专利名称：一种应用荧光假单胞菌生产天然蓝色素的方法
技术领域：
本发明涉及天然蓝色素的生产技术方法及其生产菌株，尤其是低能耗清洁生产天然蓝色素的技术方法，属于生物化工及着色剂生物技术领域。
背景技术：
色素，也称着色剂，广泛应用于日化、医药、印染、食品等行业领域，能够在很大程度上改善产品性状及影响产品品质。人工合成色素和天然色素是两类应用广泛的主要色素。尽管人工合成色素色泽鲜艳，价格低廉，着色性及稳定性良好，但其对人体健康普遍存在一定程度的毒性，甚至具有致畸、致突变、致癌作用。许多国家已对人工合成色素的使用种类、应用范围、添加剂量等作出明确规定，有些国家甚至完全禁止使用合成色素。天然色素主要来源于动物、植物、微生物，绝大多数无毒副作用，安全性高，而且许多天然色素还兼 具营养及生理药理功能，符合人们对“安全、天然、营养、多功能”色素产品的需求。天然蓝色素是稀有贵重色素，产品附加值很高。目前常用的天然蓝色素为桅子蓝色素和藻蓝色素，分别以桅子果实和螺旋藻及念珠藻为生产原料，而这些原料多产于温暖湿润地区，这使得天然蓝色素的自然资源非常稀缺，不利于天然蓝色素的大规模产业化生产。产蓝色素微生物菌株极为少见，已报道的主要为放线菌(如海洋放线菌M259、天蓝链霉菌100、链霉菌ZLT菌株等)，但这些菌株产蓝色素生长周期长，产色素的温度范围窄，生长过程中形成菌丝体不利于发酵进行，因此色素产量比较低。发酵产蓝色素的细菌有荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens) BI菌株(CGMCC No. 1194)(邪新会等，发明专利申请号200410074325. O)和黄杆菌{Flavobacterium 577. )B29 菌株(CGMCC No. 3699)(唐琦勇等，发明专利申请号201010166734. 9)，但它们以菌体为色素制备原料来源，这限制了蓝色素的规模生产。
发明内容
本发明的目的是应用一种能够产生大量胞外蓝色素的荧光假单胞菌株，通过发酵提取制备大量天然蓝色素制品。本发明提供了一种应用蓝色素产生菌-突光假单胞菌iPseudomonas
fluorescens BMG-1)菌株生产天然蓝色素的发酵及制备工艺方法。本发明所应用的产蓝色素突光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens BMG-1)已于2012年5月3日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏号为CGMCC No. 6060。由突光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens BMG-1)菌株生产蓝色素的步骤如下
I)种子液制备刮取经琼脂平板复壮培养的荧光假单胞菌{Pseudomonasfluorescens BMG-1)培养物，均勻分散于发酵培养液中，制成发酵用种子液。以每个直径
09cm琼脂平板使用IOmL发酵培养液的比例配制发酵用种子液。
2)发酵培养以2%_8%的接种量将种子液接种于发酵培养液中，在20°C _28°C静置发酵培养48小时。本发明采用浅盘培养发酵方式，盘中培养液层厚度为l-2cm。3)色素制备离心除去发酵培养液中的菌体，收集上清液并低温真空浓缩至原体积的1/5-1/10。以乙醇沉降浓缩液，收集蓝色沉集物以5-10倍蒸馏水洗涤，合并水洗液并真空浓缩干燥可制得蓝色素粗制品。合并水洗液过硅胶柱层析可制得蓝色素精制品。所述复壮菌种用琼脂平板含有下过物质10-40克葡萄糖，100-300克新鲜马铃薯的沸水浸出物，18-20克琼脂粉，加蒸馏水至1000毫升。优选的，步骤I)中琼脂平板配制为20克葡萄糖，200克新鲜马铃薯的沸水浸出物，18克琼脂粉，加蒸馏水至1000毫升，121°C灭菌20分钟，pH为7. O。优选的，步骤2)中发酵培养液配制为20克葡萄糖，200克新鲜马铃薯的沸水浸出物，加蒸馏水至1000毫升，121。。灭菌20分钟，pH为7. O。 本发明制备的蓝色素，易溶于水，在690nm处有一个最大吸收峰，在pH2. 2_10. O范围内较为稳定，具有非常良好的热稳定性和自然光稳定性，具有一定程度的抗氧化能力。本发明的生产菌株生长速度快，在20°C _28°C温度范围内都可发酵产色素，发酵产色素过程为浅盘静置自然通气培养方式，培养设备及条件要求粗放，能耗低，色素产量大(蓝色素粗品产量一般可以达到I. 5-2. 5克/升发酵液，蓝色素精制品产量一般可以达到
0.5-1克/升发酵液)，制备工艺简单，便于产业化规模生产。发酵制得的蓝色素为纯天然色素产品，对动物体无任何毒副作用，可以广泛应用于日化、医药、印染、食品等行业领域。
图I所示为荧光假单胞BGM-I菌株所产蓝色素吸收光谱曲线图。图2所示为不同温度对荧光假单胞BGM-I菌株所产蓝色素稳定性的影响曲线图。图3所示为pH2. 2-8. O值对荧光假单胞BGM-I菌株所产蓝色素稳定性的影响曲线图。图4所示为pH8. 6-10. 6值对荧光假单胞BGM-I菌株所产蓝色素稳定性的影响曲线图。图5所示为不同氧化还原剂对荧光假单胞BGM-I菌株所产蓝色素稳定性的影响曲线图。
具体实施例方式实施例I、荧光假单胞菌BMG-1 CGMCC No. 6060的培养
将保藏的突光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens BMG-1) CGMCC No. 6060 在 PDA培养基上进行复壮培养，检测菌落颜色及培养基颜色的变化；将复壮的菌株接种于发酵培养液中，浅盘静置、自然通气方式培养，培养液层厚度为l-2cm, 26°C恒温培养,至整个培养液颜色变为深蓝绿色时结束培养过程。
实施例2、菌种发酵培养及蓝色素提取制备
I、菌种发酵培养
将由复壮的BMG-I菌种制备的种子液以3%的接种量接入发酵培养液，浅盘静置、自然通气培养方式，培养液层厚度lcm，22°C恒温培养，至72小时整个培养液颜色变为深蓝绿色时结束培养过程。2、蓝色素的提取制备
收集发酵培养液在8000r/min下离心15min,合并上清液在40°C下真空浓缩至原体积的1/6。以6倍体积无水乙醇洗涤浓缩液，收集沉集物。以10倍浓缩液体积的蒸馏水洗涤沉集物，合并水洗液并在40°C下真空浓缩、干燥可制得蓝色素粗制品，得率为2. 52g/L发酵液。将此经浓缩的水洗液过60-100目硅胶柱层析，以蒸馏水为洗脱剂，收集蓝色洗脱组分，浓缩干燥后可制得蓝色素精制品，得率为O. 98g/L发酵液。
实施例3、菌种发酵培养及蓝色素提取制备
1、菌种发酵培养
将由复壮的BMG-I菌种制备的种子液以5%的接种量接入发酵培养液，浅盘静置、自然通气培养方式，培养液层厚度I. 5cm，24°C恒温培养，至60小时整个培养液颜色变为深蓝绿色时结束培养过程。
2、蓝色素的提取制备
收集发酵培养液在8000r/min下离心15min,合并上清液在40°C下真空浓缩至原体积 的1/8。以8倍体积无水乙醇洗涤浓缩液，收集沉集物。以10倍浓缩液体积的蒸馏水洗涤沉集物，合并水洗液并在40°C下真空浓缩、干燥可制得蓝色素粗制品，得率为2. llg/L发酵液。将此经浓缩的水洗液过60-100目硅胶柱层析，以蒸馏水为洗脱剂，收集蓝色洗脱组分，浓缩干燥后可制得蓝色素精制品，得率为O. 73g/L发酵液。
实施例4、菌种发酵培养及蓝色素提取制备
1、菌种发酵培养
将由复壮的BMG-I菌种制备的种子液以7%的接种量接入发酵培养液，浅盘静置、自然通气培养方式，培养液层厚度2. 0cm, 26°C恒温培养，至48小时整个培养液颜色变为深蓝绿色时结束培养过程。
2、蓝色素的提取制备
收集发酵培养液在8000r/min下离心15min,合并上清液在40°C下真空浓缩至原体积的1/10。以10倍体积无水乙醇洗涤浓缩液，收集沉集物。以10倍浓缩液体积的蒸馏水洗涤沉集物，合并水洗液并在40°C下真空浓缩、干燥可制得蓝色素粗制品，得率为I. 58g/L发酵液。将此经浓缩的水洗液过60-100目硅胶柱层析，以蒸馏水为洗脱剂，收集蓝色洗脱组分，浓缩干燥后可制得蓝色素精制品，得率为O. 59g/L发酵液。
权利要求
1.一种应用突光假单胞菌 iPseudomorms fl uorescens BMG-1) CGMCC No. 6060 发酵、生产制备天然蓝色素的方法，包括如下步骤 1).将保藏的突光假单胞菌fluorescens BMG-1) CGMCC No. 6060 使用PDA培养基活化、扩大培养； 2).将步骤I)的菌株培养物以2%-8%的接种量接种于H)培养液中，200C-280C浅盘静置、自然通气方式培养36-60小时； 3).将步骤2)的培养液除去菌体，收集上清液，以蒸馏水提取其中的蓝色素，经浓缩干燥后获得蓝色素粗制品及精制品； 根据权利要求I所述的方法，其特征在于所选生产蓝色素的H)培养液含有下述物质20克葡萄糖，200克鲜马铃薯的沸水浸出物，加蒸馏水至1000毫升，121°C灭菌20分钟，pH为 7. O。
2.根据权利要求I所述的方法，其特征在于所述含蓝色素上清液是通过离心除去培养液中的菌体后得到的，离心转速为3000-8000r/min。
3.根据权利要求I所述的方法，其特征在于所述含蓝色素上清液是通过离心除去培养液中的菌体后得到的，离心转速为3000-8000r/min。
4.根据权利要求I所述的方法，其特征在于低温(35°C-45°C )真空浓缩离心除菌后的含蓝色素上清液至原体积的1/5-1/10 ;以乙醇沉降浓缩液，收集蓝色沉集物以5-10倍蒸馏水洗涤，合并水洗液并低温(35°C -45°C )真空浓缩干燥可制得蓝色素粗制品；合并水洗液经浓缩后过硅胶柱层析可制得蓝色素精制品。
5.根据权利要求I或4所述的方法，其特征在于所述沉降含蓝色素上清浓缩液的乙醇为无水乙醇，用量为浓缩液的5-10倍。
6.根据权利要求2或7或8所述的方法，其特征在于所述柱层析采用60-100目或100-200目试剂级硅胶，以蒸馏水为洗脱剂；收集洗脱液真空干燥后获得蓝色素精制品；所述蓝色素精制品在690nm处有一个最大吸收峰。
全文摘要
本发明公开了一种应用荧光假单胞菌生产天然蓝色素的方法。本发明使用荧光假单胞菌BGM-1菌株(PseudomonasfluorescensBGM-1)CGMCCNo.6060生产胞外水溶性蓝色素，生产方法为将产蓝色素荧光假单胞菌BGM-1菌株以2%-8%接种量接种于浅盘PD培养液中，20-28℃条件下恒温静置培养24-48小时得到发酵液。离心除去菌体，浓缩发酵上清液。以乙醇浸洗经浓缩的发酵上清液，收集沉集物并以蒸馏水浸洗，将水洗液减压浓缩干燥后得蓝色素粗制品。收集水洗液除沉、浓缩后过硅胶柱层析，经减压浓缩干燥后得到蓝色素精制品。所得蓝色素具有很好的光热稳定性和酸碱稳定性，对动物无任何毒副作用，为纯天然蓝色素产品，可广泛应用于日化、医药、食品等工业各领域。本发明为天然蓝色素的产业化生产提供了新的方法及途径。
文档编号C12P1/04GK102899355SQ201210218018
公开日2013年1月30日 申请日期2012年6月28日 优先权日2012年6月28日
发明者毛得奖, 朱亚玲 申请人:山东轻工业学院