在荧光假单胞菌中表达哺乳动物蛋白的制作方法

专利名称：在荧光假单胞菌中表达哺乳动物蛋白的制作方法
技术领域：
本发明是通过在假单胞菌中，特别是在荧光假单胞菌生物体中表达，而改良重组哺乳动物蛋白的产量的方法。与已知表达系统相比，该方法提高了哺乳动物蛋白表达的产量。
背景技术：
超过3亿2千5百万的全世界的人们受到了美国食品药品管理局批准的超过155种生物技术的药物和疫苗的益处。另外，有超过370种瞄准200多种疾病的生物技术药物产品和疫苗正在临床试验阶段，其中多种疾病包括各种癌症，阿姆次病，心脏病，糖尿病，多发硬化，AIDS和关节炎。与传统的通过传统的化学合成的小分子治疗剂不同，在活细胞中通常低效、高造价地产生蛋白质。由于高造价和复杂性，以蛋白质为基础的治疗剂的生产能力有缺陷。
使用微生物细胞生产产品有很长的历史了。早在1897年，Buchner发现酵母中提取的酶可有效地将糖转化为酒精，从而产生了使用微生物进行主要的工业化学生产。到了20世纪40年代，发展了通过发酵大规模生产青霉素。在20世纪70年代早期第一次发展了详细菌中插入异源基因的技术。细菌生产商业的大量的重组哺乳动物蛋白第一次在生产人类胰岛素中开发(Goeddel等，1979a；Wong，1997)。今天，发酵和细胞培养在大多数工业生产的酒精、抗生素、生物化学和治疗蛋白质起作用。可是，开发和生产治疗上有效的仍受到阻碍，一大部分原因是用于表达这些外源性蛋白质的现有有机物的局限性。
原核和真核蛋白表达系统尽管常常使用细菌表达系统生产重组的真核蛋白，典型地产生的蛋白质根据其来源的部分不同有显著的不同。通常，在大肠杆菌表达系统中再生真核的二级和三级结构具有挑战性。同时，尽管真核表达系统现在可更好地形成重组蛋白的二级和三级结构，这些系统大量产生重组蛋白的能力是有限的。
翻译后修饰代表了原核和真核蛋白表达系统的最显著的不同。原核细胞(即，细菌)具有非常简单的细胞结构，没有膜包裹的细胞器。在真核细胞中，蛋白质在经初期产生后常常被修饰。这些修饰，在许多情况下，是将多肽转化为其功能形式所必需的。因此，即使当存在的细菌表达系统产生具有正确初级结构的蛋白质，该蛋白质可能没被翻译后修饰因而常常不具功能。一般的修饰包括形成二硫键、糖基化、乙酰化、酰化、磷酸化和γ羧化，所有这些都可以调节蛋白折叠和生物活性。通常细菌表达系统不能正确地糖基化、乙酰化、酰化、磷酸化或γ羧化真核蛋白。
细菌，例如大肠杆菌可形成二硫键，但该键通常不能以生物学活性所需的正确的构象形成。在原核和真核细胞中均存在分子伙伴蛋白，其有助于其他蛋白的折叠。在缺少这种分子伙伴蛋白时，细胞中的不折叠或部分折叠的多肽链不稳定，通常不正确地折叠或聚集成不溶的复合体。与伙伴结合稳定了这些未折叠的多肽，从而防止不正确的折叠或聚集，使得多肽链折叠成正确的构象。可是，细胞类型不同，伙伴也不同，而且其可根据细胞外的条件发生不同的表达。
现有表达系统的问题埃希氏大肠杆菌(E.coli)是最广泛最常用的蛋白表达系统。在埃希氏大肠杆菌中的生产是廉价的、快速的、易于鉴别的。而且，大规模生产和回收是可能的，可以完善的建立起cGMP生产。可以，使用埃希氏大肠杆菌具有常常证明是难以克服的显著的局限性，特别是当表达重组哺乳动物蛋白时。
与上述的局限性一起，在埃希氏大肠杆菌中高水平表达重组基因产物常常导致目标蛋白质的错误折叠，继而使其被细胞的蛋白酶降解或沉积成如所知的包涵体的生物学上无活性的聚集物。典型地包涵体中的蛋白质必须被提取、重新恢复其活性，此过程需要时间和金钱。典型的复性的方法包括将聚集体溶解在浓缩的变性剂中，继而通过稀释除去变性剂。一些曾被指出涉及包涵体形成的因子包括高局部浓度的蛋白；细胞质中降低的环境(埃希氏大肠杆菌细胞质具有高水平的谷胱甘肽)防止二硫键形成；缺少翻译后的修饰，该修饰可增加蛋白质的稳定性；与伙伴和其他涉及体内折叠的酶的不正确的相互反应；通过二硫键或其它键发生的分子间铰链反应；由于其有限的溶解性而导致的折叠铰链间的聚集。可能是这些因子的结合，以及伙伴的有限性，常常导致包涵体的形成。
酵母表达系统，如塞里维辛酵母或毕赤酵母(pichia pastoris)也常被用于生产蛋白。这些系统被很好的鉴别的，与其他真核表达系统性比，提供了良好的表达水平及相对快和廉价。可是，酵母仅能完成有限的翻译后蛋白质修饰，蛋白质也许需要再折叠，而且由于存在细胞壁这一特性，收获蛋白质有问题。
昆虫表达系统作为有吸引力的但是昂贵的蛋白质表达系统出现了。有时候能够产生通常被翻译后修饰的正确的折叠蛋白质并实现细胞外表达。可是，其没有细菌和酵母快，大规模生产常常是挑战。
哺乳动物细胞表达系统，如中国仓鼠卵细胞，通常被用于复杂蛋白质的表达。此系统通常产生具有正确的翻译后修饰的正确折叠的蛋白质，蛋白质能被细胞外表达。可是，该系统非常昂贵，大规模生产很慢常常不可行，蛋白产量比其它系统低。
荧光假单胞菌(P.fluorescent)荧光假单胞菌包括一组普通的、非致病的腐生物，其靠土壤、水和植物表面环境生存。荧光假单胞菌被广泛应用于农业和工业生产，包括商业生产非哺乳动物的工业和农业蛋白。衍生于荧光假单胞菌的非哺乳动物酶被用于降低环境污染，如去垢添加剂和用于立体选择的水解。在20世纪80年代中期Mycogen开始在荧光假单胞菌中表达重组细菌蛋白，在1985年1月22日提交了第一份关于在荧光假单胞菌中表达苏芸金杆菌毒素的专利申请(“生物杀虫剂的细胞包装”)。在1985-2004年间，Mycogen，后来是Dow Agro Sciences以及其它公司投资于荧光假单胞菌的农业应用，在专利申请中申请关于杀虫的、除虫的和杀线虫的毒素，以及特异的毒素序列和基因操纵以增强其表达。在荧光假单胞菌中表达重组的细菌蛋白的专利申请的例子包括美国专利Nos.3,844,893；3,878,093，4,169,010；5,292,507；5,558,862；5,559,015；5,610,044；5,622,846；5,643,774；5,662,898；5,677,127；5,686,282；3,844,893；3,878,093；4,169,010；5,232,840；5,292,507；5,558,862；5,559,015；5,610,044；5,622,846；5,643,774；5,662,898；5,677,127；5,686,282；5,686,283；5,698,425；5,710,031；5,728,574；5,731,280；5,741,663；5,756,087；5,766,926；5,824,472；5,869,038；5,891,688；5,952,208；5,955,348；6,051,383；6,117,670；6,184,440；6,194,194；6,268,549；6,277,625；6,329,172；6,447,770；以及PCT公开Nos.WO 00/15761；WO 00/29604；WO 01/27258；WO 02/068660；WO02/14551；WO 02/16940；WO 03/089455；WO 04/006657；WO 04/011628；WO 87/05937；WO 87/05938；WO 95/03395；WO 98/24919；WO 99/09834和WO 99/53035。
在2003年10月8日，Dow AgroScience提交的PCT公开No.04/087864，题目为“Amended Recombinant Cells(ARCs)for theProduction and Delivery of Antiviral Agents，Adjuvants andVaccine Accelerants″。该申请描述了包括至少一个编码化学因子或细胞因子的异源基因的重组细胞和向宿主投药这样的细胞以加速免疫反应。该申请论证了在荧光假单胞菌中生产小牛干扰素α和干扰素γ。
现在陶氏环球技术公司(Dow Global Technologies)有一些在应用荧光假单胞菌产生重组蛋白的领域中的正在进行的专利申请。2003年2月13日提交的题目为“Over-Expression of Extremozyme Genesin假单胞菌and Closely Related Bacteria”的陶氏环球技术公司的PCT申请WO 03/068926描述了假单胞菌，特别是荧光假单胞菌表达系统可被用作宿主细胞生产极端酶。这些酶典型地是远古的，发现于原核细胞、真核细胞包括真菌、酵母、苔藓、原生生物和原生动物、藻类和藓、节肢动物和鱼。该专利公开了酶可衍生自某种极端的真菌和酵母，但是典型地衍生自极端的细菌。
2003年4月22日提交的题目为“Low-Cost Production ofPeptides”的陶氏环球技术公司的PCT公开No.WO 03/089455描述了在假单胞菌，特别是荧光假单胞菌中生产小肽、初级抗微生物肽如concatameric前体的方法。
陶氏环球技术公司的题目为“Benzoate and AntranilateInducible Promoters”的PCT公开No.WO 04/005221提供了用于商业的原核发酵系统中的新的来源于荧光假单胞菌的安息香酸盐-或氨基苯甲酸盐诱导的启动子，以及新的前后启动子，其变异和改良的突变。
Monsanto Co的美国专利No.5,232,840描述了新的核糖体结合位点在原核细胞中增强某种蛋白的表达中的应用。在一个例子中，该细胞被用于在多种有机体中表达猪生长激素，包括埃希氏大肠杆菌、荧光假单胞菌和恶臭假单胞菌。数据表明与埃希氏大肠杆菌相比，荧光假单胞菌在表达生长激素中的效率低。相反地，当表达细菌蛋白时，在可比较的条件下荧光假单胞菌比埃希氏大肠杆菌更有效地产生蛋白。事实上，在本专利中描述的荧光假单胞菌比埃希氏大肠杆菌多产生几倍的细菌衍生的β半乳糖(将表4与表1和2比较)。
在生产商业上感兴趣的蛋白产生进展时，仍强烈需要改良生产重组哺乳动物特别是人的蛋白质的能力和水品。
因此，本发明的一个目的是提供生产用于治疗的可分离的和纯化的重组哺乳动物，特别是人的蛋白质的方法，以及能完成该方法的细胞。
本发明的另一个目的是提供生产活性重组哺乳动物蛋白，包括复杂的哺乳动物蛋白的改良的方法。
本发明的另一个目的是提供生产高水平的重组哺乳动物，特别是人的蛋白的改良的方法。
本发明的另一个目的是提供可提供高表达水平的可溶或不可溶的哺乳动物重组蛋白的转化的生物体。

发明内容
已近发现荧光假单胞菌是生产重组蛋白的优良的生物体，特别是重组的哺乳动物蛋白，如重组的人蛋白。基于此发现，本发明提供了在荧光假单胞菌中生产重组哺乳动物或哺乳动物衍生的蛋白的方法。另外，本发明提供了转化的生产重组的哺乳动物，包括人的蛋白的荧光假单胞菌。
一个实施方案中，本发明提供了在荧光假单胞菌生物体中生产哺乳动物蛋白的方法，其中在可比较的条件下比埃希氏大肠杆菌发酵反应的每个细胞或每升中产生更高水平或浓度的蛋白。在另一个实施方案中，本发明提供了一种在荧光假单胞菌生物体中在批量培养中生产哺乳动物蛋白的方法，与相应的重组埃希氏大肠杆菌的批量培养相比，其每升可产生更大量的蛋白质。
可比较的条件或基本上可比较的条件特别地指在不同的生物体中使用相同的可操纵地连接的转录启动子和核糖体结合位点，并使用相同的起始诱导条件表达重组蛋白。可比较的条件可进一步包括使用相同的载体和相关的调节元件，包括但不局限于，增强子序列、终止序列和起始或复制序列。可比较的条件还可以包括相同的细胞发酵反应总体积。可比较的条件还可以包括每升反应液中相同浓度的总细胞。在一个实施方案中，条件还可以包括总的诱导时间(在测量前)相似或相同。可是，在另一个实施方案中，诱导时间可依据生物体而不同。特别地，荧光假单胞菌比大肠杆菌具有增加生长时间的能力，而并不降低蛋白质产量，从而使在荧光假单胞菌中可测得的蛋白质产量的时间点在大肠杆菌中是大部分测不到的。一个测量可比较的条件的方法是比较每一个总细胞蛋白中重组蛋白的百分比。可比较的条件不包括相同的生长培养基。可调整培养基以保证每种生物体的最佳产量。
在另一个实施方案中，本发明提供了通过在荧光假单胞菌中生产蛋白并分离生产的蛋白而生产重组哺乳动物蛋白的方法。在一个在下的实施方案中，方法包括基本上纯化蛋白。在一个实施方案中，蛋白衍生自人蛋白，或人源化的。
本发明还提供了在至少一个下面的实施方案中荧光假单胞菌的应用(ii)生产哺乳动物，包括人重组蛋白，该蛋白存在于细胞中，占总细胞蛋白的范围是1-75％(％tcp)之间，或特别地，至少大于大约5％tcp，10％tcp，至少15％tcp，至少20％tcp或更多。
(iii)生产哺乳动物，包括人重组蛋白，该蛋白是可溶的并存在于细胞质中，范围是介于1-75％tcp之间，或特别地，至少大于大约5％tcp，10％tcp，至少15％tcp，至少20％tcp或更多。
(ii i)不溶于细胞质的重组哺乳动物，包括人蛋白质的生产范围是介于1-75％tcp之间，或特别地，至少大于大约5％tcp、10％tcp、至少15％tcp、至少20％tcp或更多；(iv)溶于细胞周质的重组哺乳动物，包括人蛋白质的生产范围是介于1-75％tcp之间，或特别地，至少大于大约5％tcp、10％tcp、至少15％tcp、至少20％tcp或更多；(v)不溶于细胞周质的重组哺乳动物，包括人蛋白质的生产范围是介于1-75％tcp之间，或特别地，至少大于大约5％tcp、10％tcp、至少15％tcp、至少20％tcp或更多；(vi)当细胞以密度至少为40g/L生长时，细胞内的重组哺乳动物，包括人蛋白质的生产范围是介于1-75％tcp之间，或特别地，至少大于大约5％tcp、10％tcp、至少15％tcp、至少20％tcp或更多；(vii)重组哺乳动物，包括人蛋白质在细胞内以活性形式生产；(viii)多亚基的重组哺乳动物，包括人蛋白质以活性形式生产；(ix)生产的重组哺乳动物，包括人蛋白质而后被分离和纯化；(x)生产的重组哺乳动物，包括人蛋白质而后被复性。
在一个实施方案中，重组哺乳动物蛋白选自多亚基蛋白、血运载蛋白、酶、全长(full length)抗体、抗体片段或转录因子。
在另一个实施方案中，本发明包括(i)在基本上相应的条件下生长时，荧光假单胞菌被转化生产比相应埃希氏大肠杆菌更高水平或浓度的重组哺乳动物，包括人蛋白；(ii)荧光假单胞菌被转化在细胞内生产重组哺乳动物，包括人蛋白和肽的范围是介于1-75％tcp之间，或特别地，至少大于大约5％tcp、10％tcp、至少15％tcp、至少20％tcp或更多；(iii)荧光假单胞菌被转化在细胞内以活性形式生产重组哺乳动物，包括人蛋白；(iv)荧光假单胞菌被转化在细胞质内生产可溶的重组哺乳动物，包括人蛋白的范围是介于1-75％tcp之间，或特别地，至少大于大约5％tcp、10％tcp、至少15％tcp、至少20％tcp或更多；(v)荧光假单胞菌被转化在细胞质内生产不可溶的重组哺乳动物，包括人蛋白的范围是介于1-75％tcp之间，或特别地，至少大于大约5％tcp、10％tcp、至少15％tcp、至少20％tcp或更多；(vi)荧光假单胞菌被转化在细胞周质内生产可溶的重组哺乳动物，包括人蛋白的范围是介于1-75％tcp之间，或特别地，至少大于大约5％tcp、10％tcp、至少15％tcp、至少20％tcp或更多；(vii)荧光假单胞菌被转化在细胞周质内生产不溶的重组哺乳动物，包括人蛋白的范围是介于1-75％tcp之间，或特别地，至少大于大约5％tcp、10％tcp、至少15％tcp、至少20％tcp或更多；(viii)荧光假单胞菌被转化生产多亚基重组哺乳动物，包括人蛋白；(ix)荧光假单胞菌被转化在细胞内以活性形式生产多亚基重组哺乳动物，包括人蛋白。
在一个可替换的实施方案中，假单胞菌和与其密切相关的其他非荧光假单胞细菌在本发明中被用作宿主细胞，如以下更详细的描述。在一个实施方案中，宿主细胞通常选自假单胞菌属，特别地选自非致病性假单胞菌种。同样地，完成所需的发明目的任何荧光假单胞菌株可被应用，包括但不局限于MB101株，或被修饰成包括至少一个宿主细胞可表达的，至少一个编码Lac抑制子蛋白的lacI转基因的插入拷贝的菌株，如MB214和MB217。假单胞菌还可被可选择地基因修饰以添加或缺失一个或多个基因而用于改良性能、工艺或其他特性。
在一个实施方案中，假单胞菌生物体被编码重组哺乳动物蛋白的核苷酸转化，该重组哺乳动物蛋白选自多亚基蛋白、血运载蛋白、酶、全长抗体、抗体片段或转录因子。在一个实施方案中，荧光假单胞菌表达选自多亚基蛋白、血运载蛋白、酶、全长抗体、抗体片段或转录因子的重组哺乳动物蛋白。
被表达重组哺乳动物或人蛋白典型地具有至少大约1kD、至大约100、200、300、400、或500kD的质量，通常在大约10kD到大约100kD之间，通常大于大约30kD。


图1表明从荧光假单胞菌可溶部分样本纯化的hu-γ-IFN的图谱，显示与商售可供的标准相比的活性。
图2是表明在荧光假单胞菌和埃希氏大肠杆菌中纯化的Gal13的活性的ELISA图。
图3代表人生长激素表达构建。A中表示缺乏其天然分泌信号序列的人生长激素的氨基酸序列。B中表示在荧光假单胞菌(pDOW2400)和埃希氏大肠杆菌(412-001.hGH)中表达的质粒的构建。
图4是在荧光假单胞菌和埃希氏大肠杆菌中表达的hGH的可溶和不可溶部分的SDS-PAGE分析图。诱导后时间用I0、I24、I48、0或3表示。大箭头表示21kDa hGH蛋白的位置。
图5表示埃希氏大肠杆菌对荧光假单胞菌细胞中表达的γ-IFN的SDS-PAGE分析。采自诱导后(I0，等)0、3、24和48小时的可溶(S)和不可溶的(I)样品被溶解。表达γ-IFN的埃希氏大肠杆菌在A图中表示，表达γ-IFN的荧光假单胞菌在B图中表示。5ul的A575-20样品被加样到10％ Bis-Tris NuPAGE凝胶上，溶于1×MES。箭头表示重图蛋白的位置。蛋白印记杂交在图C(埃希氏大肠杆菌)和D(荧光假单胞菌)中表示。
图6表示在pMYC1803的SpeI和Xhol位点用BGI基因取代BuiBui毒性基因。
图7表示所有选择的转化株具有所需的干扰素插入，如通过测序插入的DNA所证实的。
图8代表磷酸结合蛋白(phosphate binding protein)-gal2单链抗体融和蛋白的核苷酸序列。
图9代表磷酸结合蛋白-gal2单链抗体融和蛋白的氨基酸序列。
图10代表磷酸结合蛋白-人生长激素融合蛋白的核苷酸序列。
图11代表磷酸结合蛋白-人生长激素融合蛋白的氨基酸序列。
具体实施例方式
生产重组哺乳动物蛋白的方法本发明提供了生产重组哺乳动物蛋白的方法和转化的生产重组哺乳动物蛋白的荧光假单胞菌。
在一个实施方案中，本发明提供了生产重组哺乳动物蛋白的方法，该方法通过在荧光假单胞菌中生产蛋白质及分离所生产的蛋白质。表达后通过本领域的公知技术分离蛋白，包括但不局限于亲和性色谱法、离子交换色谱法、抗体亲和性、大小排除法或其他任何可从蛋白中消除大部分的细胞碎片的方法。在一个下级实施方案中(sub-embodiment)，方法提供了基本上纯的蛋白。被分离的蛋白可具有与其衍生自的天然蛋白相似的活性。蛋白可以在接近天然蛋白的正确的折叠状态下或构象下被分离，或可被进一步复性或修饰成正确折叠构象。在一个下级实施方案中，蛋白质衍生自人蛋白或被人源化。“被人源化”的蛋白典型地是嵌合的哺乳动物蛋白，其部分由衍生自人的蛋白序列组成。人源化被特别地用于抗体生产，人源化抗体的发展曾被广泛的描述，例如美国专利申请No6,800,738。
在一个实施方案中，宿主细胞表达蛋白后分离蛋白。在另一个实施方案中，肽的蛋白被纯化。在一个可选择的实施方案中，蛋白分离后被纯化。可选择地被分离或纯化的蛋白可被复性或再折叠以生产活性蛋白。
在另一个实施方案中，本发明提供了在荧光假单胞菌中生产哺乳动物蛋白的方法，其中生产蛋白的水平或浓度高于埃希氏大肠杆菌中的水平或浓度。用于高水平生产哺乳动物蛋白的荧光假单胞菌的适合性是意想不到，理由是在现有技术中缺乏在这样的生物体中成功地生产这样的蛋白质的例子。本发明人发现这些生物体确实能够高水平地生产哺乳动物蛋白，典型地当在相应的分析中检测时比埃希氏大肠杆菌表达更高产量或更高水平的蛋白。在另一个实施方案中，本发明提供了在批量培养的荧光假单胞菌中生产哺乳动物蛋白的方法，其比相应的批量重组埃希氏大肠杆菌每升蛋白中生产更大量的蛋白。
在一些实施方案中，所提供的方法包括在荧光假单胞菌中以活性形式生产重组哺乳动物，包括人多亚基蛋白；在荧光假单胞菌中生产重组哺乳动物血运载蛋白，包括人血运载蛋白，如转铁蛋白和白蛋白；在荧光假单胞菌中生产重组哺乳动物酶，包括以活性形式存在的重组哺乳动物酶；在荧光假单胞菌中生产抗体和抗原片段，包括单链抗体和Fab片段；在荧光假单胞菌中生产重组哺乳动物包括人的转录因子。
在一个实施方案中，重组哺乳动物蛋白以多聚体或连接体前体形式(concatameric precursors)生产，例如，以至少两个小肽(1-15个氨基酸)单位串连的形式。在一个可替换的实施方案中，重组哺乳动物蛋白不以多聚体或连接体前体被生产，而是作为单链多肽被生产。
生物分子的筛选本发明一个独立的实施方案提供了在筛选哺乳动物生物分子文库的方法中的荧光假单胞菌，该筛选可鉴别至少一个展现所需活性或性能。可以用一些测试所需的哺乳动物衍生的核苷酸转化荧光假单胞菌，生成转化的宿主细胞文库。通过表达，至少一些核苷酸编码的多肽被生产，在细胞质或随后从细胞中回收用于测试。测试的活性或特性的例子可以包括多肽表达水平；多肽稳定性；和生物催化活性和特性。生物催化活性和特性的描述的例子包括酶活性；蛋白香相互作用/结合；蛋白稳定性；底物使用；产物形成；反应条件，如pH，盐分或反应温度；特定催化反应的生物催化参数，如Km和Vmax；稳定性，如热稳定性和生物催化的半衰期。得到的测试结果可被用于选择文库成员的进一步开发。
蛋白表达本发明的一个主要方面是在荧光假单胞菌中重组哺乳动物，例如人蛋白的高水平表达，范围介于总细胞蛋白(％tcp)的1-75％之间。被表达的蛋白在荧光假单胞菌细胞中可以是可溶或不溶的。如此高水平的可溶或不溶重组哺乳动物蛋白与先前已知的哺乳动物蛋白表达系统相比是改良的。特别是，在大规模发酵反应中高水平的回收的哺乳动物蛋白典型地在已知技术中是不可能的。
在一个实施方案中，本发明提供了超过在埃希氏大肠杆菌表达系统中的发现的哺乳动物蛋白表达水平。在一个实施方案中，每一个细胞中重组蛋白的浓度比可比较条件下埃希氏大肠杆菌中的高。在一个实施方案中，在荧光假单胞菌中测定的与总细胞蛋白相比的重组蛋白水平高于在埃希氏大肠杆菌中表达的相同的重组蛋白水平。在另一个实施方案中，在此处描述的荧光假单胞菌表达系统中的可溶蛋白的水平或数量高于在可比较的埃希氏大肠杆菌表达系统中的可溶蛋白的水平或数量。在另一个实施方案中，活性蛋白总量高于来自埃希氏大肠杆菌表达系统的量。在一个独立的实例中，在荧光假单胞菌中测定的与总细胞蛋白相比的重组活性蛋白水平高于在埃希氏大肠杆菌中表达的相同的重组蛋白水平。在一个实施方案中，在荧光假单胞菌中表达的蛋白的水平、浓度或数量至少是在可比较分析中的埃希氏大肠杆菌表达系统中的重组蛋白表达的水平、浓度或数量的2X、至少3X、至少4X、至少5X、至少6X、至少7X、至少8X、至少9X、至少10X或更高。
作为表达系统荧光假单胞菌的一个优点是细胞可在大规模的培养基上生长，而对蛋白质的生产没有负面影响。此能力胜过其他细菌系统，如埃希氏大肠杆菌中发现的。在另一个实施方案中，方法包括在批量培养中生产哺乳动物蛋白，其中荧光假单胞菌中生产的重组蛋白水平比埃希氏大肠杆菌的批量培养中生产的重组蛋白有更高的整体水平。在另一个实施方案中，本发明提供了在在批量培养的荧光假单胞菌中生产哺乳动物蛋白的方法，其比相应的埃希氏大肠杆菌的批量培养每升生产更大量的蛋白。
通常本发明提供了表达水平占总细胞蛋白(tcp)的1-75％的可溶或不可溶重组哺乳动物蛋白的方法和转化的荧光假单胞菌。在细胞中被表达的哺乳动物蛋白可以以活性形式表达。在一个实施方案中，荧光假单胞菌提供了至少1、5、10、15、20、25、30、40、50、55、60、65、70或75％tcp的重组哺乳动物蛋白。
这些蛋白可以是可溶的，当可溶时，可在生产过程中存在于细胞质或细胞周质中。通过下述方法，可溶的蛋白很容易从细胞中被释放出来，该方法包括但不局限于，用压力破坏细胞膜(即“French”压力法)，或通过溶解酶降解细胞膜。典型地细胞还可被去污剂裂解，如非离子去污剂。可溶的蛋白可进一步通过调节缓冲液成分如缓冲液pH、盐浓度或额外的蛋白质成分(例如，在多亚基复合物中)来稳定。可从其他蛋白和细胞碎片中分离或纯化可溶的蛋白，例如通过离心和/或色谱，如尺寸排阻色谱(size exclusion)，阴离子或阳离子交换，或亲和性色谱。
蛋白也可以是不溶的。不溶的蛋白典型地存在于细胞质的包涵体中，但通常也在细胞周质中。不是所有的不溶蛋白都在包涵体中，也可以存在膜聚集物，如小蛋白聚集物或以任何不溶的形式存在于细胞质或周质。不溶的蛋白可典型地通过使用例如如尿素或盐酸胍的还原剂而复性。不溶的蛋白或蛋白聚集物可被分离，例如通过离心和/或色谱如尺寸排阻色谱。不溶聚集物中的蛋白典型地可被通过使用例如Vinogradov，等(2003)Anal Biochem 15；320(2)234-8中描述的胶束或逆胶束(micelles or reverse micelles)可溶聚集物分离。
在一个特别的实施方案中，当生长(即，温度范围大约为4-55℃，包括的)在矿物盐培养基时，假单胞菌宿主细胞的重组哺乳动物肽、多肽、蛋白或其片段的表达水平至少1％tcp，细胞密度至少40g/L。在一个特别的实施方案中，当生长(即，温度范围大约为4-55℃，并包括4和55℃)在矿物盐培养基中，在至少10L的发酵规模下，表达系统的重组肽蛋白，包括重组哺乳动物蛋白的表达水平至少为5％tcp，细胞密度至少为40g/L。
可通过本领域的标准技术测定表达水平。在一个实施方案中，给定样本中蛋白的量(以克计)与以克计的总细胞蛋白的量相比较。在另一个实施方案中，测量每升中重组蛋白的水平。在另一个实施方案中，测得的水平或量可以与已知的标准如BSA对照相比较。可通过例如分析被纯化蛋白的吸光度、通过测量该蛋白的标记亲和性(如抗体亲和性)和通过与已知标准比较，或通过测量与已知标准相比较的活性水平(如已知的纯的活性蛋白的量)测量重组蛋白的水平或量。
已发现在某些情况下，当荧光假单胞菌用作表达宿主细胞时，为了恢复含二硫键的目标多肽的活性和可溶性，不需要额外的二硫键促进条件或试剂。因此，在一个实施方案中，转基因的肽、多肽、蛋白质或片段在其天然状态在下，含有至少一个分子内二硫键。在另一个实施方案中，蛋白质在其天然状态时可含有至2、4、6、8、10、12、14、16、18或20或更多二硫键。
在一些实施方案中，在生产过程中的纯化或分离前蛋白质在细胞周质中被表达或发现。通过与恰当的信号分泌序列融合，蛋白质可被分泌到细胞周质。在一个实施方案中，信号序列是荧光假单胞菌的天然信号序列。在一个特殊的实施方案中，信号序列是磷酸结合蛋白，Lys-Arg-Orn结合蛋白(LAObp或KRObp)分泌信号肽，外膜蛋白E(OpreE)分泌信号肽，铜蓝蛋白分泌信号肽，铁(III)结合蛋白(Fe(III)bp)分泌信号肽或脂蛋白B(LprB)分泌信号肽。
在一个实施方案中，重组肽、多肽、蛋白质或其片段在其活性状态下具有折叠的分子内构象。荧光假单胞菌典型地以正确的折叠构象更有效地生产哺乳动物蛋白。在一个实施方案中，超过50％的被生产的表达的转基因肽、多肽、蛋白质或其片段可作为可溶的活性形式的单肽、多肽、蛋白质或其片段被生产，或以不可溶的但在细胞质或周质中可被复性的形式被生产。在另一个实施方案中，大约可以活性形式或可被复性成活性形式得到60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％的表达的蛋白。
定义在整个说明书中，术语“蛋白质”用于包括任何氨基酸连接体(concatamers)或聚合体。术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”可被互相交换使用，其包括氨基酸聚合体，其中一个或多个氨基酸残基是相应的天然发生的氨基酸以及天然发生的氨基酸聚合体的人工的化学类似物。
术语“分离的”指，核苷酸、蛋白质或肽基本上或主要地与其他当在一个细胞中时在天然状态下通常与其在一起的物质成分分离，例如，其他细胞成分。
术语“纯的”或“基本上纯的”用来指蛋白质从其他细胞成分分离并从细胞中的不是与蛋白存在于天然复合物其他蛋白和肽分离。在一个特别的实施方案，纯的蛋白是被标准cGMP指南定义而被许可用于治疗或兽医的或被FDA许可的。
术语“总细胞蛋白百分数”(“tcp”)指宿主细胞中作为聚集物细胞蛋白的百分比的蛋白量。可替换的，术语指总细胞蛋白该组分的测量，其可代表通过细胞表达的给定蛋白质的相对量。
术语“可操纵地黏附”指任何构建，其中转录和任何翻译调节元件共价地连接到编码序列中，在相对于编码序列这样的位置连接，使得在和通过宿主细胞的活动，调节元件可指导编码序列的表达。
如此处所述的，术语“哺乳动物”指在包括人或非人的哺乳动物纲中包含的或指定的任何动物，例如，但布局限于猪、绵羊、牛、啮齿动物、有蹄类动物、猪、猪(swine)、绵羊、小羊、山羊、牛、鹿、骡、马、猴子、猿、狗、猫、大鼠和小鼠。
如此处所应用的，术语“重组哺乳动物蛋白”或肽指包括来自天然哺乳动物蛋白序列或衍生的或生产于天然哺乳动物核苷酸序列的蛋白。此种重组蛋白可从基本上对应于天然哺乳动物mRNA或基本上对应于cDNA的核苷酸或其片段生产。序列可根据本领域已知的宿主细胞密码子使用频率相应地调节。
在两个核苷酸或多肽的上下文中的词组“基本上相应的”指使用本领域已知的计算法算法，当对蛋白质结构域最大对应进行比对时，在两个序列中的残基具有至少50％、60％、70％、80％、90％或更高的同一性。可选择的用于比较的序列比对可以通过如本领域已知的计算算法实施(如，Smith & Waterman(1981)Adv.Appl.Math.2482；Needleman & Wunsch(1970)J.Mol.Biol.48443；Pearson & Lipman(1988)Proc.Nat’l.Acad.Sci.USA 852444；Altschul et al.(1990)J.Mol.Biol.215403-410(BLAST))，通过这些计算算法的电脑实施(GAP，BESTFIT，FASTA，and TFASTA in the WisconsinGenetics Software Package，Genetics Computer Group，575 ScienceDr.，Madison，Wis.)，或通过调查。用于执行BLAST分析的软件在National Center for Biotechnology Information(http//www.ncbi.nlm.nih.gov/)可公开获得。
术语“片段”指核酸、蛋白或肽序列的部分或局部序列。
如此处所应用的，术语“可溶的”指在生理条件下的缓冲液中在大约5,000-20,000x引力下离心10-30分钟蛋白质不沉淀。可溶的蛋白质不是包涵体或其他被沉淀块的一部分。
如此处所应用的，术语“不可溶的”指蛋白质在生理条件下的缓冲液中在大约5,000-20,000x离心力下离心10-30分钟蛋白质可沉淀。不可溶的蛋白质是包涵体或其他被沉淀块的一部分。
术语“包涵体”指包括在细胞内的任何细胞内小体，其中蛋白质的聚集物被隔绝。
如此处所应用的，术语“同源的”指i)具有与指定原始蛋白质的序列至少70、75、80、85、90、95或98％相似的氨基酸序列的蛋白质，其保留了原始蛋白质所需的功能或ii)具有与指定原始核苷酸的序列至少70、75、80、85、90、95或98％相似的序列的核苷酸，其保留了原始核苷酸序列所需的功能。在本发明和公开的所有实施方案中，任何公开的蛋白、肽或核酸可被保留其所需功能的同源的或基本同源的蛋白、肽或核苷酸替代。在本发明和公开的所有实施方案中，当任何核苷酸被公开时，它应当被假定本发明也包含所有与公开的核苷酸杂交的核苷酸。
在一个非限制的实施方案中，同源的多肽的非同一的氨基酸序列可以是表1所示的15个保守的或半保守的组中的任何一个氨基酸。
表1相似的氨基酸替代组群

生产的哺乳动物蛋白的类型一般而言，重组哺乳动物蛋白可以是任何哺乳动物蛋白，其氨基酸序列是已知的或任何被推定的哺乳动物或哺乳动物衍生的蛋白，其氨基酸序列是推定的。蛋白质可以选自多亚基蛋白、血运载蛋白、酶、全长抗体、抗体片段或转录因子。
蛋白质的氨基酸序列可以被改变以适应所需特性作调节，例如以确保某种相互反应类型。例如，这些序列可被调节以降低免疫反应，或增加吸收，降低分泌，或增强在生物体如哺乳动物内的生物利用度。蛋白质的氨基酸序列从而可被调节为确保某些翻译后修饰或蛋白质构象。
在一个实施方案中，哺乳动物蛋白是化学因子或细胞因子。在另一个实施方案中，哺乳动物蛋白是下列之一IL-1，IL-1a，IL-1β，IL-2，IL-3，IL-4，IL-5，IL-6，IL-7，IL-8，IL-9，IL-10，IL-11，IL-12，IL-12弹性的，IL-13，IL-15，IL-16，IL-18，IL-18BPa，IL-23，IL-24，VIP，促红细胞生产素，GM-CSF，G-CSF，M-CSF，血小板衍生生长因子(PDGF)，MSF，FLT-3配体，EGF，纤维细胞生长因子(FGF；如，aFGF(FGF-1)，bFGF(FGF-2)，FGF-3，FGF-4，FGF-5，FGF-6，orFGF-7)，类胰岛素生长因子(如，IGF-1，IGF-2)；肿瘤坏死因子(如TNF，淋巴毒素)，神经生长因子(如NGF)，血管内皮生长因子(VEGF)；干扰素(如，IFN-a，IFN-β，IFN-γ)；白血病抑制因子(LIF)；纤毛神经生长因子(CNTF)；制瘤素M；干细胞因子(SCF)；转化的生长因子(如，TGF-a，TGF-pl，TGF-pl，TGF-pl)；TNF超家族(如，LIGHT/TNFSF14，STALL-1/TNFSF13B(BLy5，BAFF，THANK)，TNF α/TNFSF2和TWEAK/TNFSF12)；或化学因子(BCA-1/BLC-1，BRAK/Kec，CXCL16，CXCR3，ENA-78/LIX，Eotaxin-1，Eotaxin-2/MPIF-2，Exodus-2/SLC，Fractalkine/Neurotactin，GROalpha/MGSA，HCC-1，I-TAC，Lymphotactin/ATAC/SCM，MCP-1/MCAF，MCP-3，MCP-4，MDC/STCP-1/ABCD-1，MIP-1a，MIP-1β，MIP-2a/GRO β，MIP-3a/Exodus/LARC，MIP-3a/Exodus-3/ELC，MIP-4/PARC/DC-CK1，PF-4，RANTES，SDFla，TARC，or TECK)。
可替换的，蛋白质可以不是化学因子或细胞因子。在另一个实施方案中，哺乳动物蛋白可以不是下列蛋白之一IL-1，IL-1a，IL-1β，IL-2，IL-3，IL-4，IL-5，IL-6，IL-7，IL-8，IL-9，IL-10，IL-11，IL-12，IL-12弹性的，IL-13，IL-15，IL-16，IL-18，IL-18BPa，IL-23，IL-24，VIP，促红细胞生产素，GM-CSF，G-CSF，M-CSF，血小板衍生的生长因子(PDGF)，MSF，FLT-3配体，EGF，纤维细胞生长因子(FGF；如，aFGF(FGF-1)，bFGF(FGF-2)，FGF-3，FGF-4，FGF-5，FGF-6，orFGF-7)，类胰岛素生长因子(如，IGF-1，IGF-2)；肿瘤坏死因子(如，TNF，淋巴毒素)，神经生长因子(如，NGF)，血管上皮生长因子(VEGF)；干扰素(如，IFN-a，IF’N-β，IFN-y)；白血病抑制因子(LIF)；纤毛神经生长因子(CNTF)；制瘤素M；干细胞因子(SCF)；转化的生长因子(如，TGF-a，TGF-β，TGF-β，TGF-β)；TNF超家族(如LIGHT/TNFSF14，STALL-l/TNFSF13B (BLy5，BAFF，THANK)，TNF α/TNFSF2和TWEAK/TNFSF12)；或化学因子(BCA-1/BLC-1，BRAK/Kec，CXCL16，CXCR3，ENA-78/LIX，Eotaxin-1，Eotaxin-2/MPIF-2，Exodus-2/SLC，Fractalkine/Neurotactin，GROalpha/MGSA，HCC-1，I-TAC，Lymphotactin/ATAC/SCM，MCP-1/MCAF，MCP-3，MCP-4，MDC/STCP-1/ABCD-1，MIP-1α，MIP-1β，MIP-2a/GRO β，MIP-3a/Exodus/LARC，MIP-3a/Exodus-3/ELC，MIP-4/PARC/DC-CK1，PF-4，RANTES，SDFla，TARC，或TECK)。在一个实施方案中，蛋白不是猪的蛋白，特别不是猪生长因子。
在本公开的另一个实施方案中，重组哺乳动物蛋白，他们的片段或其他衍生物或其类似物可以是抗体。这些抗体可以是，例如，多克隆或单克隆抗体。本发明的一个方面还包括嵌合体、单链和人源化的抗体，以及Fab片段或Fab表达文库的产物。
多亚基文库的生产在本发明的一个实施方案中，重组哺乳动物多亚基蛋白的产物通过假单胞菌种的宿主细胞提供。在另一个实施方案中，假单胞菌种宿主细胞被提供，其被转化表达重组哺乳动物多亚基蛋白。在一个实施方案中，多亚基蛋白，包括重组哺乳动物或人蛋白，在假单胞菌宿主细胞中表达。在一个实施方案中，通过宿主细胞表达的多亚基蛋白质随后被进行多亚基蛋白的分离。在另一个实施方案中，肽的多亚基蛋白被纯化。在纯化或分离前蛋白可被细胞组装，或在分离或纯化中或后进一步组装蛋白。可选择地，蛋白或其部分可被复性或折叠以生产活性蛋白。
各种载体或表达系统的任何一个可被用于在宿主细胞中表达多亚基蛋白。多亚基可位于单个载体上，可选择地被可操作地连接到不同的启动子，可选择地在多顺反子的序列中。每一个亚单位可以在不同的载体上。可以使用多个载体。每一个亚单位可在一个或多个选择标记的控制下。调节元件可被包含于载体上，包括周质分泌信号序列，内部核糖体进入位点，激活子序列，启动子和终止信号。
在一个实施方案中，多亚基蛋白在假单胞菌中表达，其使用如陶氏环球技术公司在2004年11月19日提交的美国申请10/994,138中描述的具有营养缺陷型选择标记的表达系统，其中，对每一个编码亚单位的核苷酸的控制是在营养缺陷型选择标记的控制下的。可被表达的多亚基蛋白质包括同数的和异数的蛋白质。多亚基蛋白质可以包括两个或多个亚单位，可以相同或不同。例如，蛋白质可以是包括2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或更多亚基的同数蛋白。蛋白质也可以是包括2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或更多亚基的异数蛋白。
多亚基哺乳动物蛋白的例子包括包括离子通道受体的受体；信号蛋白，如激酶，GTPases，ATPases；跨膜蛋白；包括软骨素的细胞外基质蛋白(extracellular matrix)；胶原质；包括MHC蛋白，全长抗体和抗体片段的免疫调节子；包括RNA聚合酶和DNA聚合酶的酶；以及膜蛋白。
血蛋白的生产在本发明的一个实施方案中，提供了重组哺乳动物血蛋白的生产。在一个实施方案中，宿主细胞的血蛋白表达后被分离。在另一个实施方案中，血蛋白被纯化。在另一个实施方案中，血蛋白被分离后，被纯化。可选择地，蛋白可被复性或折叠以生产活性蛋白。通常的，通过用编码血蛋白的核苷酸构建转化恰当的宿主细胞生产本发明的重组哺乳血蛋白，如荧光假单胞菌宿主细胞，在适合表达条件下培养被转化的宿主细胞，可选择的，分离，或分离并纯化细胞表达的重组血动物蛋白。
在另一个实施方案中，本发明提供了假单胞菌种宿主细胞，其被含有恰当的基因和用于表达感兴趣的血蛋白的调节元件的载体转化以表达重组哺乳动物血蛋白。
能够表达的血蛋白可以包括但不局限于运载蛋白，如白蛋白，包括人白蛋白(Seq ID NO.1，表2)和牛白蛋白；转铁蛋白，包括人转铁蛋白(Seq ID No.2，表2)，牛转铁蛋白，大鼠转铁蛋白，重组转铁蛋白，重组转铁蛋白半分子，具有改变的特性的重组转铁蛋白半分子；触珠蛋白；纤维蛋白原和其他凝血因子；补体成分；免疫球蛋白；酶抑制剂；底物前体，如血管紧张素和缓激肽；胰岛素；内皮素(endothelin)；球蛋白包括α、β和γ球蛋白；其他类型的主要在哺乳动物血液中发现的蛋白、肽及其片段。这些血蛋白的氨基酸序列已被报道(见S.S.Baldwin(1993)Comp.Biochem Physiol.106b203-218)，包括人血清白蛋白的氨基酸序列(Lawn，L.M.，et al.(1981)NucleicAcids Research 922；pp 6103-6114)和人血清转铁蛋白(Yang，F.el al.(1984)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81；pp.2752-2756)。
在一个特别的实施方案中，提供了在荧光假单胞菌中生产白蛋白，包括用含有用于表达白蛋白的核苷酸序列和调节元件的表达载体转化荧光假单胞菌宿主细胞，在适合白蛋白表达的条件下培养宿主细胞，回收荧光假单胞菌表达的白蛋白。根据本实施方案，表达的白蛋白选自人白蛋白、牛白蛋白、兔子白蛋白、鸡白蛋白、大鼠白蛋白和小鼠白蛋白。在另一个实施方案中，白蛋白与治疗活性的多肽融合，该多肽可以是哺乳动物或非哺乳动物来源。
在进一步的特别的实施方案中，提供了在荧光假单胞菌中生产转铁蛋白，包括用含有用于表达转铁蛋白的核苷酸序列和调节元件的表达载体转化荧光假单胞菌宿主细胞，在适合转铁蛋白表达的条件下培养宿主细胞。在另一个实施方案中，转铁蛋白被表达后，在一个实施方案中，分离蛋白。在进一步的实施方案中，分离后可纯化转铁蛋白。被表达的转铁蛋白选自人血清转铁蛋白，糖基化的人转铁蛋白，非糖基化的人转铁蛋白，人转铁蛋白的N端半分子，牛转铁蛋白，大鼠转铁蛋白，小鼠转铁蛋白，猿转铁蛋白，重组转铁蛋白，重组转铁蛋白半分子，具有改变特性的重组转铁蛋白半分子，转铁蛋白多聚核苷酸，由转铁蛋白多聚核苷酸编码的转铁蛋白多肽，转铁蛋白抗体，转铁蛋白片段，和融合至治疗活性多肽的转铁蛋白。
在另一个特定的实施方案中，提供了在荧光假单胞菌中生产球蛋白，包括用含有用于表达球蛋白的核苷酸序列和调节元件的表达载体转化荧光假单胞菌宿主细胞，在适合球蛋白表达的条件下培养宿主细胞，可选择地分离蛋白。在进一步的实施方案中，表达后，从宿主细胞中分离和纯化球蛋白。被表达的球蛋白选自人球蛋白，牛球蛋白，兔子球蛋白，大鼠球蛋白，小鼠球蛋白，羊球蛋白，猴子球蛋白，胆固醇结合球蛋白，和融合至治疗活性多肽的球蛋白。
在进一步的实施方案中，提供了在荧光假单胞菌中生产胰岛素，包括用含有用于表达胰岛素的核苷酸序列和调节元件的表达载体转化荧光假单胞菌宿主细胞，在适合胰岛素表达的条件下培养宿主细胞。在一个进一步的实施方案中，宿主细胞生产胰岛素后可分离和纯化胰岛素。表达的胰岛素选自人胰岛素，牛胰岛素，小鼠胰岛素，大鼠胰岛素，猪胰岛素，猴子胰岛素，和融合至治疗活性多肽的胰岛素。人胰岛素基因的登陆号是J00265，合成的人胰岛素基因的登陆号是J02547。
用于生产重组血蛋白的全长DNA或编码血蛋白或其部分的氨基端或羧基端的截断DNA可以从已知来源或通过标准方法根据已知序列合成。
表2本发明的表达系统表达血蛋白的序列



酶的生产在本发明的一个实施方案中，提供了在荧光假单胞菌种宿主细胞中生产重组哺乳动物酶或联合因子。在另一个实施方案中，提供了被转化的表达重组哺乳动物酶或联合因子的假单胞菌株宿主细胞。
本实施方案中被表达的酶和联合因子包括但不局限于醛缩酶，胺氧化酶，氨基酸氧化酶，天冬氨酸酶，B12依赖的酶，羧肽酶，羧酯酶(carboxyesterases)，羧裂解酶(carboxylyases)，胰凝乳蛋白酶(chemotrypsin)，需要CoA的酶，氰醇合成酶，胱氨酸合成酶(cystathione synthases)，脱羧酶，脱氢酶，乙醇脱氢酶，脱水酶，心肌黄梅，加双氧酶，enoate还原酶，环氧化物水化酶，fumerases，半乳糖氧化酶，葡萄糖异构酶，葡萄糖氧化酶，糖基转化酶(glycosyltrasferases)，转甲基酶，腈水化酶，核苷磷酸化酶，氧化还原酶，oxynitilases，肽酶，糖基转化酶，过氧化物酶，以及融合至治疗活性多肽的酶。
在另一个实施方案中，酶可以是嗜温酶多肽，例如是人和/或兽医治疗和/或诊断用所需的酶。此种治疗的嗜温酶包括，如组织血浆酶原激活剂；尿激酶，reptilase，链激酶；过氧化物酶，过氧化物歧化酶；DNAse，氨基酸水解酶(如，天冬酰胺酶，氨基水解酶)；羧基肽酶；蛋白酶；胰蛋白酶，胃蛋白酶，糜蛋白酶，木瓜蛋白酶，菠罗蛋白酶，胶原蛋白酶；唾液酸苷酶；乳糖分解酶；麦芽糖酶，蔗糖酶和树胶醛呋喃配糖酶(arabinofuranosidases)。
另一个实施方案提供了在荧光假单胞菌中生产重组酶替代，其通过用含有用于表达重组酶替代的核苷酸序列和调节元件的表达载体转化荧光假单胞菌宿主细胞，在适合重组酶替代表达的条件下培养宿主细胞。在宿主细胞中表达的重组酶替代选自半乳糖苷酶β，laronidase和融合至治疗活性多肽的重组酶替代。
哺乳动物抗体和抗体片段的生产在本发明的一个实施方案中，提供了在荧光假单胞菌株的宿主细胞中生产重组哺乳动物单链，Fab片段和/或全长抗体或片段或其部分。在一个实施方案中，蛋白表达后，分离并可选择地纯化蛋白。可选择地，蛋白可被复性以生产活性蛋白。抗体或抗体片段可选择地被连接到生产过程中用于瞄准细胞的分泌信号序列。
在另一个实施方案中，提供了假单胞菌株的宿主细胞，其被转化以表达重组哺乳动物单链，Fab片段和/或全长抗体或片段或其部分。
在一个实施方案中，荧光假单胞菌细胞可以生产单链抗体或其片段或部分。单链抗体可包括在单个稳定折叠的多肽上的抗体的抗原结合区域。单链抗体比传统的免疫球蛋白小，但是保留了抗体的抗原特异性结合特性。单链抗体可被用于治疗，如“裸”单链抗体，双特异的抗体结合，放射结合剂或与有效结构域的融合，如肿瘤图像或体内或活体外的肿瘤标记分析的诊断学，研究工具，如蛋白纯化和检测，包括新的治疗靶子的鉴别和定性，抗体微阵列，展示技术和/或基因或药物传送的媒介物。
在另一个实施方案中，荧光假单胞菌细胞生产Fab片段或其部分。Fab片段可以是特定抗体的一片。Fab片段可以保留抗原结合位点。Fab片段可以含有两个链一个轻链和一个重链片段。这些片段可通过连接子或二硫键连接。
在本发明的另一个实施方案中，可在荧光假单胞菌和其他假单胞菌株中表达全长抗体。含有Fc区的完整的抗体可以对体内的降解和清除更具抗性，因此在循环中具有更长的半衰期。这些抗体可被用作需要持续治疗的疾病的治疗剂。
在一个实施方案中，提供了在假单胞菌株中生产功能的抗体或其片段，通过提供一个含有独立的顺反子或多顺反子序列的表达载体。独立的顺反子表达载体可以含有用于表达免疫球蛋白轻链的第一启动子顺反子对和用于表达免疫球蛋白重链的第二启动子顺反子对，从而使得轻链和重链的表达独立地分别被不同的启动子调节。表达盒多聚核苷酸中的每一个顺反子可以包括可操纵地连接到编码全长抗体的轻链或重链的核苷酸序列的翻译启动区(TIR)。在一个实施方案中，TIR序列可被操作以为轻链和重链提供不同翻译强度的组合。在一个可替换的实施方案中，重链编码序列可以如轻链编码序列位于相同的质粒上。在一个可替换的实施方案中，重链和轻链序列可位于同一质粒的多顺反子序列，或被编码到宿主基因组。
在另一个实施方案中，提供了一种在宿主细胞中生产功能抗体或其片段的方法，该宿主细胞被分别编码抗体重链和轻链的两个独立的翻译单位转化。在一个实施方案中，该方法包括a)在合适的条件下培养宿主细胞，以使得轻链和重链有续的表达，从而暂时分开轻链和重链产物；b)允许轻链和重链组装以形成功能抗体或其片段。
在进一步的实施方案中，假单胞菌表达系统可以表达人治疗的单链，Fab片段或全长抗体或其部分，包括但不局限于Fab，Fab’，F(ab’)2，F(ab’)2-亮氨酸拉链，Fv，dsFv，抗-CD18抗体，嵌合的抗体，人抗体，人源化的抗体，或以下表3描述的那些。
表3抗体及抗体片段





转录因子的生产在本发明的一个实施方案中，提供了在荧光假单胞菌株宿主细胞中生产重组哺乳动物转录因子。在一个实施方案中，蛋白表达后，可被分离。在另一个实施方案中，蛋白可被纯化。可选择的，蛋白可被复性以生产活性蛋白。在另一个实施方案中，提供了一种荧光假单胞菌株宿主细胞，其被转化以表达重组哺乳动物转录因子。
适合于插入本发明的表达系统的转录因子包括那些螺旋旋转螺旋家族和Pac家族成员，以及本领域中已知的其他转录因子家族。适合本发明应用的这些家家族的成员包括哺乳动物和哺乳动物同源的和类似物转录调节子、ASNC家家族的转录因子，如ASNC_trans_reg，被推定的转录调节因子，luxR家家族的细菌调节蛋白；细菌调节的螺旋旋转螺旋转录因子；arsR家家族的细菌调节蛋白；螺旋旋转螺旋的转录因子，特别是rpiR家家族；细菌调节蛋白转录因子，细菌调节的螺旋旋转螺旋转录因子；DNA结合区转录因子；转录因子的MarR家家族；转录因子的ROK家家族；调节蛋白的MerR家家族；精氨酸抑制子转录因子；firmicute转录因子；铁摄取调节转录因子；sigma转录因子；反应调节接受转录因子；色氨酸RNA结合衰减子蛋白转录因子；推定的糖结合结构域转录因子；PRD结构域转录因子；氮调节蛋白转录因子；遗传能力的负调节，如MecA；负转录调节子转录调节因子；细菌转录调节子转录因子；甘油-3-磷酸反应转录因子；铁依赖的抑制子的转录因子；多种种属特异的转录调节子转录因子。
假单胞菌株表达的转录因子可被用于诊断、治疗或研究应用。
载体的制备多聚核苷酸重组哺乳动物蛋白和肽可从多聚核苷酸表达，其中靶肽编码序列被可操纵地连接到转录和翻译调节元件，以形成功能基因，宿主细胞从其表达蛋白。如果可能，编码序列可以是靶多肽的天然编码序列，但也可以是被选择的，改良的或最佳的用于在选择的表达宿主细胞中的编码序列例如，通过合成基因以反映假单胞菌种，如荧光假单胞菌的密码子使用偏好。所得的基因在一个或多个载体内被构建或将被插入载体，然后被转化到表达宿主细胞。所说的核苷酸或多核苷酸以表达形式被提供指的是含有至少一个基因的核苷酸或多核苷酸可以在被选择表达宿主细胞中表达。
调节元件此处所用的调节元件可以被可操纵地连接到靶重组哺乳动物蛋白编码基因。此处所用的蛋白编码基因的编码序列除了成熟多肽编码序列和转录调节元件外，可以含有近一步的编码成分，如，多肽标记、前肽(pre-peptide)、前肽(pro-peptide)、前前肽或本领域中其他常用的已知的编码成分的一个或多个编码序列，排除在选定的表达宿主细胞中的分泌信号肽功能。
此处所用的术语“可操纵地连接”指的是任何构建，其中转录和任何翻译调节元件被共价键地连接到编码序列，在相对于编码序列的位置，使得调节元件可以指导编码序列的表达。在一个实施方案中，调节元件在转化到宿主细胞前是整个基因的部分；可是，在其他实施方案中，调解成分是其他基因的部分，其可以是宿主基因组的部分或可以是其他生物体基因组的部分，或可以从其衍生而来。
启动子和辅助(accessory)成分根据本发明所使用的启动子可以是组成型启动子或调节启动子。有用的调节启动子的常用的例子包括衍生自lac启动子的家家族的那些(即，lacZ启动子)，特别地，Deboer的美国专利No.4,551,433描述的tac和trc启动子，以及Ptac16、Ptac17、PtacII、PlacUV5和T7lac启动子。
用于本发明的表达系统中的非-lac型启动子的常用例子包括，例如，那些表4所列出的。
表4非-lac启动子的例子

见，例如J.Sanchez-Romero & V.De Lorenzo(1999)Manual ofIndustrial Microbiology and Biotechnology(A.Demain & J.Davies，eds.)pp.460-74(ASM Press，Washington，D.C.)；H.Schweizer(2001)Current Opinion in Biotechnology 12439-445；and R.Slater & R.Williams(2000)Molecular Biology and Biotechnology(J.Walker & R.Rapley，eds.)pp.125-54。具有选定的细菌宿主细胞天然启动子核酸序列的启动子也可以被用于控制编码靶多肽的转基因表达，如假单胞菌氨基苯甲酸盐或安息香酸盐操纵子启动子(Pant，Pben)。串连启动子可以被应用，其中超过一个启动子可以被共价连接到另一个或者相同或不同序列的启动子，如Pant-Pben串连启动子(启动子间杂交(interpromoter hybrid))或Plac-Plac串连启动子。
调节的启动子利用启动子调节蛋白，为了控制其启动子是部分的基因转录。当此处的调节启动子被应用时，相应的启动子调节蛋白也可以是根据本发明的表达系统的一部分。启动子调节蛋白的例子包括激活子蛋白，如埃希式大肠杆菌代谢产物激活蛋白，MalT蛋白；AraC家家族转录激活子；抑制蛋白，如埃希式大肠杆菌LacI蛋白；和双功能调节蛋白，如埃希式大肠杆菌NagC蛋白。许多调节的启动子/启动子调节蛋白对是本领域已知的。
启动子调节蛋白与效应子(effector)化合物相互作用，即，可逆或不可逆地与调节蛋白相连的化合物，从而使蛋白或能释放或结合至少一个在启动子控制下的基因的DNA转录调节区域，从而允许或阻止起始基因转录中的转录酶的作用。效应子化合物可被分类为诱导子或共抑制子，这些化合物包括天然效应子化合物和安慰诱导的化合物。许多调节的启动子/启动子调节蛋白/效应子化合物三联体(trios)是本领域公知的。尽管有效化合物可在细胞培养或发酵的全程使用，在一个实施方案中，其中使用调节启动子，生长所需数量或密度的宿主细胞生物量后，向培养基中加入恰当的有效化合物，从而使得直接或间接地导致所需靶基因的表达。
通过例子，其中使用了lac家族的启动子，lacI基因也可以出现在系统中。lacI基因，其(通常)是组成型的表达基因，编码Lac抑制蛋白(LacI蛋白)，该蛋白连接到这些启动子的lac操纵基因上。因此，当使用lac家家族启动子时，lacI基因也可以被包括和表达在表达系统中。在lac启动子家族成员的情况下，如，tac启动子，效应子化合物是诱导子，如安慰诱导子如IPTG(异丙基-β-D-1-硫代半乳糖苷，也称异丙基硫代半乳糖苷)。
其他成分其他调节元件也可以包括在表达构建中。这些成分包括但不局限于例如，转录增强子序列，翻译增强子序列，其他启动子，激活子，翻译起始或终止信号，转录终止子，顺反子调节子，多顺反子调节子，标记序列，如核苷酸序列“标记”和“标记”肽编码序列，其有助于鉴别，分离，纯化，或分离表达的多肽。
最小的，根据本发明的蛋白编码基因可以包括，除哺乳动物蛋白编码序列外，以下的可操纵地连接于其的调节元件启动子，核糖体结合位点(RBS)，转录终止子，翻译起始和终止信号。有用的RBS可以从表达系统中作为宿主细胞的任何株获得，如从选定的宿主细胞获得。知道许多特定的和保守的RBS，如那些在D.Frishman et al.(1999)Gene 234(2)257-65；and B.E.Suzek et al.(2001)Bioinformatics17(12)1123-30种描述的。另外，可以使用天然或合成的RBS，如，那些在EP 0207459(synthetic RBSs)；O.Ikehata et al.(1989)Eur.J.Biochem.181(3)563-70(native RBS sequenceof AAGGAAG)中描述的。本发明中使用的方法，载体和翻译和转录成分和其他成分的例子在Gilroy等的美国专利Nos.5,055,294和5,128,130；Rammler等的5,281,532；Barnes等的4,695,455和4,861,595；Gray等的4,755,465；和Wilcox的5,169,760中描述。
载体通过假单胞菌的本发明的DNA编码酶的转录通过向载体或质粒插入增强子序列而被增强。典型的增强子是DNA顺式作用元件，通常大小约为10-300bp，作用于启动子以增强其转录。例子包括多种假单胞菌增强子，如本文其他处所描述的。
一般地，重组表达载体将包括复制原点和允许假单胞菌宿主细胞转化的选择性标记，如荧光假单胞菌的非抗生素抗性基因，和从高表达基因衍生来的启动子以指导下游结构序列的转录。此种启动子可衍生自编码酶的操纵子，该酶如3-磷酸甘油酯激酶(PGK)，酸性磷酸酶，或热休克蛋白，及其它。异源结构序列可以与起始和终止序列以正确的方式比对，在一个实施方案中，能够指导翻译酶分泌的指导序列。可选择地，异源序列可以编码融合酶包括给予所需特性的N端识别肽，如表达的重组产物的稳定或简单的纯化。
在表达酶中与荧光假单胞菌使用的有用的表达载体通过插入编码所需蛋白的结构DNA序列被构建，该DNA序列与适合翻译起始和终止信号一起编码所需蛋白质，该翻译起始和终止信号位于具有功能的启动子的可操纵的开框区。载体将包含一个或多个表型可选择的标记和复制起始，以确保载体的维持和如果需要，在宿主中提供扩增。
作为宿主细胞中表达重组蛋白的载体是本领域中已知的，其中任何一个可被用于表达根据本发明的基因。此种载体包括，例如质粒、粘粒和噬菌体表达系统。有用的质粒载体的例子包括但不局限于表达质粒pBBRlMCS，pDSK519，pKT240，pML122，pPSlO，RK2，RK6，pRO1600，和RSF1010。此种有用的载体的其他的例子包括那些在如N.Hayase(1994)Appl.Envir.Microbiol.60(9)3336-42；A.A.Lushnikovet al.(1985)Basic Life Sci.30657-62；S.Graupner & W.Wackernagel(2000)Biomolec.Eng.17(1)11-16.；H.P.Schweizer(2001)Curr.Opin.Biotech.12(5)439-45；M.Bagdasarian & K.N.Timmis(1982)Curr.TopicsMicrobiol.Immunol.9647-67；T.Ishii等(1994)FEMS Microbiol.Lett.116(3)307-13；I.N.Olekhnovich & Y.K.Fomichev(1994)Gene 140(1)63-65；M.Tsuda & T.Nakazawa(1993)Gene 136(1-2)257-62；C.Nieto etal.(1990)Gene 87(1)145-49；J.D.Jones & N.Gutterson(1987)Gene61(3)299-306；M.Bagdasarian等(1981)Gene 16(1-3)237-47；H.P.Schweizer等(2001)Genet.Eng.(NY)2369-81；P.Mukhopadhyay等(1990)J.Bact.172(1)477-80；D.O.Wood等(1981)J.Bact.145(3)1448-51；and R.Holtwick等(2001)Microbiology 147(Pt 2)337-44中描述的。
可用于假单胞菌宿主细胞中的表达载体的进一步的例子包括那些在表5种列出的衍生自显示复制子的载体。
表5有用的表达载体的一些例子

表达质粒，RSF1010在F.Heffron等(1975)Proc.Nat’l Acad.Sci.UNA 72(9)3623-27，和K.Nagahari & K.Sakaguchi(1978)J.Bact.133(3)1527-29中被描述。质粒RSF1010及其衍生物是本发明中特别有用的载体。例如，本领域已知的RSF1010有用的衍生物包括如pKT212，pKT214，pKT231和相关的质粒，以及pMYC1050和相关的质粒(见如Thompson等的美国专利5,527,883和5,840,554)，如pMYC1803。质粒pMYC1803衍生自RSF1010为基础的质粒pTJS260(见Wilcox的美国专利5,169,760)，其采用了调节的四环素抗性标记和来自RSF1010质粒的复制和活动位点。其他有用载体的例子包括那些在Puhler等的美国专利4,680,264中描述的。
在一个实施方案中，表达质粒被用作表达载体。在另一个实施方案中，RSF1010或其衍生物被用作表达载体。在另一个实施方案中，pMYC1050或其衍生物，或pMYC1803或其衍生物被用作表达载体。
通过使用存在于质粒上的选择标记基因，质粒可被保持在宿主细胞中。其可是抗生素抗性基因，其中将相应的抗生素加入到发酵培养基上，或任何其他的已知的用于本领域中的选择标记，如原养型(prototrophy-restoring)恢复基因，其中质粒用于宿主细胞中的是相应性状的营养缺陷型，如生物催化特性如氨基酸生物合成或核苷生物合成特性或碳源利用特性。
分子遗传学和基因操纵技术中所需的广泛的序列信息是公众可获得的。完整的哺乳动物核苷酸序列，以及人基因，cDNA序列，氨基酸序列和基因组可从GenBank中获得，网址URL http//www.ncbi.nlm.nih.gov/Entrez。另外的信息也可以从GeneCard，一个关于基因及其产物和生物医疗应用完整信息的电子百科全书，其来源于WeizmannInstitute of Science Genome and Bioinformatics(http//bioinformatics.weizmann.ac.il/cards/)，核苷酸序列信息也可以从EMBL Nucleotide Sequence Database(http//www.ebi.ac.uk/embl/)或the DNA Databank或Japan(DDBJ，http//www.ddbj.nig.acjp/获得；其他的氨基酸序列信息的网址其它包括Georgetown’s蛋白信息来源网址(http//www-nbrf.georgetown.edu/pir/)和Swiss-Prot(http//au.expasy.org/sprot/sprot-top.html)。
转化用载体向假单胞菌宿主细胞的转化可以使用本领域中已知的任何转化方法，细菌宿主细胞可以作为完整的细胞或原生质被转化(即，包括细胞质)。转化方法的例子包括穿孔方法，如电穿孔，原生质融合，细菌整合和二价离子处理如氯化钙处理或CaCl/Mg2+处理，或其他的本领域公知的方法。见，如Morrison(1977)J.Bact.132349-351；Clark-Curtiss & Curtiss(1983)Methods in Enzymology 101347-362，Sambrook et al.(1989)Molecular Cloning，A LaboratoryManual(2nd ed.)；Kriegler(1990)Gene Transfer and ExpressionA Laboratory Manual；和Ausubel et al.，eds.(1994)CurrentProtocols in Molecular Biology。
假单胞菌生物体尽管此处本发明主要使用荧光假单胞菌，其他的假单胞菌和密切相关的细菌生物体也可以被使用。假单胞菌和密切相关的细菌通常是被定义为“革兰氏(-)变形菌纲亚群1”或“革兰氏阴性好氧杆菌和球菌”(Buchanan和Gibbons(eds.)(1974)Bergey’sManual ofDetennifaative Bacteriology，pp.217-289)的部分。
表6“革兰氏阴性好氧杆菌和球菌”(Bergey(1974))


“革兰氏(-)变形菌纲亚群1”也可以包括根据本分类中的标准被分类到此标题处的变形菌纲。标题还可以包括先前但不不在分类到此类的组群，如噬酸菌属(Acidovorax)，短波单胞菌属(Brevundimonas)，伯克氏菌属(Burkholderia)，噬氢菌属(Hydrogenophaga)，海洋假单胞菌属(Oceanimonas)，劳尔氏菌属(Ralstonia)，和寡养单胞菌属(Stenotrophomonas)，鞘氨醇单胞菌(Sphingomonas)属(和芽生单胞菌(Blastomonas)属，源自它们的)是由于重新分组生物体产生的属于(和先前所称作的种)黄单胞菌(Xanthomonas)属的重组生物体产生，酸单胞菌(Acidomonas)属是由于重新分组生物体产生的属于(和先前所称作的种)醋菌(Acetobacter)属如Bergey(1974)所定义的醋酸杆菌种的重组生物体产生。另外宿主细胞可以包括来自Pseudomonas enalia(ATCC 14393)，生黑假单胞菌(Pseudomonas nigrifaciens)(ATCC 19375)，和腐败假单胞菌(Pseudomonas putrefaciens)(ATCC 8071)曾经被分别重新分类为假交替单胞菌(Alteromonas haloplanktis)，生黑交替单胞菌(Alteromonasnigrifaciens)，和腐败交替单胞菌(Alteromonas putrefaciens)。相似地，例如，噬酸假单胞菌(Pseudomonas acidovorans)(ATCC 15668)和睾丸酮假单胞菌(Pseudomonas testosteroni)(ATCC 11996)曾经被分别重新分类为丛毛酸单胞菌(Comanonas acidovorans)和睾丸酮丛毛单胞菌(Comamonas testosteroni)；以及生黑假单胞菌(Pseudomonasnigrifaciens)(ATCC 19375)和杀鱼假单胞菌(Pseudomonas piscicida)(ATCC 15057)曾经被分别重新分类为生黑交替假单胞菌(Pseudoalteromonas nigrifaciens)和杀鱼交替假单胞菌(Pseudoalteromonas piscicida)。“革兰氏(-)变形杆菌纲亚群1”还包括分类为属于任意的科的变形杆菌(Proteobacteria)，假单胞菌(Pseudomonadaceae)，固氮菌科(Azotobacteraceae)(目前通常称为同义的，假单胞菌(Pseudomonadaceae)的“固氮菌群”)，根瘤菌科(Rhizobiaceae)，和甲基单胞菌科(Methylomonadaceae)(目前通常称为同义的，“甲基球菌科(Methylococcaceae)”)。因此，除了这里所提到的那些属，进一步变形杆菌属落入“革兰氏(-)变形杆菌纲亚群1”中的包括1)固氮菌群细菌中的固氮根瘤菌(Azorhizophilus)属；2)假单胞菌科的纤维弧菌属(Cellvibrio)，Oligella和Teredinibacter属的细菌；3)根瘤菌科的Chelatobacter属，剑菌属(Ensifer)，Liberibacter属(也称为″Candidatus Liberibacter″)，和中华根瘤菌属(Sinorhizobium)的细菌；和4)甲基球菌科的甲基杆菌属(Methylobacter)，甲基暖菌属(Methylocaldum)，甲基微菌属(Methylomicrobium)，甲基八叠球菌属(Methylosarcina)和甲基球形菌属(Methylosphaera)属的细菌。另一个实施方案中，宿主细胞选自“革兰氏(-)变形杆菌纲亚群2”。“革兰氏(-)变形杆菌纲亚群2”被定义成下面的属的变形杆菌群(group)(这里在括号中给出了保藏的菌株的目录号的总数，公众可以获得的，除非另外说明，都保藏在ATCC)酸单胞菌(Acidomonas)(2)；醋菌(Acetobacter)(93)；葡糖杆菌(Gluconobacter)(37)；短波单胞菌(Brevundimonas)(23)；拜叶林克氏菌(Beijerinckia)(13)；德克斯氏菌(Derxia)(2)；布鲁氏菌(Brucella)(4)；土壤杆菌(Agrobacterium)(79)；Chelatobacter(2)；剑菌属(Ensifer)(3)；根瘤菌(Rhizobium)(144)；中华根瘤菌(Sinorhizobium)(24)；芽生单胞菌(Blastomonas)(1)；鞘氨醇单胞菌(Sphingomonas)(27)；产碱菌(Alcaligenes)(88)；博德特氏菌(Bordetella)(43)；伯克氏菌(Burkholderia)(73)；劳尔氏菌(Ralstonia)(33)；噬酸菌(Acidovorax)(20)；噬氢菌(Hydrogenophaga)(9)；动胶菌(Zoogloea)(9)；甲基杆菌属(Methylobacter)(2)；甲基暖菌属(Methylocaldum)(1在NCIMB)；甲基球菌属(Methylococcus)(2)；甲基微菌属(Methylomicrobium)(2)；甲基单胞菌属(Methylomonas)(9)；甲基八叠球菌属(Methylosarcina)(1)；甲基球形菌属(Methylosphaera)；氮单胞菌(Azomonas)(9)；固氮根瘤菌(Azorhizophilus)(5)；固氮菌(Azotobacter)(64)；纤维弧菌(Cellvibrio)(3)；Oligella(5)；假单胞杆菌(Pseudomonas)(1139)；弗兰西氏菌属(Francisella)(4)；黄单胞菌(Xanthomonas)(229)；寡养单胞菌(Stenotrophomonas)(50)；和海洋假单胞菌(Oceanimonas)(4)。
“革兰氏(-)变形杆菌纲亚群2”中的典型的宿主细胞种类包括，但是不限于下面的细菌(在括号中显示的ATCC或者其它机构的典型菌株的保藏号)甲醇酸单胞菌(Acidomonas methanolica)(ATCC 43581)；纹膜醋酸杆菌(Acetobacter aceti)(ATCC 15973)；Gluconobacteroxydans(ATCC 19357)；短波单胞菌(Brevundimonas diminua)(ATCC11568)；印度贝氏固氮菌(Beijerinckia indica)(ATCC 9039和ATCC19361)；Derxia gummosa(ATCC 15994)；Brucella melitensis(ATCC23456)，牛种布鲁氏菌(Brucella abortus)(ATCC 23448)；根瘤农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)(ATCC 23308)，放射形土壤杆菌(Agrobacterium radiobacter)(ATCC 19358)，发根农杆菌(Agrobacterium rhizogenes)(ATCC 11325)；Chelatobacterheintzii(ATCC 29600)；Ensifer adhaerens(ATCC 33212)；根瘤菌(Rhizobium leguminosarum)(ATCC 10004)；Sinorhizobium fredii(ATCC35423)；Blastomonas natatoria(ATCC 35951)；鞘氨醇单胞菌(Sphingomonas paucimobilis)(ATCC 29837)；粪产碱菌(Alcaligenesfaecalis)(ATCC 8750)；百日咳杆菌(Bordetella pertussis)(ATCC 9797)；洋葱伯克霍尔德菌(Burkholderia cepacia)(ATCC 25416)；Ralstoniapickettii(ATCC 27511)；敏捷食酸菌(Acidovorax facilis)(ATCC 11228)；氢噬胞菌(Hydrogenophaga flava)(ATCC 33667)；生枝动胶菌(Zoogloea ramigera)(ATCC 19544)；甲基细菌(Methylobacter luteus)(ATCC 49878)；Methylocaldum gracile(NCIMB 1912)；甲基球菌(Methylococcus capsulatus)(ATCC 19069)；Methylomicrobiumagile(ATCC 35068)；甲烷甲基单胞菌(Methylononas methanica)(ATCC35067)；Methylosarcina fibrata(ATCC 700909)；Methylosphaerahansonii(ACAM 549)；氮单胞菌(Azomonas agilis)(ATCC 7494)；Azorhizophilus paspali(ATCC 23833)；圆褐固氮菌(Azotobacterchroococcum)(ATCC 9043)；对褐纤维弧菌(Cellvibrio mixtus)(UQM2601)；尿道寡源杆菌(Oligella urethralis)(ATCC 17960)；绿脓杆菌(Pseudomonas aeruginosa)(ATCC 10145)；荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)(ATCC 35858)；土拉热弗朗西丝菌(Francisella tularensis)(ATCC 6223)；嗜麦寡养食单胞菌(Stenotrophomonas maltophilia)(ATCC 13637)；Xanthomonascampestris(ATCC 33913)；和Oceanimonas doudoroffii(ATCC 27123)。
另一个实施方案中，宿主细胞选自“革兰氏(-)变形杆菌纲亚群3”。“革兰氏(-)变形杆菌纲亚群3”被定义为下面属中的变形杆菌的群短波单胞菌属(Brevundimonas)；土壤杆菌属(Agrobacterium)；根瘤菌(Rhizobium)；中华根瘤菌(Sinorhizobium)；芽生单胞菌(Blastomonas)；鞘氨醇单胞菌(Sphingomonas)；产碱杆菌属(Alcaligenes)；伯克氏菌属(Burkholderia)；劳尔氏菌属(Ralstonia)；酸单胞菌(Acidovorax)；噬氢菌属(Hydrogenophaga)；甲基杆菌属(Methylobacter)；甲基暖菌属(Methylocaldum)；甲基球菌属(Methylococcus)；甲基微菌属(Methylomicrobium)；甲基单胞菌属(Methylomonas)；甲基八叠球菌属(Methylosarcina)；甲基球形菌属(Methylosphaera)；氮单胞菌属(Azomonas)；固氮根瘤菌(Azorhizophilus)；固氮菌属(Azotobacter)；纤维弧菌属(Cellvibrio)；Oligella；假单胞杆菌(Pseudomonas)；Teredinibacter；弗兰西氏菌属(Francisella)；寡养单胞菌属(Stenotrophomonas)；黄单胞菌属(Xanthomonas)；和海洋假单胞菌属(Oceanimonas)。
另一个实施方案中，宿主细胞选自“革兰氏(-)变形杆菌纲亚群4”。“革兰氏(-)变形杆菌纲亚群4”被定义为下面属中的变形杆菌的组短波单胞菌属(Brevundimonas)；芽生单胞菌(Blastomonas)；鞘氨醇单胞菌(Sphingomonas)；伯克氏菌属(Burkholderia)；劳尔氏菌属(Ralstonia)；噬酸菌属(Acidovorax)；噬氢菌属(Hydrogenophaga)；甲基杆菌属(Methylobacter)；甲基暖菌属(Methylocaldum)；甲基球菌属(Methylococcus)；甲基微菌属(Methylomicrobium)；甲基单胞菌属(Methylomonas)；甲基八叠球菌属(Methylosarcina)；甲基球形菌属(Methylosphaera)；氮单胞菌属(Azomonas)；固氮根瘤菌(Azorhizophilus)；固氮菌属(Azotobacter)；纤维弧菌属(Cellvibrio)；Oligella；假单胞杆菌(Pseudomonas)；Teredinibacter；弗兰西氏菌属(Francisella)；寡养单胞菌属(Stenotrophomonas)；黄单胞菌(Xanthomonas)；和海洋假单胞菌属(Oceanimonas)。
一个实施方案中，宿主细胞选自“革兰氏(-)变形杆菌纲亚群5”。“革兰氏(-)变形杆菌纲亚群5”被定义为下面属中的变形杆菌的组甲基杆菌属(Methylobacter)；甲基暖菌属(Methylocaldum)；甲基球菌属(Methylococcus)；甲基微菌属(Methylomicrobium)；甲基单胞菌属(Methylomonas)；甲基八叠球菌属(Methylosarcina)；甲基球形菌属(Methylosphaera)；氮单胞菌属(Azomonas)；固氮根瘤菌(Azorhizophilus)；固氮菌属(Azotobacter)；纤维弧菌属(Cellvibrio)；Oligella；假单胞杆菌(Pseudomonas)；Teredinibacter；弗兰西氏菌属(Francisella)；寡养单胞菌属(Stenotrophomonas)；黄单胞菌(Xanthomonas)；和海洋假单胞菌属(Oceanimonas)。
宿主细胞可以选自“革兰氏(-)变形杆菌纲亚群6”。“革兰氏(-)变形杆菌纲亚群6”被定义为下面属中的变形杆菌的组短波单胞菌属(Brevundimonas)；芽生单胞菌(Blastomonas)；鞘氨醇单胞菌(Sphingomonas)；伯克氏菌属(Burkholderia)；劳尔氏菌属(Ralstonia)；噬酸菌属(Acidovorax)；噬氢菌属(Hydrogenophaga)；氮单胞菌属(Azomonas)；固氮根瘤菌(Azorhizophilus)；固氮菌属(Azotobacter)；纤维弧菌属(Cellvibrio)；Oligella；假单胞杆菌(Pseudomonas)；Teredinibacter；寡养单胞菌属(Stenotrophomonas)；黄单胞菌(Xanthomonas)；和海洋假单胞菌属(Oceanimonas)。
宿主细胞可以选自“革兰氏(-)变形杆菌纲亚群7”。“革兰氏(-)变形杆菌纲亚群7”被定义为下面属中的变形杆菌的组氮单胞菌属(Azomonas)；固氮根瘤菌(Azorhizophilus)；固氮菌属(Azotobacter)；纤维弧菌属(Cellvibrio)；Oligella；假单胞杆菌(Pseudomonas)；Teredinibacter；寡养单胞菌属(Stenotrophomonas)；黄单胞菌(Xanthomonas)；和海洋假单胞菌属(Oceanimonas)。
宿主细胞可以选自“革兰氏(-)变形杆菌纲亚群8”。“革兰氏(-)变形杆菌纲亚群8”被定义为下面属中的变形杆菌的组短波单胞菌属(Brevundimonas)；芽生单胞菌(Blastomonas)；鞘氨醇单胞菌(Sphingomonas)；伯克氏菌属(Burkholderia)；劳尔氏菌属(Ralstonia)；噬酸菌属(Acidovorax)；噬氢菌属(Hydrogenophaga)；假单胞杆菌(Pseudomonas)；寡养单胞菌属(Stenotrophomonas)；黄单胞菌(Xanthomonas)；和海洋假单胞菌属(Oceanimonas)。
宿主细胞可以选自“革兰氏(-)变形杆菌纲亚群9”。“革兰氏(-)变形杆菌纲亚群9”被定义为下面属中的变形杆菌的组短波单胞菌属(Brevundimonas)；伯克氏菌属(Burkholderia)；劳尔氏菌属(Ralstonia)；噬酸菌属(Acidovorax)；噬氢菌属(Hydrogenophaga)；假单胞杆菌(Pseudomonas)；寡养单胞菌属(Stenotrophomonas)；和海洋假单胞菌属(Oceanimonas)。
宿主细胞可以选自“革兰氏(-)变形杆菌纲亚群10”。“革兰氏(-)变形杆菌纲亚群10”被定义为下面属中的变形杆菌的组伯克氏菌属(Burkholderia)；劳尔氏菌属(Ralstonia)；假单胞杆菌(Pseudomonas)；寡养单胞菌属(Stenotrophomonas)；和黄单胞菌(Xanthomonas)。
宿主细胞可以选自“革兰氏(-)变形杆菌纲亚群11”。“革兰氏(-)变形杆菌纲亚群11”被定义为下面属中的变形杆菌的组假单胞杆菌(Pseudomonas)；寡养单胞菌属(Stenotrophomonas)；和黄单胞菌(Xanthomonas)。
宿主细胞可以选自“革兰氏(-)变形杆菌纲亚群12”。“革兰氏(-)变形杆菌纲亚群12”被定义为下面属中的变形杆菌的组伯克氏菌属(Burkholderia)；劳尔氏菌属(Ralstonia)；假单胞杆菌(Pseudomonas)。
宿主细胞可以选自“革兰氏(-)变形杆菌纲亚群13”。“革兰氏(-)变形杆菌纲亚群13”被定义为下面属中的变形杆菌的组伯克氏菌属(Burkholderia)；劳尔氏菌属(Ralstonia)；假单胞杆菌(Pseudomonas)和黄单胞菌(Xanthomonas)。
宿主细胞可以选自“革兰氏(-)变形杆菌纲亚群14”。“革兰氏(-)变形杆菌纲亚群14”被定义为下面属中的变形杆菌的组假单胞杆菌(Pseudomonas)和黄单胞菌(Xanthomonas)。
宿主细胞可以选自“革兰氏(-)变形杆菌纲亚群15”。“革兰氏(-)变形杆菌纲亚群15”被定义为假单胞杆菌(Pseudomonas)属中的变形杆菌的组。
宿主细胞可以选自“革兰氏(-)变形杆菌纲亚群16”。“革兰氏(-)变形杆菌纲亚群16”被定义为下面假单胞杆菌(Pseudomonas)种的变形杆菌的组(括号中显示的ATCC或其它机构中的典型菌株的保藏号)Pseudomonas abietaniphila(ATCC 700689)；绿脓杆菌(Pseudomonasaeruginosa)(ATCC 10145)；产碱假单胞菌(Pseudomonas alcaligenes)(ATCC 14909)；Pseudomonas anguilliseptica(ATCC 33660)；Pseudomonas citronellolis(ATCC 13674)；Pseudomonas flavescens(ATCC 51555)；门多萨假单胞菌(Pseudomonas mendocina)(ATCC25411)；Pseudomonas nitroreducens(ATCC 33634)；解油极毛杆菌(Pseudomonas oleovorars)(ATCC 8062)；假产碱假单胞菌(Pseudomonas pseudoalcaligeres)(ATCC 17440)；Pseudomonasresinovorans(ATCC 14235)；Pseudomonas straminea(ATCC 33636)；蘑菇假单胞菌(Pseudomonas agarici)(ATCC 25941)；Pseudomonasalcaliphila；Pseudomonas alginovora；Pseudomonas andersonii；Pseudomonas asplenii(ATCC 23835)；Pseudomonas azelaica(ATCC27162)；Pseudomofaas beijerinckii(ATCC 19372)；Pseudomonas borealis；Pseudomonas boreopolis(ATCC 33662)；Pseudomonas brassicacearum；Pseudomonas butanovora(ATCC 43655)；Pseudomonas cellulosa(ATCC55703)；Pseudomonas aurantiaca(ATCC 33663)；绿针假单胞菌(Pseudomonas chlororaphis)(ATCC 9446，ATCC 13985，ATCC 17418，ATCC 17461)；草莓假单胞菌(Pseudomonas fragi)(ATCC 4973)；Pseudomonas lundensis(ATCC 49968)；腐臭假单胞菌(Pseudomonastaetrolens)(ATCC 4683)；Pseudomonas cissicola(ATCC 33616)；Pseudomonas coronfaciens；Pseudomonas diterpeniphila；Pseudomonaselongata(ATCC 10144)；Pseudomonas flectens(ATCC 12775)；氮芽孢杆菌(Pseudomonas azotoformans)；Pseudomonas brenneri；Pseudomonascedrella；Pseudomonas corrugata(ATCC 29736)；Pseudomonasextremorientalis；Pseudomonas fluorescens(ATCC 35858)；Pseudomonasgessardii；Pseudomonas libanensis；Pseudomonas mandelii(ATCC700871)；边缘假单胞菌(Pseudomonas marginalis)(ATCC 10844)；Pseudomonas migulae；Pseudomonas mucidolens(ATCC 4685)；Pseudomonas orientais；Pseudomonas rhodesiae；Pseudomonassynxantha(ATCC 9890)；托拉斯假单胞杆(Pseudomonas tolaasii)(ATCC 33618)；威隆气单胞菌(Pseudomonas veronii)(ATCC 700474)；Pseudomonas frederiksbergensis；Pseudomonas geniculata(ATCC 19374)；Pseudomonas gingers；Pseudomonas graminis；Pseudomonas grimontii；Pseudomonas halodenitrificans；Pseudomonas halophila；Pseudornonashibiscicola(ATCC 19867)；Pseudomonas huttiensis(ATCC 14670)；噬氢假单胞菌(Pseudomonas hydrogenovora)；Pseudomonas jessenii(ATCC700870)；Pseudomonas kilonensis；Pseudomonas lanceolata(ATCC14669)；Pseudomonas lini；Pseudomonas marginata(ATCC 25417)；Pseudomonas mephitica(ATCC 33665)；脱氮假单胞菌(Pseudomonasdenitrificans)(ATCC 19244)；Pseudomonas pertucinogena(ATCC 190)；Pseudomonas pictorum(ATCC 23328)；Pseudomonas psychrophila；Pseudomonas fulva(ATCC 31418)；Pseudomonas monteilii(ATCC700476)；Pseudomonas mosselii；Pseudomonas oryzihabitans(ATCC43272)；Pseudomonas plecoglossicida(ATCC 700383)；恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)(ATCC 12633)；Pseudomonas reactants；Pseudomonas spinosa(ATCC 14606)；巴利阿里假单胞菌(Pseudomonasbalearica)；Pseudomonas luteola(ATCC 43273)；斯氏假单胞菌(Pseudomonas stutzeri)(ATCC 17588)；Pseudomonas amygdali(ATCC33614)；Pseudomonas avellanae(ATCC 700331)；Pseudomonascaricapapayae(ATCC 33615)；菊苣假单孢菌(Pseudomonas cichorii)(ATCC 10857)；Pseudomonas ficuserectae(ATCC 35104)；Pseudomonasfuscovaginae；Pseudomonas meliae(ATCC 33050)；丁香假单胞菌(Pseudomonas syringe)(ATCC 19310)；Pseudoinoizas viridiflava(ATCC 13223)；Pseudomonas thermocarboxydovorans(ATCC 35961)；Pseudomonas thermotolerans；Pseudomonas thivervalensis；Pseudomonas vancouverensis(ATCC 700688)；Pseudomonaswisconsinensis；和Pseudomonas xiamenensis。
宿主细胞可以选自“革兰氏(-)变形杆菌纲亚群17”。“革兰氏(-)变形杆菌纲亚群17”被定义为现有技术中被认为是“荧光假单胞菌”的变形杆菌的组包括那些属于例如下面的假单胞菌的种Pseudomonasazotoformans；Pseudomonas brenneri；Pseudomonas cedrella；皱纹假单胞菌(Pseudomonas corrugata)；Pseudomonas extremorientalis；荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)；Pseudomonas gessardii；Pseudomonaslibanensis；Pseudomonas mandelii；边缘假单胞菌(Pseudomonasmarginalis)；Pseudomonas migulae；Pseudomonas mucidolens；Pseudomonas orientalis；Pseudomonas rhodesiae；产黄假单胞菌(Pseudomonas synxantha)；抗假单胞菌(Pseudomonas tolaasii)和威隆气单胞菌(Pseudomonas veronii)。
宿主细胞可以选自“革兰氏(-)变形杆菌纲亚群18”。“革兰氏(-)变形杆菌纲亚群18”被定义为荧光假单胞菌种的所有亚种，变体，菌株，和其它的亚种单元，包括那些属于例如下面的(括号中显示的是ATCC或其它机构中的典型菌株的保藏号)荧光假单胞菌生物型A，也称为生物变体(biovar)1或者生物变体I(ATCC13525)；荧光假单胞菌生物型B，也称为生物变体2或者生物变体II(ATCC 17816)；荧光假单胞菌生物型C，也称为生物变体3或者生物变体III(ATCC 17400)；荧光假单胞菌生物型F，也称为生物变体4或者生物变体IV(ATCC12983)；荧光假单胞菌生物型G，也称为生物变体5或者生物变体V(ATCC17518)；荧光假单胞菌生物变体VI；荧光假单胞菌PfO-1；荧光假单胞菌Pf-5(ATCC BAA-477)；荧光假单胞菌SBW25和荧光假单胞菌subsp.cellulosa(NCIMB 10462)。
宿主细胞可以选自“革兰氏(-)变形杆菌纲亚群19”。“革兰氏(-)变形杆菌纲亚群19”被定义为荧光假单胞菌生物型A的所有菌株的组。这种生物型的特别优选的菌株是荧光假单胞菌菌株MB101(参考美国专利No.5,169,760(see US Patent No.5,169,760 to Wilcox))，及其衍生物。其衍生物的一个例子是荧光假单胞菌MB214，通过插入被构建到MB 101染色体asd(天冬氨酸脱氢酶基因)位点，一个天然的E.coliPlacI-lacI-lacZYA构建(即，其中PlacZ被删除)。
在一个实施方案中，宿主细胞是假单胞菌目的任意变形菌。在一个特殊的实施方案中，宿主细胞是假单胞菌科的任何变形菌。
其他的荧光假单胞菌也可被用在本发明，包括Migula荧光假单胞菌和Loitokitok荧光假单胞菌，具有以下的ATCC指定(NCIB 8286)；NRRL B-1244；NCIB8865 strain C01；NCIB8866 strain C02；1291(ATCC 17458；IFO 15837；NCIB 8917；LA；NRRL B-1864；pyrrolidine；PW2(ICMP 3966；NCPPB 967；NRRL B-899)；13475；NCTC 10038；NRRLB-1603(6；IFO 15840)；52-1C；CCEB488-A(BU 140)；CCEB 553(IEM15/47)；IAM 1008(AHH-27)；IAM 1055(AHH-23)；1(IFO 15842)；12(ATCC 25323；NIH 11；den Dooren de Jong 216)；18(IFO 15833；WRRL P-7)；93(TR-10)；108(52-22；IFO15832)；143(IFO 15836；PL)；149(2-40-40；IFO 15838)；182(IFO 3081；PJ 73)；184(IFO15830)；185(W2L-1)；186(IFO 15829；PJ 79)；187(NCPPB 263)；188(NCPPB 316)；189(PJ227；1208)；191(IFO 15834；PJ 236；22/1)；194(Klinge R-60；PJ 253)；196(PJ288)；197(PJ 290)；198(PJ302)；201(PJ368)；202(PJ 372)；203(PJ 376)；204(IFO15835；PJ682)；205(PJ686)；206(PJ 692)；207(PJ 693)；208(PJ 722)；212(PJ 832)；215(PJ849)；216(PJ 885)；267(B-9)；271(B-1612)；401(C71A；IFO 15831；PJ 187)；NRRL B-3178(4；IFO 15841)；KY8521；3081；30-21；(IFO3081)；N；PYR；PW；D946-B83(BU 2183；FERM-P3328)；P-2563(FERM-P 2894；IFO 13658)；IAM-1126(43F)；M-1；A506(A5-06)；A505(A5-05-1)；A526(A5-26)；B69；72；NRRLB-4290；PMW6(NCIB 11615)；SC 12936；A1(IFO 15839)；F 1847(CDC-EB)；F 1848(CDC 93)；NCIB10586；P17；F-12；AmMS 257；PRA25；6133D02；6519E01；N1；SC15208；BNL-WVC；NCTC2583(NCIB 8194)；H13；1013(ATCC 11251；CCEB 295)；IFO 3903；1062；或Pf-5。
发酵术语“发酵”即包括文字上使用发酵的实施方案，也包括其他使用非发酵培养方式的实施方案。发酵可以以任何规模进行。在一个实施方案中，发酵培养基可以选自丰富的培养基、基本培养基和矿物盐培养基；可以使用丰富的培养基，但典型地应该避免。在另一个实施方案中，可以选择基本培养基和矿物盐培养基。在另一个实施方案中，可以选用基本培养基。
矿物盐培养基包括矿物盐和碳源，如葡萄糖、蔗糖或甘油。矿物盐培养基的例子包括，如M9培养基，假单胞菌培养基(ATCC 179)，Davis和Mingioli培养基(见，BD Davis & ES Mingioli(1950)J.Bact6017-28)。用于制备矿物盐培养基的矿物盐包括，如磷酸钾，氯化铵或硫酸铵，氯化镁或硫酸镁，和微量矿物质如氯化钙，硼酸盐，铁、铜、镁和锌的硫酸盐。典型地，没有有机氮源，如蛋白胨、胰蛋白胨、氨基酸或酵母提取物包括在矿物盐培养基中。相反，使用无机氮源，其可以选自如，铵盐，氨水和氨气。矿物盐培养基典型地含有葡萄糖作碳源。与矿物盐培养基比较，基本培养基可以含有矿物盐和碳源，但也可以补充有如低水平氨基酸，维生素，蛋白胨，或其他成分，尽管这些成分的量是微小的。
在一个实施方案中，可以使用下列表7中列出的成分制备培养基。可以以下列的顺序加入成分首先(NH4)HPO4，KH2PO4和柠檬酸可以溶于大约30升蒸馏水中；然后加入微量成分溶液，随后加入除泡沫试剂，如Ucolub N115。然后，热消毒后(如大约在121℃)，加入消毒的葡萄糖MgSO4和硫胺-HCL。可使用氨水控制pH在大约6.8。然后可加入消毒的蒸馏水以调节初始容量至371减去甘油储存液(123ml)。化学物可从多个供应商得到，如Merck。此培养基可允许高细胞密度的培养(HCDC)以使假单胞菌种和相关的细菌生长。HCDC可以以批量方式起始，随后使用双向反馈(two-phase fed-batch)批量培养。在批量部分的最终生长后，可以降低的特定培养速率控制生长，在3倍的时间内，生物量浓度可增加几倍。此培养方法的进一步的细节在Riesenberg，D等(1991)″High cell density cultivation of Escherichia coli atcontrolled specific growth rate″J Biotechnol 20(1)17-27中描述了。
表7培养基成分




根据本发明的表达系统可以在任何发酵形式中培养。例如，此处可应用批量，反馈批量，半连续和连续发酵模式。
根据本发明的表达系统可用于任何发酵规模(即，容积)的转基因表达。因此，可以使用如微升规模，厘升规模和1/10公升规模的发酵容积，可用1升或更大发酵体积。在一个实施方案中，发酵容积是或超过1升。在另一个实施方案中，发酵容积可以是或超过5、10、15、20、25、50、75、100、200、500、1000、2000、5000、10000或50000升。
在本发明中，转化的宿主细胞的生长、培养和/或发酵在允许宿主细胞存活的温度范围内进行，此温度范围为包括大约4℃至55℃。另外，“生长”用于指活细胞分裂和/或增大的生物状态以及维持新陈代谢的非分裂和/或非增大的细胞任生物状态，后一种应用的同义词是“维持”。
细胞密度在表达重组哺乳动物蛋白中应用荧光假单胞菌的另一个优点包括与大肠杆菌和其他细菌表达系统相比，荧光假单胞菌能够以高细胞密度生长。由于此，根据本发明的荧光假变形菌纲表达系统可以提供大约20g/L或更多的细胞密度。根据本发明的荧光假单胞菌表达系统还可以提供至少大约70g/L的细胞密度，当术语以每体积中的生物量考虑时，其中测量的生物量是干细胞的重量。
在一个实施方案中，细胞密度至少是20g/L。在另一个实施方案中，细胞密度至少是25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、或至少150g/L。
在另一个实施方案中，诱导时的细胞密度是介于20-150g/L之间，介于20-120g/L之间、介于20-80g/L之间、介于25-80g/L之间、介于30-80g/L之间、介于35-80g/L之间、介于40-80g/L之间、介于45-80g/L之间、介于50-80g/L之间、介于50-75g/L之间、介于50-70g/L之间、介于40-80g/L之间。
分离和纯化通过本领域中已知的标准技术，本发明的蛋白可被分离纯化为基本纯，已知的标准技术包括但不局限于硫酸铵或乙醇沉淀，酸提取，阴离子或阳离子交换色谱，磷酸纤维素色谱，疏水反应色谱，亲和性色谱，镍色谱，羟磷灰石色谱，反向色谱，血凝素色谱，预备电泳，去垢剂可溶，用诸如色谱柱、免疫纯化方法和其他方法进行的选择性沉淀。例如，具有设定分子黏附特性的蛋白质可以被可逆地结合与配体。与适当的配体结合，蛋白可选择性地吸附于纯化柱上，然后以相对纯的形式从柱上游离。然后通过酶反应除去融合蛋白。另外，可使用免疫亲和柱或Ni-NTA柱纯化蛋白。一般的技术进一步在如R.Scopes(1982)Protein PurificationPrinciples and Practice，Springer-VerlagN.Y.；Deutscher(1990)Guide to ProteinPurification，Academic Press；U.S.Patent No.4,511,503；S.Roe(2001)Protein Purification TechniquesA PracticalApproach，Oxford Press；D.Bollag，et al.(1996)Protein Methods，Wiley-Lisa，Inc.；AK Patra et al.(2000)Protein Expr Purif，18(2)182-92；和R.Mukhija，et al.(1995)Gene 165(2)303-6中描述。也可见，例如，Deutscher(1990)″Guide to ProteinPurification，″Methods in Enzymology vol.182，一次系列中的其他；Coligan，et al.(1996 and periodic Supplements)CurrentProtocols in Protein Science，Wiley/Greene，NY；和使用蛋白纯化产物的操作手册，如Pharmacia，Piscataway，N.J.，或Bio-Rad，Richmond，Calif。结合重组技术可以融合适当的片段，如通过蛋白酶除去的序列可融合至FLAg序列或相应的序列。也见，例如Hochuli(1989)Chemische Industrie 1269-70；Hochuli(1990)″Purification of Recombinant Proteins with Metal ChelateAbsorbent″in Setlow(ed.)Genetic Engineering，Principle andMethods 1287-98，Plenum Press，NY；和Crowe，et al.(1992)QIAexpressThe High Level Expression & ProteinPurification System QUIAGEN，Inc.，Chatsworth，Calif。
通过本领域的已知方法检测表达的蛋白，包括，例如放射免疫分析，蛋白质印迹技术或免疫沉淀。
可以通过多种方法从重组细胞培养物中回收和纯化重组生产的和表达的酶，例如，如果需要，可以使用高效液相色谱(HPLC)作为最终的纯化步骤。
在本发明中表达的某种蛋白可形成不溶的聚集物(“包涵体”)。一些方法适合于从包涵体中纯化蛋白。例如，包涵体的纯化典型地包括通过破坏宿主细胞提取、分离和/或纯化包涵体，例如，在50mMTRIS/HCl pH 7.5，50mMNaCl，5mM MgCl2，1mM DTT，0.1mM ATP，和1mM PMSF缓冲液中孵育。典型地通过使用French Press通过2-3次裂解细胞悬浊液。也可以使用Polytron(Brinkrnan Instruments)或在冰上超生波降解来使细胞悬浊液均一化。可选择的裂解细菌的方法对本领域技术人员是显而易见的(见，例如，Sambrook，J.，E.F.Fritsch and T.Maniatis eds.(1989)″Molecular CloningALaboratory Manual″，2ded.，Cold Spring Harbor Laboratory Press；Ausubel et al.，eds.(1994)Current Protocols in MolecularBiology)。
如果必要，包涵体可被可溶，被裂解的细胞悬浊液典型地被离心以除去不想要的不溶性物质。形成包涵体的蛋白质可被相容的缓冲液稀释或透析以复性。适合的溶剂包括但不局限于尿素(从大约4M到8M)，甲酰胺(至少大约80％，容积/容积)，和盐酸胍(从大约4M到8M)。尽管盐酸胍和同源的试剂是变性剂，这种变性不是不可逆的，可通过除去(例如通过透析)或稀释变性剂来复性，从而允许再形成免疫和/或生物活性蛋白。其他合适的缓冲液是本领域技术人员已知的。
可替换的，还可以从宿主周质中纯化重组蛋白。裂解宿主细胞后，当重组蛋白被向外输送到宿主细胞周质时，除本领域技术人员已知的其他方法外，可用冷的渗透冲击分离细菌的周质部分。例如，为了从周质中分离重组蛋白，可离心细菌细胞以形成沉淀。可用含有20％的蔗糖缓冲液再次可溶沉淀。为了裂解细胞，可离心细菌并在冰冷的5mMMgSO4中再次悬浮沉淀，在冰上保持大约10分钟。离心细胞悬浮液，倒出上清保存。存在于上清中的重组蛋白可用本领域已知的方法从宿主蛋白中分离出来。
初始的盐分馏法可从感性趣的重组蛋白中分离许多不想要的宿主细胞蛋白(或从细胞培养基衍生的蛋白)。一个例子是硫酸铵。通过有效地降低蛋白混合物中的水的量，硫酸铵沉淀蛋白。然后蛋白质根据其可溶度沉淀。蛋白质越是疏水，越可能被低浓度的硫酸氨沉淀。典型的方法包括向蛋白溶液中加入饱和硫酸铵，以使得硫酸铵浓度在20-30％之间。此浓度可以使多数疏水蛋白沉淀。然后去除沉淀物(除非感兴趣的蛋白质是疏水的)，硫酸铵加入到上清中的浓度是已知沉淀感兴趣蛋白的浓度。然后将沉淀溶于缓冲液，如果必要，通过透析或双过滤除去过量的盐。也可以使用依赖蛋白可溶度的其他方法分离复合蛋白质混合物，如乙醇沉淀，是本领域技术人员已知的。
重组蛋白分子量可被用于从大或小分子的蛋白中分离其，通过不同孔尺寸的膜的超过滤(如，Amicon或Millipore膜)。作为第一步，通过一个膜来超过滤，该膜的孔尺寸可使比感兴趣蛋白分子量小的分离。保留的过滤液可再进行超过滤，通过一个膜使鼻感兴趣蛋白的分子量大的分子分离。重组蛋白通过膜进入过滤液中。然后将过滤液如下所述进行色谱分析。
也可以根据其尺寸、表面净电荷、疏水性和与配体的亲和性将重组蛋白从其他蛋白分离。另外，抗蛋白的抗体可以与柱矩阵结合，从而使蛋白被免疫纯化。所有的方法是本领域已知的。对于本领域技术人员而言，色谱技术可以在任何规模下进行，且可以使用许多不同厂家的设备(如，Pharmacia Biotech)是显而易见的。
复性和折叠不可溶的蛋白能够被复性和折叠以生产二级和三级蛋白结构构象。如果必要，在完成重组产物的构象中可以使用蛋白折叠步骤。可以使用本领域中已知的试剂完成折叠和复性，以促进蛋白的分离/结合。例如，蛋白可与二硫化物共同培养，随后与氧化谷胱甘肽二钠盐培养，随后与含有折叠试剂如尿素的缓冲液培养。
重组蛋白也可以被复性，例如磷酸缓冲液钠(PBS)或50mM醋酸钠，pH6的缓冲液加200mM NaCl将其透析。可替换地，当固定在柱上蛋白可被折叠，如Ni-NTA柱，通过使用在500mM NaCl，20％甘油，20mMTris/HClpH7.4含有蛋白抑制剂的6M-1M尿素梯度。可用1.5小时或更长时间进行复性。蛋白复性后可通过加入250mM的咪唑(immidazole)洗脱。最后可用PBS或50mM醋酸钠，pH6的缓冲液加200mMNaCl的透析步骤除去咪唑。被纯化的蛋白在4℃或-80℃冰冻保存。
其他方法包括，例如那些在MH Lee et al.(2002)ProteinExpr.Purif.25(1)166-73；W.K.Cho et al.(2000)J.Biotechnology 77(2-3)169-78；Deutscher(1990)″Guide toProtein Purification，″Methods in Enzymology vol.182，和此系列的其他卷；Coligan，et al.(1996and periodic Supplements)Current Protocols in Protein Science，Wiley/Greene，NY；S.Roe(2001)Protein Purification TechniquesA Practical Approach，Oxford Press；D.Bollag，et al.(1996)Protein Methods，Wiley-Lisa，Inc.中描述了。
活性蛋白或肽的分析典型地，“活性蛋白”包括与相应的天然蛋白相比具有生物功能或生物作用的蛋白。在蛋白质的上下文中，典型地指包括生物功能或生物作用至少是具有标准参数的天然蛋白的大约20％、大约50％、大约60％、大约70％、大约75％、大约80％、大约85％、大约90％、大约95％、大约98％、或100％的多核苷酸或多肽。蛋白活性的确定可使用特定蛋白的相应的标准的靶的比较生物方法。重组蛋白生物功能或作用的一个指标是重组多肽与天然蛋白有交叉免疫反应性。
活性蛋白典型地具有天然哺乳动物蛋白特异的活性的至少20％，30％，40％，50％，60％，70％，80％，90％，或95％。进一步，底物特异性(Kcat/Km)可选择地基本上与天然哺乳动物蛋白相似。典型地，Kcat/Km至少是天然蛋白的30％，40％，50％，60％，70％，80％，或90％。分析和定量测量蛋白、肽活性和底物特异性(Kcat/Km)的方法是本领域技术人员熟知的。
可通过任何本领域中已知的蛋白质特异的传统或标准的体外或体内分析来测量重组哺乳动物蛋白的活性。假单胞菌生产重组哺乳动物蛋白的活性可以与相应的天然哺乳动物蛋白活性相比较，以确定重组哺乳动物蛋白在相同或相似的生理条件下是否与一般情况下观察到的天然蛋白的活性基本上相同或相似。
重组蛋白的活性可以与事先建立起来的天然蛋白的标准活性相比较。可选择地，重组蛋白的活性可以用于天然蛋白同时的，或基本上同时的比较分析确定。例如，可以使用体外分析确定重组蛋白与靶子之间任何可测得的相互作用，如表达的酶和底物之间，表达的激素和激素受体之间，表达的抗体和抗原之间等。此种检测可以包括如凝胶电泳和/或凝胶排除方法、磷酸化能力、抗体特异性分析如ELISA分析等方法测量的比色度的变化、增殖的变化、细胞死亡、细胞排斥、放射活性改变、溶解度改变，分子量改变等。另外，体内分析包括但不局限于与天然蛋白的生理作用相比较分析测量假单胞菌生产的蛋白的生理作用，如，重量的获得、电解平衡的变化、血凝时间的变化、凝块可溶和诱导抗原反应的变化。一般而言，只要该活性是可分析的，就可使用任何体内或体外方法确定假单胞菌生产的重组哺乳动物蛋白的活性以允许其与天然蛋白比较。可选择的，可以分析本发明生产的蛋白的刺激或抑制蛋白或通常与该蛋白相互作用的的分子间的相互反应的能力，如，天然蛋白通常与之作用的底物或信号路径的成分。此种分析典型地可以包括在允许蛋白与靶分子相互作用的条件下，使蛋白与底物分子结合，检测蛋白与靶分子相互作用的生化结果。
可以用来确定蛋白活性的分析，在例如Ralph，P.J.，etal.(1984)J.Immunol.1321858；Saiki et al.(1981)J.Immunol.1271044；Steward，W.E.II(1980)The Interferon Systems.Springer-Verlag，Vienna and New York；Broxmeyer，H.E.，et al.(1982)Blood 60595；Sambrook，J.，E.F.Fritsch and T.Maniaiseds.(1989)″Molecular CloningA Laboratory Manual″，2ded.，Cold Spring Harbor Laboratory Press；Berger，S.L.and A.R.Kimmel eds.(1987)″Methods in EnzymologyGuide to MolecularCloning Techniques″，Academic Press；AK Patra et al.(2000)Protein Expr Purif 18(2)182-92；Kodama et al.(1986)J.Biochem.991465-1472；Stewart et al.(1993)Proc.Nat’l Acad.Sci.USA905209-5213；Lombillo et al.(1995)J.Cell Biol.128107-115；Vale et al.(1985)Cell 4239-50中描述了。
实施例菌株和生长条件除非特别指出，所有用于假单胞菌表达试验的菌株都是基于荧光假单胞菌株MB101。埃希氏大肠杆菌株JM109(Promega)，X12兰(Stratagene)或Top10(Invitrogen)用于一般的克隆。为了进行埃希氏大肠杆菌表达的研究，使用BL21(DE3)Gold。荧光假单胞菌在LB或如需要在30℃补充有15ug/ml四环素和30ug/ml卡那霉素基本盐培养基。埃希氏大肠杆菌株如需要在37℃在补充有30ug/ml卡那霉素和/或15ug/ml氯霉素或15ug/ml四环素的LB上生长。生长期后，细胞用0.3mM的IPTG诱导。
蛋白活性检测(ELISA分析)向微量(microtiter)平板的每个孔中加入200ul的PBS(pH7.6)中的10ug/ml的β-半乳糖溶液，包被平板。在室温下抚育平板16小时，然后用200L PBS+0.1％Tween-20(PBS-T)洗3次。用具有2％脱脂干牛奶(w/v)的PBS稀释一级抗体。将200uL稀释抗体加入每孔，室温下抚育1小时。然后用200μL PBS-T冲洗平板4次。用具有2％脱脂干牛奶(w/v)的PBS稀释二级抗体，向每孔加入200μL，室温抚育1.5-2小时。然后用PBS-T冲洗平板4次。用3级抗体检测scFv抗体碱性磷酸酶连接的羊抗鼠抗体(Sigma-Aldrich，St.Louis，MO，USA商品号#A5324)。向每一孔中加入200μL稀释的抗体溶液(或PBS-T)，室温抚育1.5小时。然后用PBS-T冲洗平板4次。向每孔中加入200μL新制备的Sigma Fast pNPP底物(Sigma商品号#R-2770)。30分钟后，向每孔中加入50μL 3M NaOH终止反应，在405nm下测量吸光度。
发酵荧光假单胞菌发酵培养的接种是通过接种含有600mL补充有酵母提取物和葡萄糖的化学限定的培养基的摇瓶接种完成的。典型地加入四环素以确保在过夜培养以及在发酵罐中重组质粒在起始培养中的维持。然后无菌地将摇瓶培养物转移到含有化学定义培养基的20升发酵罐中，该培养基支持高生物量，没有酵母提取物的培养。在液体培养中通过调节流向发酵罐的气流和搅拌混合率使氧气维持于高水平；通过加入氨水使pH保持在6以上。反馈批次高密度发酵方法分为大约24小时的起始(initiation)生长期和基因表达(诱导)期，其中加入诱导剂启动重组基因表达。以谷物浆形式存在的葡萄糖，以被限制的浓度在整个发酵过程中被加入。用于启动诱导期的靶细胞密度典型地在575nm下是150OD。典型地发酵诱导期进行大约45-55小时。在此期间，从发酵罐中提取样本，用于各种分析，以确定靶基因表达，细胞密度等水平。
对于埃希氏大肠杆菌的每次发酵试验，从-80℃取出冰冻的甘油保存液，在接种到含有600ml LB的补充有卡那霉素的培养基前溶化并稀释。摇瓶培养在300rpm下，37℃孵育一夜，然后无菌地转移到含有复合培养基的20L的发酵罐中。通过加入氨水和磷酸，发酵罐的温度维持在37℃，pH在7，可溶的氧大于20％。经过简单的起始阶段，以逐渐增加的步骤加入甘油以维持过多的碳。当细胞密度达到600nm下24-28OD时，加入诱导剂，如异丙基-硫代半乳糖苷(IPTG)影响表达。典型地，发酵的诱导期持续大约3-5小时当发酵罐达到容积能力或当生长率开始显著下降时。在此期间，从发酵罐中提取样本进行各种分析，以确定靶基因表达、细胞密度等的水平。
细胞分馏和SDS-PAGE分析样本被标准化至A575＝30，沉淀1mL标准化的培养液。在ImL裂解缓冲液中(50mM Tris base；200mM NaCI；5％ v/v甘油；20mM EDTA二钠盐；0.5％ v/v Triton X-100；1mM DTT)再悬浮细胞。将细菌裂解液特异的蛋白酶抑制剂溶液(Sigma#P8465)加入至1X浓度。将再悬浮的细胞加入到有0.1mm玻璃珠的2ml的有旋转盖子的离心管中，大约至3/4饱和，用4，1分钟培养机在BioSpec珠压榨机(beedmill)的最高设定下，机械地裂解细胞。孵育期间在冰上放置细胞。从小珠中除去大约100uL裂解的细胞液，转移到新试管并离心。将上清(可溶部分)移至新的试管。沉淀(不溶部分)在裂解缓冲液加蛋白酶抑制剂中以相等体积再悬浮(100uL)。5uL每种样本加入到5uL的2×LDS装载缓冲液(Invitrogen)，向4-12％或10％ Bis-Tris NuPAGE凝胶(Invitrogen)上加样，并在1×MES或1×MOPS缓冲液中电泳，如所示。
实施例1scFV在细胞质中的表达作为诊断和治疗试剂，单链抗体片段(scFV)被发现有更多的用途。这些相对小的蛋白通过融合编码免疫球蛋白轻链和重链的可变区的基因制得。
Gal13 scFv克隆Gal13 scFv基因(Genbank进入号AF238290)))))))，被克隆到噬菌体表达载体pCANTAB6，(见P Martineau等(1998)J.Mol.Biol.280(1)117-27)被用作模板来扩增774碱基对的产物，其随后被克隆到pCR2.1 TOPO载体(Invitrogen，Carlsbad，CA，USA)。用SpeI和SalI限制酶(New England Biolabs，Beverly，MA，USA)从TOPO载体中提取scFv基因，并克隆到荧光假单胞菌载体pMYC1803的SpeI和XhoI位点，Ptac启动子的下游，以生产pDOW1117。得到的质粒被电穿孔至荧光假单胞菌。将Gal13克隆到pET24d+表达载体(Novagen，Madison，WI，USA)，随后扩增使得Sail和NcoI位点位于编码序列两端。用SalI和NcoI消化PCR产物，并克隆到pET24d+载体相同的位点，T7启动子的下游。然后用新形成的构建转化XL2 Blue感受态细胞。确定序列后，用DNA构建转化BL21(DE3)Gold(Stratagene，San Diego，CA，USA)以用于表达。
在埃希氏大肠杆菌和荧光假单胞菌中表达单链抗体片段(scFv)scFv分子在埃希氏大肠杆菌和荧光假单胞菌中表达，其中scFv具有与埃希氏大肠杆菌蛋白β-半乳糖苷酶单链抗体gall3的结合活性(P.Martineau等，″Expression of an antibody fragment at highlevels in the bacterial cytoplasm，″J.Mol.Biol.280(1)117-27(1998))。在20L发酵期间，荧光假单胞菌表达比埃希氏大肠杆菌多6倍的蛋白，通过SDS-PAGE和密度计量学检测到荧光假单胞菌中的产量为3.1g/L，而埃希氏大肠杆菌中的产量为0.5g/L(见表8)。荧光假单胞菌表达大约96％的可溶蛋白，而埃希氏大肠杆菌仅表达48％的可溶蛋白。
表8Gal13发酵分析(*与BSA标准比较)

如表2所示从两种表达系统中纯化的物质在酶联免疫反应中(ELISA)均发现有活性。使用亲和性色谱法物质也被从两株的裂解液等量的裂解容积的可溶部分纯化。最后，从荧光假单胞菌的方法中回收的体积比大肠杆菌大约有效20倍，分别为1.34g/L和0.07g/L。
实施例2在细胞质中表达人γ-IFN人γ干扰素的克隆人γ干扰素(人γ-IFN，Genbank进入号X13274)被从人脾cDNA文库中(Invitrogen，Carlsbad，CA，USA；商品号#10425-015)扩增，从而使其缺乏天然分泌信号，具有如PW Gray等(1982)Nature298859-63种描述的以Met-Cys-Tyr-Cys-Gln-Asp-Pro开始的重组γ-IFN的N端。将得到的产物克隆到pCR2.1 TOPO载体，并测序。人γ-IFN基因从具有SpeI和XhoI限制酶位点的TOPO载体中切下，并被克隆到pMYC1803相同的位点。在一个独立的反应中，γ-IFN被扩增以使得AflIII和XhoI位点位于编码序列两端。将得到的片段克隆到TOPO-TA载体(Invitrogen)，并转化到化学上感受态的E.coli JM109细胞(Promega，Madison，WI，USA)。用AflIII和XhoI消化分离基因(NewEngland Biolabs)，克隆到pET24d+(Novagen，Madison，WI，USA)的NcoI和XhoI位点，位于T7启动子下游，并转化至JM109。阳性克隆转化到E.coli BL21(DE3)细胞(Novagen)用于表达测试。
人γ干扰素的纯化将来自于荧光假单胞菌培养物的冰冻细胞糊融解，在裂解缓冲液(50mM磷酸钾，pH 7.2含有50mMNaCl，10mM EDTA(ethylenediaminetetraacetic acid，商品号BPII8-500，FisherScientific，Springfield，NJ，USA)，1mM PMSF(phenylmethylsul fonyl fluoride，商品号P-7626，Sigma，St.Louis，MO)，1mM二硫代苏糖醇(商品号D-0632，Sigma)，和1mM苯甲脒(商品号B-6506，Sigma))以每2mL裂解缓冲液1g细胞糊的比率再悬浮。将细胞三次通过一个微液化器(model 110Y，MicrofluidicsCorporation，Newton，MA，USA)打碎。通过离心除去细胞碎片和未碎的细胞(23,708xg，60分钟，4℃，并使用Beckman Coultercentrifuge；model JA 25.50，Beckman Coulter，Inc.，Fullerton，CA，USA)。通过加入10％ w/v硅藻土(Celite product，World Minerals，Inc.，Goleta，CA，USA)澄清(clarify)得到的上清(无细胞提取物)，并通过真空过滤的纸滤纸(Whatmanl，商品号1001-150，WhatmanPaper Ltd.，Maidstone，Kent，UK))。
将澄清的细胞提取物时加到3.2cm×13.5cm SP-Sepharose FASTFLOW(6％交联琼脂糖珠物质；商品号17-0709-10，AmershamBiosciences，Piscataway，NJ，USA)的色谱柱上，以0.5mL/min流速用缓冲液A平衡。缓冲液A的组分是50mM HEPES，pH 7.8(即N-(2-羟基乙基)哌嗪)N’-(2-磺乙酸)，来自Fisher Scientific，商品号BP-310-100)，50mM NaCl，ImM EDTA，和0.02％叠氮化钠(商品号71289，Sigma Chemical Co.)。加样后，用3倍柱容积的缓冲液A(柱容积＝108mL)和5倍柱容积的含有0.4M NaCl的缓冲液A清洗柱。在相同的缓冲液以流率2mL/min用7倍柱容积进一步向柱加一个0.4M到1MNaCl的梯度。然后收集含有纯的IFN-γ的部分，并用1×PBS(磷酸缓冲液钠盐，pH 7.2)在4℃透析。通过超滤浓缩蛋白(使用YM30超滤膜；商品号13722，来自Millipore，Bedford，MA USA)，然后在液氮中冷冻，保存在-80℃。
在埃希氏大肠杆菌和荧光假单胞菌中表达人γ-干扰素通过发酵表达γ-IFN基因的埃希氏大肠杆菌商业地生产人γ-干扰素。蛋白质以不可溶及非活性形式在细胞质中表达。为了生产作为活性药学成份的重组多肽，必须回收、可溶、折叠和纯化干扰素。所有这些单元操作大大增加此蛋白的了产品成本(COGs)。人脾cDNA文库被用作模板，扩增γ-IFN cDNA，而不需要天然信号序列和克隆到埃希氏大肠杆菌和荧光假单胞菌表达载体中。在典型的20L发酵反应中荧光假单胞菌生产约4g/Lγ-IFN蛋白。可溶和不可溶部分的SDS-PAGE和Western分析表明大多数蛋白(95％)存在于可溶部分。图1表明从荧光假单胞菌可溶部分纯化的γ-IFN呈现与商售标准可比较的活性。图5和图9表明埃希氏大肠杆菌和荧光假单胞菌表达系统间γ-IFN表达的比较。
表9γ-IFN发酵总结(*与BSA标准比较)


人γ干扰素活性分析细胞系和培养基Hela细胞(商品号CCL-2)和脑心肌炎病毒(ECMV，商品号VR-129B)从American Type Culture Collection(Manassas，VA)得到。HeLa细胞在37℃，5％的CO2的条件下，在Eagles修饰的重要培养基中保持(Cellgro EMEM，Mediatech，Herdon，VA，USA)，该培养基具有10％胎牛血清(Gibco，Invitrogen，Carlsbad，CA，USA)。
纯化的hu-γIFN被如前所述的病毒抑制分析法分析(JA Lewis(1987)in Lymphokines and InterferonsA Practical Approach MJClemens et al.(eds.)(IRL Press Ltd，Oxford，England)。简言之，在96-孔微平板上以3×104每孔铺HeLa细胞。24小时后，将从荧光假单胞菌或埃希氏大肠杆菌重组hu-γIFN(from R & D Systems，Minneapolis，MN，USA)中分离的纯化的hu-γIFN以每孔0，0.01或0.05ng加入到三孔。用hu-γIFN予培养细胞24小时后，向每三孔以不同的稀释度加入ECMV。将细胞孵育5天，然后使用监控5-溴-2’-脱氧尿苷结合(catalogue no.1647229，Roche MolecularBiochemicals，Indianapolis，IN，USA)的细胞增殖ELISA检测细胞生存能力。结果以吸光度表示，吸光度越大，有分裂活性的细胞越多。
实施例3在细胞质中hGH的表达设计引物从人cDNA文库扩增人生长激素(hGH)。为了此研究，根据厂家的说明书，使用AmpliTaq聚合酶(Perkin Elmer)扩增hGH，使用上述质粒做模板，并使用引物ELVIrev和hgh-sig，PCR循环程序为95℃ 2分钟(95℃ 60秒，42℃ 120秒，72℃ 3分钟)25X。用Wizard PCR DNA纯化试剂盒(Promega)纯化得到的产物，用SpeI和XhoI限制酶(New England Biolabs)消化并克隆到pMYC1803相同的位点(见图3)。使用hgh-sigcorr引物和ELVIrev纠正在hGH扩增中发现的突变，重复PCR和克隆步骤。
用于克隆hGH的引物。

hGH的纯化20L发酵后，从埃希氏大肠杆菌和荧光假单胞菌细胞不可溶的部分纯化hGH，除在DEAE FF洗脱梯度使用0到0.5MnaCl而不是0.25MNaCl的步骤。
埃希氏大肠杆菌和荧光假单胞菌中人生长激素的表达从人垂体cDNA文库扩增cDNA编码的人生长激素。除去天然分泌信号序列，且N-端的蛋氨酸被连接到构建中用于微生物表达。对于埃希氏大肠杆菌的表达，含有hGH基因的pET25载体被转化到BL21(DE3)，其含有hGH转录所需的整合的T7聚合酶基因。荧光假单胞菌表达的研究在MB214株上进行，其含有整合的lad基因以控制从Ptac启动子的表达。两个表达系统均在20L发酵规模下分析。如表10所示，荧光假单胞菌(Pf)比埃希氏大肠杆菌(EC)每克干生物量生产更多的蛋白质(是其1.6X)。
表10hGH发酵总结(*与BSA标准比较)

细胞分馏法和SDS-PAGE分析表明hGH在两种表达系统的不溶部分存在(图4)。令人惊奇地，与埃希氏大肠杆菌相比，从荧光假单胞菌中纯化出大约7倍更多的hGH单体，尽管每克干生物量的蛋白产物仅有1.6倍的差别。
表11从埃希氏大肠杆菌和荧光假单胞菌中纯化的hGH的比较


实施例4周质中蛋白的表达分泌信号肽的特征通过形成和表达碱性磷酸酶(phoA)编码的序列基因组DNA融合发现荧光假单胞菌的分泌信号肽，在2004年11月22日提交的美国申请No.10/996,007中描述了。如下进一步定性了6种表达融合。
鉴别为phoA融合的分泌基因信号序列的切点通过与来自其他假单胞菌的相同的蛋白比较导出，使用SPScan程序(Menne等2000)。公认的脂蛋白的切点通过与信号肽酶II基序比较导出；信号肽酶II特异地切断脂蛋白酶的信号序列。使用SignaIP(用于分析公认信号肽的软件程序；可从丹麦技术大学生物序列分析中心获得，网址http//www.cbs.dtu.dklservices/SignalP/.)分析所有6个信号肽。也见，Nielson等(1997)Protein Engineering 101-6。在一些情况下，用补充的来源进一步定性信号肽的鉴别。此信息在表12中列出。
表12分泌信号肽的鉴别

为检测融合蛋白的phoA融合蛋白的蛋白印迹分析为了分析是否生产融合蛋白，用抗碱性磷酸酶抗体的蛋白印迹分析通过离心的全细胞部分(细胞质和周质)和没有细胞的培养基部分。在确定插入位点的5个菌株中，四个(公认的铜蓝蛋白，公认的碱性磷酸酶结合蛋白，公认的周质脂蛋白B，公认的Fe(III)结合蛋白)生产了具有预期大小的融合蛋白，一个(公认的oprE蛋白)生产了比预期小大约40kD的蛋白，一个(公认的Lys-Arg-Orn结合蛋白)生产了比预期小大约20kD的蛋白。
用SDS-PAGE分离蛋白并使用Xcell SureLockTM Mini-Cell和XCell II TM Blot Module(Invitrogen)，在40V，1小时的条件下转移到硝化纤维膜上。使用SuperSignal West HisProbeTM试剂盒(Pierce)提供的说明书进行蛋白印迹分析。
Pbp-hGH融合的构建、表达和定性将荧光假单胞菌磷酸结合蛋白分泌引导子融合至人生长激素(hGH)基因成熟结构域的N端，并检测表达和分泌。
从荧光假单胞菌一个克隆的pbp信号序列做模板用PCR扩增Pbp信号序列编码区，使用sig～pbp(gctctagaggaggtaacttatgaaactgaaacg)和pbp～hgh(gggaatggttgggaaggocacogcgttggc)引物，然后纯化凝胶。这使得生产含有pbp信号肽CDS和编码hGH成熟结构域5’端的编码序列的寡核苷酸片段。
从人垂体cDNA文库(Clontech，Palo Alto CA)PCR扩增cDNA编码的人生长激素，使用引物ELVlfor(agagaactagtaaaaaggagaaatccatggctacaggctcccggacgtcc)和ELVlrev(agagactcgagtcattagaagccacagctgccctccac)，其被设计成仅扩增hGH的成熟区，并克隆到pMYCl 803/Spel Xhol，形成pDOW2400。pDOW2400扩增成熟hGH基因，使用引物pbp_hgh_revcomp(gccaacgcggtggccttcccaaccattccc)和hgh-_rev(agagactcgagtcattagaagc cacagctgccctccacagagcggcac)，然后用Strataprep columns(Stratagene)纯化，除去引物和其他反应成分。为合成编码pbp-hGH融合的多聚核苷酸，联合两个PCR反应，用sig_pbp和hug_rev扩增以连接两个片段。用如上所述的Strataprep纯化预期的681bp的片段，Xbal和Xhol限制性消化，并连接至脱磷酸的pDOW1269/XholSpel以形成pDOW 1323-10，将pbp-hGH放置在与pMYC1803相同的载体的tac启动子的控制下，但是用pyrF选择性标记替代tetR四环素抗性标记基因。连接的混合物转化至MB101 pyrF proc laclQ′。使用上述方法通过Dow Chemical Company测序插入物。此融合的DNA和氨基酸序列分别在(表10)和(表11)表示。
首先在摇瓶规模下检测得到的菌株。用SDS-PAGE检测出预期大小的诱导带用于处理(processed)和未处理的(unprocessed)(分别为22.2kDa和24.5kDa)。大约一半的蛋白被处理(指定向周质的位置)，在处理的中有一半在可溶的部分，另一半在不可溶的部分。表达研究被放大到20-L规模的生物反应器中。库马斯染色的SDS-PAGE凝胶的密度学表明总hGH的18％是处理的和可溶的。菌株生产所有形式的hGH 3.2g/L；处理的及可溶的为0.6g/L。
pbp-scFv融合的构建、表达和定性磷酸结合蛋白的公认的24个氨基酸信号序列(例，包括Metl)被融合到gal2 scFv基因(gal2)的开框区，在+2氨基酸的(Ala)位置。见图8和图9。信号序列看起来是被处理的，显示出分泌到周质。而且，有分泌到培养基的，其中在不含细胞的培养上清中检测到蛋白。令人惊奇的是，融合到磷酸结合蛋白信号序列看起来改良了gal2 scFv在荧光假单胞菌中的表达。没有融合在氨基末端的分泌信号，就检测不到gal2scFv的表达。
Gal2的克隆用引物sig_pbp(上述)和pbp_gal2SOE rev(ctgcacctgggcggccaccgcgtt)进行PCR，其含有pbp_gal2SOE的反向互补(aaccgcggtggccgcccaggtgcag)，用编码荧光假单胞菌pbp分泌信号肽的质粒作模板。这得到了寡居核苷酸片段含有pbp信号肽编码序列(CDS)和gal2单链抗体(scAb or scFv)5′端的CDS。
用引物pbp_gal2SOE和scFv2rev(acgcgtcgacttattaatggtgatgatggtgatgtgcggccgcacgtttgatc)进行PCR，用gal2-编码的多核苷酸作模板。这得到了含有编码pbp信号肽3′端的CDS和编码gal2开框区(ORE)的多核苷酸片段。
纯化反应产物。用大约15ng每种产物作″模板″DNA，在进一步的PCR反应中使用引物sig_pbp_for和scFv2rev。这得到了一个具有融合至gal2编码序列的pbp信号肽CDS的核苷酸片段。信号序列的预期的-1氨基酸(即在计划切点前的最后一个氨基酸)被融合到gal2 scFv(Ala)的+2氨基酸。将得到的融合克隆至荧光假单胞菌载体pMYC1803，使其在Ptac启动子的控制下生产质粒和pDOW1123(pbpgal2)。将质粒转化到携带质粒pCN51-lacl的荧光假单胞菌株MB101(如2004年11月19日提交的美国申请No.10/994,138种所述的)。
的磷酸结合蛋白信号序列与gal2 scFv的融合磷酸结合蛋白信号序列被融合到单链抗体基因，并检测其分泌到周质和/或培养上清。
表13分泌的Gal2发酵总结(*与BSA标准比较)

首先在摇瓶规模检测发酵的菌株。通过在不溶的蛋白部分的SDS-PAGE检测未处理的和处理的gal2诱导带的预期大小(29kDa和27kDa)(数据末显示)。表达研究放大到20L发酵的规模。再次，SDS-PAGE分析表明大部分诱导的蛋白存在于不溶的蛋白质部分。
蛋白印迹分析也表明一些处理的gal2存在于pbpgal2(pDOW1123)的可溶蛋白部分。从携带pDOW 1123的菌株制备的周质部分的蛋白印迹分析(使用Epicentre periplast kit)表明存在可溶的gal2蛋白。
使用Qiagen Ni-NTA方法，重组gal2 scFv被从摇瓶实验的细胞提取液中分离，然后如P.Martineau et al.，J Mol.Biol.280117-127(1998)种所述折叠。发现此抗体在ELISA分析中有抗β-半乳糖苷酶的活性。
权利要求
1.一种增加重组哺乳动蛋白表达的方法，包括a.用编码重组哺乳动物蛋白的核苷酸转化荧光假单胞菌宿主细胞；和b.在允许重组哺乳动物蛋白表达的条件下生长该细胞；其中，当在基本上可比较的条件下与埃希氏大肠杆菌表达系统的该蛋白的表达水平比较时，该蛋白在一个增加的水平上被表达。
2.如权力要求1的方法，其进一步包括分离重组哺乳动物蛋白。
3.如权力要求2的方法，其进一步包括基本上提纯该重组哺乳动物蛋白。
4.如权力要求1的方法，其中所述重组哺乳动物蛋白以可溶的形式存在于该宿主细胞中。
5.如权力要求1的方法，其中该重组哺乳动物蛋白以不可溶的形式存在于宿主细胞中。
6.如权力要求1的方法，其中该重组哺乳动物蛋白以活性形式存在于该宿主细胞中。
7.如权力要求1的方法，其中该重组哺乳动物蛋白是人的肽。
8.如权力要求1的方法，其中该重组哺乳动物蛋白以超过总细胞蛋白的大约5％被生产。
9.如权力要求1的方法，其中该重组哺乳动物蛋白以超过总细胞蛋白的大约10％被生产。
10.如权力要求1的方法，其中该重组哺乳动物蛋白以至少10g/L的浓度被生产。
11.如权力要求1的方法，其中该重组哺乳动物蛋白以至少20g/L的浓度被生产。
12.如权力要求1的方法，其中该重组哺乳动物蛋白以至少40g/L的浓度被生产。
13.一种在荧光假单胞菌宿主细胞中生产重组哺乳动物蛋白的方法，其包括a.用编码重组哺乳动物蛋白的核苷酸转化宿主细胞；b.在允许一种重组哺乳动物蛋白表达的条件下生长一种细胞；c.分离该重组哺乳动物蛋白。
14.如权力要求13的方法，其进一步包括基本上提纯的该重组哺乳动物蛋白。
15.如权力要求13的方法，其中该重组哺乳动物蛋白以可溶形式存在于该宿主细胞中。
16.如权力要求13的方法，其中该重组哺乳动物蛋白以不可溶形式存在于该宿主细胞中。
17.如权力要求13的方法，其中该重组哺乳动物蛋白以活性形式存在于该宿主细胞中。
18.如权力要求13的方法，其中该重组哺乳动物蛋白是人的肽。
19.如权力要求13的方法，其中该重组哺乳动物蛋白的质量介于至少为1kD至大约500kD之间。
20.如权力要求19的方法，其中该重组哺乳动物蛋白的质量大于大约30kD。
21.如权力要求13的方法，其中该重组哺乳动物蛋白以大于细胞总蛋白的大约5％被生产。
22.如权力要求13的方法，其中该重组哺乳动物蛋白以大于细胞总蛋白的大约10％被生产。
23.如权力要求13的方法，其中该重组哺乳动物蛋白以至少10g/L的浓度被生产。
24.如权力要求13的方法，其中该重组哺乳动物蛋白以至少20g/L的浓度被生产。
25.如权力要求13的方法，其中该重组哺乳动物蛋白以至少40g/L的浓度被生产。
26.在宿主细胞中生产重组人蛋白的方法，其包括a.用编码重组人肽的核苷酸转化宿主细胞；b.在允许重组人肽表达的条件下生长该细胞；其中该宿主细胞是荧光假单胞菌。
27.如权力要求26的方法，其中该重组人蛋白以可溶的形式存在于该宿主细胞。
28.如权力要求26的方法，其中该重组人蛋白以活性形式存在于该宿主细胞。
29.一种含有编码重组人肽的核苷酸的荧光假单胞菌细胞。
30.如权力要求29的细胞，其中该重组人肽被表达。
全文摘要
本发明是在假单胞菌中表达重组哺乳动物蛋白的产量的改良方法，特别是在荧光假单胞菌生物体中。该方法在可比较的环境下，比已知的表达系统如大肠杆菌提高了哺乳动物蛋白的产量，特别是人或人衍生蛋白的产量。本发明还提供了生产分离的哺乳动物，特别是人蛋白质的改良的方法。
文档编号C12N1/21GK1910281SQ200580002645
公开日2007年2月7日 申请日期2005年1月18日 优先权日2004年1月16日
发明者D·M·雷托拉克, C·H·斯夸尔斯, D·C·沃特金斯, F·H·格特纳, S·L·李, R·舒特尔 申请人:陶氏环球技术公司