高产色素的红曲菌株及其应用的制作方法

本发明属于微生物技术领域，涉及一种红曲菌株及其应用，尤其涉及一种高产色素的红曲菌株及其在生产红曲米/粉上的应用。

背景技术

色素是食品行业不可缺少的一种添加剂，其中食品色素按照来源又可分为天然色素和人工合成色素两种。然而，人工合成色素潜在三大危险，其安全性受到严重质疑，较多的人工合成色素被限定，无毒害的天然色素日益受到食品行业的重视。

红曲色素，是由红曲菌产生的一种天然色素，主要有红色的红斑红曲胺和红曲玉红胺、橙色的红斑红曲素和红曲玉红素、黄色的红曲黄色和红曲素，均为聚酮类化合物。红曲色素对温度、酸碱度等具有较强稳定性，并且其着色能力强，一直被广泛用于腐乳、黄酒等食品的生产，近年来在水产品及肉类产品上的使用也日益增加。

目前，红曲色素主要通过传统的固态发酵或深层发酵技术生产。红曲霉色素的固态发酵是以蒸熟的大米为原料基质，接种红曲霉菌种，经发酵后干制得到红曲米/粉。然而，当下所采用的固态发酵并最终得到的红曲米产色价并不是很高，在红曲色素的生产上，难以满足日益增长的实际需求。

技术实现要素：

为了解决背景技术中存在的上述技术问题，本发明提供了一种红曲米色价高、制备工艺简单以及具有显著的经济效益的高产色素的红曲菌株及其应用。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种高产色素的红曲菌株，其特征在于：所述高产色素的红曲菌株的分类命名为紫色红曲霉菌(monascus.purpureus)，所述高产色素的红曲菌株的菌株号是csu-m183；所述高产色素的红曲菌株保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为cctccno：m2018224。

作为优选，本发明所提供的高产色素的红曲菌株在pda培养基上于30℃培养7天，菌落直径28mm，平坦，表面呈现大量绒毛状气生菌丝，整个菌落正面呈橙红色，背面呈深红色至红褐色；显微镜观察菌丝光滑，多分枝，有隔膜，分生孢子排列呈链状，着生于菌丝顶端，单个孢子呈球形，闭囊壳近球形。

作为优选，本发明所提供的高产色素的红曲菌株固体发酵制得的红曲米色价达8460u/g。

根据如上记载的高产色素的红曲菌株在制备红曲色素时的应用。

本发明的优点是：

本发明提供了一种高产色素的红曲菌株及其应用，该高产色素的红曲菌株(monascus.purpureus)csu-m183，已保藏于中国典型培养物保藏中心，其保藏编号为cctccno：m2018224，保藏日期为2018年4月19日。本发明提供的高产色素的红曲菌株是将紫色红曲出发菌株luc(保存于稻谷及副产物深加工国家工程实验室)的孢子经等离子体诱变后，利用pda平板筛选得到产色素能力强的菌株，再经固态发酵筛选获得色素产量高的紫色红曲霉菌目标菌株。本发明的红曲米/粉仅以蒸熟的籼米为发酵原料，在不添加其他任何成分条件下，培养10天，制得红曲米色价高达8460u/g，相比市售红曲米和文献报道的红曲米色价高2.3倍。本发明制备工艺简单，成本低，具有显著的经济效益，是一株适合于工业化生产红曲色素研究及应用的优良菌株。

附图说明

图1是红曲菌孢子致死率曲线；

图2是本发明生产高色价红曲米/粉工艺流程图。

具体实施方式

本发明提供了一种高产色素的红曲菌株，其分类命名为紫色红曲霉菌(monascus.purpureus)，菌株号csu-m183，已保藏于中国典型培养物保藏中心，其保藏编号为cctccno：m2018224，保藏日期为2018年4月19日，保藏地址：湖北省武汉市武昌区八一路299号。

本发明所提供的高产色素的红曲菌株的具体筛选方式是：

紫色红曲monascus.purpureuscsu-m183的筛选方法，将紫色红曲出发菌株luc(保存于稻谷及副产物深加工国家工程实验室)的孢子经等离子体诱变后，利用pda平板筛选得到产色素能力强的菌株，再经固态发酵筛选获得色素产量高的紫色红曲霉菌目标菌株，其筛选的具体步骤如下：

1)等离子体诱变：将紫色红曲菌原始菌株在pda平板上活化培养，培养温度30℃，培养时间10d，用生理盐水冲洗出平板上的孢子，制得孢子悬浮液，将孢子悬浮液稀释至孢子浓度为1×10^-6个每毫升，滴加在灭菌冷却后的载玻片上，用无菌空气吹干；以氮气为放电气体，以80～120w作为射频功率，以10～30slm作为气体流量，以10～240s作为辐照时间对孢子悬浮液进行等离子体诱变。

2)pda平板初筛：将诱变后的载片置于装有1～2ml生理盐水的具塞试管中，剧烈震荡，将载片上的孢子洗脱，稀释成不同浓度涂布于pda平板上，30℃培养，挑选出生长速度、菌落形态、直径、颜色等均优于出发菌株的单菌落。

3)固态发酵筛选：将步骤2)中筛选出的菌落接种于种子培养基进行扩大培养得到发酵种子液，培养温度30℃，培养时间72h，然后接种于固体培养基上进行固态发酵，种量10％(v/w)，发酵温度30℃，发酵时间10d，以考察步骤2)中筛选出的菌株发酵生产色素的能力，筛选出生产色素能力最强色价最高的菌株。

在上述筛选方法中：步骤1)中所述的等离子体诱变方法中，优选100w作为射频功率，10slm作为气体流量，150s作为辐照时间；步骤2)所采用的pda培养基，具体为马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂20g，水1000ml，ph＝6.0；步骤3)所采用的种子培养基，其配方为：葡萄糖40g/l，硝酸钠3g/l，酵母粉2g/l，七水合硫酸亚铁0.01g/l，磷酸二氢钾4g/l，ph＝6.0；固体培养基为蒸熟的籼米，具体制得方法为将籼米浸泡1小时，沥干后蒸至全熟即可。

经上述筛选，最终得到的该高产色素紫色红曲霉csu-m183菌株，在pda培养基上30℃培养7天，菌落直径28mm，平坦，表面呈现大量绒毛状气生菌丝，整个菌落正面呈橙红色，背面呈深红色至红褐色；显微镜观察菌丝光滑，多分枝，有隔膜，分生孢子排列呈链状，着生于菌丝顶端，单个孢子呈球形，闭囊壳近球形。

本发明还提供了基于如上所记载的高产红曲色素的紫色红曲霉csu-m183菌株在制备红曲色素的应用。

以本发明所提供的高产红曲色素的紫色红曲霉csu-m183菌株制备红曲色素时，其制备方法包括以下步骤：

(1)平板培养：取上述的高产红曲色素紫色红曲霉csu-m183菌株保藏菌种，在无菌的超净工作台内，用接种环取1所述的高产红曲色素紫色红曲霉csu-m183菌株保藏菌种两环，接种于pda培养基，30℃培养7天。pda培养基配方如下：马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂粉20g，纯水1000ml，ph＝6.0。

(2)种子培养：接种环刮取少量pda培养基上的红曲霉菌接种到种子培养基上，培养温度30℃，摇床转速150rpm，培养72小时。种子培养基配方如下：葡萄糖40g/l，硝酸钠3g/l，酵母粉2g/l，七水合硫酸亚铁0.01g/l，磷酸二氢钾4g/l，ph＝6.0。

(3)固态发酵生产红曲色素：将籼米浸泡1小时，沥干，蒸至全熟，按照接种量10％(v/w)接入种子液，拌匀，在恒温培养箱中温度为30℃、湿度为60％的条件下培养10天，60℃过夜烘干，制成红曲米/粉。

(4)色素测定：发酵完毕后，将红曲米研磨成粉状，过60目筛，根据适当得稀释倍数，取适量红曲粉溶于70％乙醇溶液，在60℃水浴锅中萃取2小时，冷却后测量红曲色素。

根据下述实施例，可以更好地理解发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所述的具体物料配比、工艺条件及其结果仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。

实施例1

本实施例说明将紫色红曲菌原始菌株进行第一步等离子体诱变的方法，紫色红曲菌原始菌株进行第一步等离子体诱变的方法如下：

将紫色红曲菌原始菌株在pda平板上活化培养，培养温度30℃，培养时间10d，用生理盐水冲洗出平板上的孢子，制得孢子悬浮液，将孢子悬浮液稀释至孢子浓度为1×10^-6个每毫升，滴加在灭菌冷却后的载玻片上，用无菌空气吹干；以氮气为放电气体，以100w作为射频功率，以10slm作为气体流量，以10～240s作为辐照时间对孢子悬浮液进行等离子体诱变，诱变后，将载片上的孢子膜洗脱下来，计算存活率。实验结果如附图1所示，由图1可知，150s是最佳的诱变辐照时间。

实施例2

本实例说明筛选高产色素的紫色红曲菌株的方法，其中所使用的培养基配方为：

1)pda培养基：马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂粉20g，纯水1000ml，ph自然。

2)液态种子培养基：葡萄糖40g/l，硝酸钠3g/l，酵母粉2g/l，七水合硫酸亚铁0.01g/l，磷酸二氢钾4g/l，ph＝6.0。

3)固态筛选培养基：将籼米淘净浸泡1小时，沥干，蒸至全熟。

具体的筛选步骤是：

pda平板初筛：将诱变后的载片置于装有1～2ml生理盐水的具塞试管中，剧烈震荡，将载片上的孢子洗脱，稀释成不同浓度涂布于pda平板上，30℃培养得到单个菌落，挑选出生长速度、菌落形态、直径、颜色等均优于出发菌株的单菌落。

固态发酵筛选：将筛选出的菌株csu-m183和原始菌株luc接种于种子培养基进行扩大培养得到发酵种子液，培养温度30℃，培养时间72h，然后接种于固体培养基上进行固态发酵，种量10％(v/w)，发酵温度30℃，发酵时间10d，考察两株菌发酵生产色素的能力，各菌株的色素产量如表1所示：

表1

实施例3

本实施例说明突变菌株csu-m183的传代稳定性，在仅以蒸熟的籼米为培养基质的固态培养基中，经固态发酵检测突变菌株csu-m183的传代稳定性，菌株csu-m183的传代发酵结果如表2所示。

表2

从实验结果可知，经过6次连续传代，此突变菌株的色素产量较稳定，具有较好的传代稳定性，可作为进一步研究和开发的生产菌株。

实施例4

本实施例说明突变菌株csu-m183固态发酵高产色素，实施例中所使用的培养基配方为：

1)pda培养基：马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂粉20g，纯水1000ml，ph自然。

2)液态种子培养基：葡萄糖40g/l，硝酸钠3g/l，酵母粉2g/l，七水合硫酸亚铁0.01g/l，磷酸二氢钾4g/l，ph＝6.0。

3)固态发酵培养基：将籼米淘净，浸泡1小时，沥干，蒸至全熟。

取上述的高产红曲色素紫色红曲霉csu-m183菌株保藏菌种，在无菌的超净工作台内，用接种环取菌种两环，接种于pda培养基，30℃培养7天；刮取少量pda培养基上的红曲霉菌接种到种子培养基上，培养温度30℃，摇床转速150rpm，培养72小时；将籼米浸泡1小时，沥干，蒸至全熟，按照接种量10％(v/w)接入种子液，搅拌均匀，在温度为30℃、湿度为60％的恒温培养箱中发酵10天，之后60℃过夜烘干，制成红曲米/粉。发酵完毕后，将红曲米研磨成粉状，过60目筛，根据适当得稀释倍数，取适量红曲粉溶于70％乙醇溶液，在60℃水浴锅中萃取2小时，冷却后测量红曲色素。经固态发酵10d后，测得红曲米的色价达到了8460u/g，而同等条件下培养的原始菌株luc的色价在3200u/g左右。