一种白酒丢糟的高效水解复合菌组的制作方法

本发明涉及水解白酒丢糟方案的优化研究，特别涉及二组新的高效水解白酒丢糟的复合菌组的筛选研究。技术背景白酒丢糟是谷物等经过反复发酵及蒸馏提取酒精后营养贫瘠的谷物外壳及残留渣体。即丢糟水分、木质纤维素(纤维素、半纤维、木质素)含量高，粗蛋白、粗脂肪等含量低,因为丢糟营养成分少，木质纤维素难水解，所以不能像一般酒糟那样有效的利用,从而使丢糟的转化受到极大的限制。况且丢糟酸度大，水分含量较高，极易腐败变质造成厂区及周围环境污染。而大大小小的酒厂分布在中国各地，这些酒厂给当地居民带来收入的同时，也产生了大量的丢糟，年排放量超过了20万吨。如何处理这些丢糟也是当地政府及酒厂管理人员头痛的事。近年来，利用微生物处理生物废料成为热点，因为与物理及化学处理方式所需要昂贵的设备及试剂相比，生物预处理是在温和的条件下通过利用微生物固体发酵水解木质纤维素类生物，设备要求无特殊，并且非病原性水解木质纤维素的微生物在环境中广泛存在，具有廉价、易获得、环保等优点。技术实现要素：本发明要解决的技术问题：针对丢糟酸度大、营养低、可利用价值低、污染环境的情况，提供一种以微生物高效复合菌组来提高丢糟水解速率，减小废渣存放空间，降低废渣处理成本的技术方案，促进维持良好生态环境,达到可持续循环利用白酒丢糟，为零排放无污染的政府倡导企业目标打下基础。本发明的技术方案：白酒丢糟的高效水解菌株，该高效水解菌株为cbs113.65oidiodendronechinulatum、cbs246.84phanerochaetechrysosporium、cbs383.78trichodermareesei、cbs554.65aspergillusniger、cbs110.42aspergillusniger和gym-37bjerkanderaadusta中的一种或一种以上组合。优选的高效水解菌株为cbs383.78+cbs554.65和cbs383.78+cbs554.65+gym-37两个复合菌组。最佳投入质量比例分别为1/2cbs383.78+1/2cbs554.65和1/3cbs383.78+1/3cbs554.65+1/3gym-37。本发明的有益效果1.本研究采用先筛选高效水解菌株，再利用真菌联合实验组成复合菌组水解丢糟，二度提高了菌株对丢糟的水解能力。筛选并建立新的高效复合菌组，优化了丢糟的水解效率(cbs554.65+cbs383.78纤维素、半纤维素酶活力较单一菌株提升了11.7％-135％，cbs554.65+cbs383.78+gym-37较单一菌株提升了半纤维素41.8％及纤维素酶活力74％)，高的水解效率更多的促进了丢糟从高分子聚合物转化为葡萄糖、木聚糖等单糖，解决了产甲烷细菌不能利用高分子聚合物生产生物天然气这一难题，从而实现了丢糟这一生物废料到生物天然气的转变，为解决当今化石燃料的急缺，发展循环、绿色经济等具有重要作用。2.本研究还利用产酶培养基使高效复合菌组的纤维素、半纤维素、木质素的酶活力比单纯使用丢糟作为营养物质的情况下(cbs554.65+cbs383.78酶活力增加了45％-268％，cbs554.65+cbs383.78+gym-37酶活力增加了55％-758％，两个组合的木质素关键酶也都有提高。)3.筛选并建立新的高效复合菌组对于挖掘真菌对白酒丢糟水解的能力及分离提纯复合菌组所产生的胞外酶，促进胞外酶的工业化转化，降低市场酶制品价格等具有重要作用。4.本研究建立的复合菌组(野生菌株)与sci文献报道的纤维素突变菌株对丢糟及其他八种生物质的水解能力相当(产生还原糖的含量相差较小，见表四)。促进了野生菌株资源的开发利用。各菌株在羧甲基纤维素素钠—刚果红培养基、pda—苯胺蓝培养基、木聚糖—刚果红培养基上初步测试水解木质纤维素的能力见表一，结果表明cbs113.65、cbs246.84、cbs383.78、cbs554.65、cbs439.92、cbs110.42、gym-37等16株真菌直径与显色、水解圈的比值较大。筛选在上述平板上菌水解、显色圈直径比值较大的菌株在丢糟液培养第3、7天的水解木质纤维素能力见figure1，结果表明cbs113.65、cbs246.84、cbs383.78、cbs554.65、cbs110.42、gym-37有较强的纤维素、半纤维素水解能力，cbs113.65有较强的木质素漆酶活性，gym-37有较强的木质素过氧化物酶活性。真菌联合实验表明cbs554.65，cbs383.78具有协同作用，组合后几种纤维素、半纤维素的关键酶都较单一菌株高，且酶活力在各组合中较高,而cbs554.65+cbs383.78+gym-37组合与cbs554.65+cbs383.78相比，它们对纤维素、半纤维的的关键酶活相当或稍低(cellulase在第3天达最高值，为99μmol/l，之后逐渐下降至零)，且cbs554.65+cbs383.78+gym-37组合培养前三天还具有部分木质素过氧化物酶活性，以六株高效水解菌株构建的16组复合菌组见表二。高效复合菌组cbs554.65+cbs383.78，cbs554.65+cbs383.78+gym-37与纤维素突变体菌组酶活测试对比见表三、对八种生物质的水解能力见表四，表三、四结果显示高效高效复合菌组与纤维素突变菌株对丢糟及生物质的水解能力相当。表一：筛选菌株在含有羧甲基纤维素素钠、苯胺蓝、木聚糖培养基上培养5天水解圈/菌直径比值表注释：表一表示在培养5天后水解圈/菌直径大小，其中3表示为比值大，2表示为比值较大，1表示为比值小。每个菌株重复2次实验。表二复合菌组在以丢糟为唯一营养物质的丢糟液中的关键酶活力测试表三.高效复合菌组与纤维素突变体菌组酶酶活测试对比表四.高效复合菌组与纤维素突变体菌组对生物质的水解能力比较附图说明图1为真菌的酶活力测试研究。实验研究是在以含有6％丢糟为唯一营养物质的丢糟液中培养3天、7天，取上清液进行酶活测定。a表示为β-葡糖苷酶酶活力，b表示为纤维素酶酶活力，c表示为β-木糖苷酶酶活力，d表示为木聚糖酶酶活力，e表示为漆酶活力，f表示为木质素过氧化物酶酶活力。图2采用hplc测定还原糖(葡萄糖、果糖、半乳糖等)含量并制定的标准曲线，a表示鼠李糖标准曲线，b表示半乳糖标准曲线，c表示阿拉伯糖标准曲线、d表示葡萄糖标准曲线，e表示果糖标准曲线，f表示半乳糖醛酸标准曲线，g表示核糖标准曲线。具体实施方式第一、westerdijk研究中心购买相应水解白酒丢糟的真菌、从丢糟酸性环境中分离真菌菌株；1.在白酒企业酸性环境中取样(在酒厂采集白酒丢糟堆腐物、新鲜的白酒丢糟，酒糟堆腐物用于分离可能具有水解白酒丢糟的真菌，新鲜白酒丢糟用于添加到培养基中)，称取堆腐物样品10g于250ml三角瓶中，加入100ml无菌水，30℃恒温震荡箱中震荡3～4h。1.1菌株分离：将震荡均匀的菌液静置30min，吸取适量上清液进行10倍梯度稀释，分别吸取10-1～10-5梯度的菌液各0.5ml接种于ypd培养基(酵母膏胨葡萄糖琼脂培养基，含氯霉素)，28℃倒置培养24-48h；1.2菌株转种和传代：接种于ypd固体培养基平板(含氯霉素)，划线法分离单菌落，25℃，培养24-48h，新鲜的菌落作为供试菌；1.3观察菌落形态、大小、颜色；1.4取供试菌培养物涂片，革兰染色后油镜观察形态、排列及染色性；1.5dna提取：ctab法提取dna1.5.1将菌株接种于pda培养基平板，28℃，培养72h；1.5.2将培养皿从培养箱内取出放入已经灭菌的超净工作台上；1.5.3打开水浴箱加热至60℃；1.5.4在2ml离心管中加入400μlctab-buffer2x及6-10颗酸泡玻璃珠(1.5-2mm)，挑取菌落体积(1-10))mm于该离心管内，然后加入100μl10％的pvp，在旋窝混匀器上混匀10min。放入水浴箱，60℃水浴60min；1.5.5待菌落溶解后，加入500μlsevag，震荡2min后，形成了乳浊液。离心：14000g10min；1.5.6收集上层清液加入另一无菌ep管中，定量；1.5.7加入冰冻异丙醇(量为上清液的2/3体积，混匀)，上下颠倒离心管，-20℃过夜培养；1.5.8取出，离心：14000g10min；1.5.9弃上清，加入70％的冰冻酒精1ml，轻轻混匀，离心：14000g2min.晾干；1.5.10dna沉淀，加入te-buffer50ul获得dna提纯液；1.5.11提取的dna，吸光度法检测dna浓度，并稀释成1ug/ul冷冻备用。1.6pcr扩增1.6.1pcr引物：据文献its特异性引物。pcr扩增所用引物由上海生工生物技术有限公司合成。基因引物序列itsits55’-ggaagtaaaagtcgtaacaagg-3’its45’-tcctccgcttattgatatgc-3’pcr反应体系(26μl)：1.6.2pcr反应程序：1.6.3凝胶电泳检测所提dna1.6.3.1称取1.0g琼脂糖粉于100ml1.0×tae工作液，用微波炉加热至琼脂糖完全融化后，取出室温冷却至60℃左右，加入1μl绿如蓝(dnagreen)，震动混匀，将配制1.0％的琼脂糖凝胶约60ml倒入已封好的凝胶灌制平台上，插入样品梳子；待胶凝固后，除去梳齿，放入加有足够tae电泳缓冲液的水平凝胶电泳仪中，应使缓冲液高出凝胶1cm；1.6.3.2将1μl10×loadingbuffer加3μldna提取物混匀后，制备上样液，用移液器将上样液加入样品孔中；1.6.3.3通电，100v电泳约20min，发现加样缓冲液中指示剂迁移至足够分离dna片段的距离，停止电泳；经绿如蓝(dnagreen)染色的凝胶在紫外投射仪上观察，观察结果；1.7测序：琼脂糖凝胶电泳检测后送上海生工测序。1.8序列相似度对比：在genbank核酸序列数据库中进行同源序列搜索(blastsearch)以比较供试菌株与已知菌株相应序列的相似程度；确定种属并了解其生长特性。从酒厂分离出monascussp.，bjerkanderaadusta.，geotrichumsp.，aspergillussp.等13株真菌。2在westerdijk研究所菌种库(www.fung-growth.org)中相关水解白酒丢糟所需要的关键酶信息来筛选可能水解白酒丢糟的有效真菌，从而寻找分别水解木质素、纤维素、半纤维素的真菌。从westerdijk共筛选出trichodermareesei，aspergillusniger，oidiodendronechinulatum，oidiodendronechinulatum，phanerochaetechrysosporium，trichodermalongibrachiatum等20株真菌。第二、将在羧甲基纤维素钠、木质素、半纤维素平板上生长良好的菌株，利用羧甲基纤维素素钠—刚果红培养基、pda—苯胺蓝培养基、木聚糖—刚果红培养基进行半定量筛选：2.1固体培养基筛选2.1.1以白酒丢糟中单一聚合物为唯一碳源的筛选实验。2.1.1.1培养基制备方法：a.羧甲基纤维素--刚果红培养基配方：kh2po4:0.5g,mgs04·7h20:0.5g,羧甲基纤维素钠:10g琼脂:15g,刚果红:0.2g,明胶：2g；蒸馏水1l，ph6.8–7.2b.马铃薯葡萄糖琼脂培养基(pda)--苯胺蓝培养基pda培养基：马铃薯：200g,葡萄糖：20g，琼脂15g，蒸馏水1lpda中加入0.01％苯胺蓝。c.木聚糖刚果红培养基刚果红0.01g,mgs04·7h20:0.1g,酵母粉:0.5gkh2po4:0.1g琼脂:1.5g,(nh4)2so4:0.1g木聚糖：0.5gnacl:0.5g,ddh2o:100ml2.1.1.2将各筛选菌株在酵母膏胨葡萄糖琼脂培养基(ypd)上培养3天，待菌苔生长良好后，用直径为8mm的打孔器打孔，将菌饼接种在上述a、b、c四种培养基中在25℃中恒温孵育，以不接种菌的培养基为对照，每个菌株重复两次实验，取平均值，pda—苯胺蓝培养基需避光孵育)2.1.1.3每天观察显色、水解圈、菌苔大小，分别测量其直径并记录。共筛选出cbs113.65oidiodendronechinulatum，cbs246.84phanerochaetechrysosporium，cbs383.78trichodermareesei，cbs554.65aspergillusniger，cbs110.42aspergillusniger，gym-37bjerkanderaadusta、cbs439.92trichodermareesei等16株水解圈与菌直径比值较大的真菌。2.2丢糟液体培养基筛选2.2.1将丢糟粉碎，过80目筛，准确称取3g加入50ml蒸馏水，制成丢糟液。2.2.2将在a、b、c四种培养基中显色、水解圈与菌苔比值大的菌株接种在ypd液体培养基中，恒温摇床孵育3-7天后，以7.5mg/l的量接种在丢糟液中，25℃恒温孵育，以不接种菌的培养基为对照，每个菌株重复两次实验，取平均值。2.2.3每天观察各菌在丢糟液中生长情况，分别于第3、7天取丢糟液，经14000rpm离心10min，取上清液储存4℃，用于酶活力测定。2.2.4酶活力测定2.2.4.1纤维素关键酶测定⑴β－葡萄糖苷糖(bg)酶活测定以pnp-β-d-glucopyranose(pnpbgl)为底物反应体系为：1％pnpbgl50μl,10μl(50mm,ph5.0)naac,40μl酶上清液加入到96孔板中。待反应体系在25℃孵育过夜后，加入(0.25m)na2co3100μl后，在紫外分光光度计，405nm处测量od值。(2)β-xylosidase酶活测定以pnp-β-d-xylopyranose(pnpbxl)为底物反应体系为：1％pnpbxl50μl,10μl(50mm,ph5.0)naac,40μl酶上清液加入到96孔板中。待反应体系在25℃孵育过夜后，加入(0.25m)na2co3100μl后，在紫外分光光度计，405nm处测量吸光度值。(3)cellulase酶活测定以微晶纤维素(avicel)为底物反应体系为：1％avicel180μl,20μl上清液加入到96孔板中，25℃孵育过夜后，以漩涡器混匀后，转移100μl上清液到新的96孔板，加入150μldns液，95℃水浴30分钟后，样品在冰浴中冷却孵化，并在540nm处的测定吸光值。(4)木聚糖酶(xylanase)酶活测定以xylan为底物反应体系为：1％xylan180μl,20μl酶上清液加入到96孔板中，25℃孵育过夜后，以漩涡器混匀后，转移100μl上清液到新的96孔板，加入150μldns液，95℃水浴30分钟后，样品在冰浴中冷却孵化，并在540nm处的测定吸光值。(5)漆酶(laccase)酶活测定以2,2'-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulphonicacid)(abts)为底物反应体系为：140μlddh2o,20μlglycine-hcl(500mm,ph3.0),20μl酶上清液，20μlabts25℃孵育过夜后，在436nm处测定吸光值。(6)木质素过氧化物酶活性测定以abts及h2o2为底物反应体系为：125μlddh2o、10μl、10μlh2o2、25μlbriffon-robinsonbuffer(ph4.5)、20μl酶上清液，20μlabts25℃孵育1h后，在436nm处测定吸光值。每个样品重复2次，求平均值及标准误，以不加菌液的丢糟上清液为空白对照。2.2.4.2标准曲线的绘制2.2.4.2.1pnp标准曲线的绘制100μmpnp(mw＝139.11g/mol)1mlof100mm:称量0.0139gpnp按1:10稀释，再按1:100稀释。以上表中的量加入到96孔板中，再在每孔中加入(0.25m)na2co3100μl，在436nm处测定吸光值。以光吸收值作为纵坐标，以pnp含量作为横坐标，绘制标准曲线，列出标准曲线方程，计算酶活值。2.2.4.2.2dns标准曲线的绘制称量180mg葡萄糖，溶解在10mlnaac中，稀释5倍以上表中的量加入到96孔板中，再在每孔中加入150μldns液，95℃水浴30分钟后，样品在冰浴中冷却孵化，并在540nm处的测定吸光值。以光吸收值作为纵坐标，以葡萄糖含量作为横坐标，绘制标准曲线，列出标准曲线方程，计算酶活值。2.2.4.3酶活力值的计算pnp及dns法按相应标准曲线方程计算，漆酶及木质素过氧化物酶酶活值按公式：δod420×v总×106(/ε×l×v酶)，式中ε为abts氧化态的摩尔消光系数(36000l·mol-1·cm-1)。共筛选6株高效水解菌株。cbs113.65oidiodendronechinulatum、cbs246.84phanerochaetechrysosporium、cbs383.78trichodermareesei、cbs554.65aspergillusniger、cbs110.42aspergillusniger、gym-37bjerkanderaadusta。2.3联合培养及产酶优化培养2.3.1联合培养的丢糟液及菌液按上述方法准备接种菌的总量同为7.5mg/l，酶活测定及计算方法同单一菌株，以不接种菌的丢糟液及单一菌株为对照。每个复合菌组，重复2次，求平均值。筛选出高效水解丢糟复合菌组二个：cbs383.78+cbs554.65和cbs383.78+cbs554.65+gym-37。2.3.2按2.2.3项方法接种在含有0.4mmcuso4的1％minimalmedium(mm)50ml(vriesrpdetal.2004)及3g丢糟液体培养基中，取培养第3、5、7天上清液进行酶活力测定。2.4高效复合菌组与纤维素突变菌株对丢糟的水解酶活力对比2.4.1本研究所用的纤维素突变菌株见下表，菌株均保存在(fungalphysiology，ronaldp.devries研究组)2.4.2将各突变菌株，与本实验cbs383.78组合，按2.3.2所述方法接种，取培养第3、5、7天上清液进行酶活力测定。2.5突变复合菌株与本研究的两组高效水解菌组对八种生物质的水解能力比较。2.5.1八种生物质信息见下表中国名eeglishname米糠ricebran(rb)麦麸wheatbran(wb)玉米秸秆cornstover(cs)桦(树)粉末birchwood(biw)挪威云杉粉norwaysprule(nan)甜菜渣sugarbeetpulp(sugar)丢糟wastegrain(sg)小麦秸秆wheatstover(ws)2.5.2将各生物质加入到50mm的sodiumacetatebuffer(ph4.5)(含有0.02％的nan3sodiumafide)配成1％的浓度的生物质。2.5.3将各生物质摇匀后取500μl加入到2ml的ep管，再加入100μl的培养上清液。2.5.4将各样本在30℃，100rpm摇床孵育24h后于95℃水浴15min,再在4℃，14000rpm离心10min。2.5.5取上一步离心后的上清液100μl，用milliqwater稀释10倍后，利用hplc测定还原糖(葡萄糖、果糖、半乳糖)含量，利用相关还原糖(葡萄糖、果糖、半乳糖)的标准品做标准曲线。当前第1页12