-8000r/min。
7.根据权利要求2或6所述的方法，其特征在于低温(35°C-45°C )真空浓缩离心除菌后的含黄色素上清液至原体积的1/5-1/10 ;以乙醇浸提浓缩液，收集合并黄色乙醇提取液，低温(35°C -40°C )真空浓缩干燥可制得黄色素粗制品；将含黄色素乙醇提取液在浓缩后过硅胶柱层析、减压浓缩干燥可制得黄色素精制品。
8.根据权利要求2或7所述的方法，其特征在于所述黄色素提取溶剂为无水乙醇，用量为浓缩液的5-10倍。
9.根据权利要求2或7或8所述的方法，其特征在于所述柱层析采用60-100目或100-200目试剂级硅胶，以蒸馏水为洗脱剂；收集洗脱液真空干燥后获得黄色素精制品；所述黄色素精制品在250nm处有I个最大吸收峰。
全文摘要
本发明公开了一种天然黄色素生产方法及其发酵生产菌株。本发明使用荧光假单胞菌BGM-1菌株(PseudomonasfluorescensBGM-1) CGMCC No.6060生产胞外水溶性黄色素，生产方法为将产黄色素荧光假单胞菌BGM-1菌株以2%-8%接种量接种于浅盘PD培养液中，20-28℃条件下恒温静置培养24-48小时得到发酵液。离心除去菌体，浓缩发酵上清液。以乙醇浸洗经浓缩的发酵上清液，35-40℃真空浓缩干燥可制得黄色素粗制品。将黄色素粗品过硅胶柱层析得到精制品。所得黄色素具有很好的光热稳定性和酸碱稳定性，对动物无任何毒副作用，为纯天然黄色素产品，可广泛应用于日化、医药、食品等工业各领域。本发明为天然黄色素的产业化生产提供了新的方法及途径。
文档编号C12P1/04GK102899265SQ20121021800
公开日2013年1月30日 申请日期2012年6月28日 优先权日2012年6月28日
发明者毛得奖, 朱亚玲, 韩宁 申请人:山东轻工业学院