专利名称：基于粒子的定向组合的生物检测器的制作方法
联邦政府资助的研究或开发本申请的主题部分由能源部(DEFG02-01 ER63179)和国家科学基金(DMR-0117792)资助。政府对本发明享有一些权利。
背景技术：
除了蛋白质，最近几年内发现核酸也具有催化活性。具有催化活性的核酸可以是具有催化性的DNA/RNA，还称为DNA-酶/RNA-酶、脱氧核糖核酸酶/核糖核酸酶、以及DNA酶/RNA酶。具有催化活性的核酸也可以包含修饰的核酸。基于核酸的酶的催化活性总是依赖于某些辅因子(例如金属离子)的存在。因此，对于这些辅因子的基于核酸酶的生物检测器(例如，对于金属离子的生物检测器)可以基于相应核酸酶的活性进行设计。另一方面，核酸可以被选择以连接到大范围的具有高亲合力和特异性的分析物。这些连接核酸被称为适配子(aptamer)。
适配子为识别具有高亲合力和特异性靶标的核酸(如，DNA或RNA)(Ellington and Szostak 1990，Jayasena 1999)。适配酶(aptazyme)(也称作变构DNA/RNA酶或变构(脱氧)核糖核酸酶)是由效应子(靶标分子)调节的DNA/RNA酶。它们通常包含识别效应子的适配域和催化域(Hesselberth et al.2000，Soukup andBreaker 2000，Tang and Breaker 1997)。效应子可通过适配域和催化域之间的特异性相互作用降低或者提高适配酶的催化活性。因此，适配酶的活性可用来检测效应子的存在及数量。这种方法已用来选择和设计用于诊断及检测目的的适配酶检测器(Breaker 2002，Robertson and Ellington 1999，Seetharaman et al.2001)。DNA酶和DNA适配酶是用于检测器开发的最具吸引力的候选物，因为DNA比RNA在合成上要低廉得多并且更稳定。另外，可利用通过引入靠近DNA酶的催化核心的适配子基序的设计DNA适配酶的一般方法(Wang et al.2002)。高裂解活性需要效应子分子的存在，该分子连接到适配子基序后可变构调节适配酶的催化核心部分的活性。
体外选择方法可用来获取用于大范围的具有特别高的亲合力、并且具有在皮摩尔范围内那样高的离解常数的靶标分子的适配子(Brody and Gold 2000，Jayasena 1999，Wilson and Szostak 1999)。例如，已开发了适配子用来识别金属离子，如Zn(II)(Ciesiolka et al.1995)和Ni(II)(Hofmann et al.1997)；核苷酸，如三磷酸腺苷(ATP)(Huizenga and Szostak 1995)；和鸟嘌呤(Kiga et al.1998)；辅因子，如NAD(Kiga et al.1998)和黄素(Lauhon and Szostak 1995)；抗生素，如紫霉素(Wallis et al.1997)和链霉素(Wallace andSchroeder 1998)；蛋白质，如HIV反转录酶(Chaloin et al.2002)和丙型肝炎病毒RNA依赖性RNA聚合酶(Biroccio et al.2002)；毒素，如霍乱整体毒素(cholera whole toxin)和葡萄球菌肠毒素B(Bruno and Kiel 2002)；以及细菌芽孢，如炭疽(Bruno and Kiel1999)。与抗体相比，基于DNA/RNA的适配子更容易获得并且生产成本更低，因为它们可在体外短时期内获得(几天到几个月)并且成本有限。另外，DNA/RNA适配子可多次进行变性和复性而不丧失其生物识别能力。这些独特的性质使得适配子成为用于设计高灵敏度和选择性的生物检测器的理想平台(Hesselberth et al.2000)。
为了分析DNA/RNA酶或适配酶的活性，使用可检测的标记物。但是，很多的这些标记物存在显著的缺陷。放射性同位素招致安全和处理方面的问题，而荧光团可能会发生光褪色并且还可能抑制想要分析的生物活性；有机着色剂，例如用在可卡因检测适配子系统中的有机着色剂(Stojanovic and Landry，2002)对于视觉检测需要高浓度并且只有经过昂贵的反复试验之后才能与特定的适配子相匹配。
金属粒子克服了所有这些难题。它们可以以很小(纳摩尔)的量与适配子用作检测剂而没有任何有机着色剂的缺点。在基于利用金属粒子用于颜色检测的适配子的检测器中，核酸基质被适配酶(在效应子的连接后)的裂解可通过颜色变化而被检测到。
通常，基于DNA/RNA酶或适配酶的检测器具有三个部分(1)核酸酶(在下面的描述中，核酸酶指的是DNA/RNA酶和适配酶)和辅因子，如催化基质裂解的金属离子；(2)用于核酸酶的核酸基质，其中基质序列的内部互补于部分酶序列；以及(3)连接到互补于基质的3’-和5’-端的多核苷酸的粒子。
为了检测目标辅因子或效应子，多核苷酸的互补部分(多核苷酸连接到互补于基质链的3’-和5’-端的粒子，核酸酶的3’-和5’-端互补于内部基质链序列)在怀疑含有靶标辅因子或效应子的样品存在下进行退火。如果不存在辅因子或效应子，那么适配酶无活性或者表现出的活性大大降低，导致没有或很少的基质裂解和由此导致的粒子聚集。如果存在辅因子或效应子，那么酶具有活性并裂解基质，并阻止聚集形成，因为粒子之间的连接被酶催化的裂解所破坏。
表1举例说明了这样的系统。
*当金粒子用于检测时。
在金粒子的情形下，聚集态显示为蓝色，而分散态(或非聚集态)为红色。作为辅因子或效应子的靶标分析物的存在可基于检测器系统颜色的出现被检测。
由于裂解的程度反映到颜色变化的程度，所以可以量化靶标辅因子或效应子的浓度。例如，简单的光谱测定法可用于灵敏度检测。不仅颜色改变可用于检测和量化，而且可使用其他裂解结果，如沉淀。通过用识别预选效应子的适配酶替换适配子区，用于任何希望的效应子的比色检测器可容易地被制成和使用。
基于前面的工作，设计成了基于金纳米粒子的DNA酶定向组合的用于Pb(II)的比色生物检测器和基于金纳米粒子的适配酶定向组合的用于腺苷的比色生物检测器(参见，例如，系列号为09/605,558；10/144,094；10/144,679；以及10/384,497的美国专利申请)。尽管具有高度灵敏度和选择性，但是这类分析检测器需要加热到高于50℃达几分钟并在2小时内缓慢冷却至室温以用于检测。
发明内容
在第一方面，本发明涉及用于检测效应子或辅因子的检测器系统，包括(a)核酸酶，包括辅因子的结合部位和可选地效应子的结合部位；(b)用于核酸酶的基质，包括第一多核苷酸；(c)第一组粒子，包括第二多核苷酸，其中该多核苷酸在3’端连接到该粒子；以及(d)第二组粒子，包括第三多核苷酸，其中该多核苷酸在5’端连接到该粒子。第一多核苷酸包括或为至少部分互补于第二多核苷酸，并且第一多核苷酸包括或为至少部分互补于第三多核苷酸。
在第二方面，本发明涉及用于检测效应子或辅因子的检测器系统，包括(a)核酸酶，包括辅因子结合部位和可选地效应子结合部位；(b)用于核酸酶的基质，包括第一多核苷酸；(c)第一组粒子，包括第二多核苷酸；以及(d)第二组粒子，包括第三多核苷酸。第一多核苷酸包括或为至少部分互补于第二多核苷酸，并且第一多核苷酸包括或为至少部分互补于第三多核苷酸。第二组粒子具有至少20nm的直径。
在第三方面，本发明涉及检测样品中效应子和辅因子的方法，包括混合在一起的至少(a)核酸酶，包括辅因子结合部位和可选地效应子结合部位；(b)用于核酸酶的基质，包括第一多核苷酸；(c)第一组粒子，包括第二多核苷酸；(d)第二组粒子，包括第三多核苷酸；以及(e)样品；以形成混合物。第一多核苷酸包括或为至少部分互补于第二多核苷酸，并且第一多核苷酸包括或为至少部分互补于第三多核苷酸。不用加热，该混合物在形成混合物的10分钟内，产生显示样品中存在效应子或辅因子的颜色变化。
图1(A)包括酶链(17E)和基质链(17DS)的“8-17”DNA酶体系的二级结构。(B)在Pb(II)存在下，由17E对17DS的裂解。(C)金粒子的DNA酶定向组合及其用作用于诸如Pb(II)的金属离子的生物检测器的示意图。
图2(A)在“8-17”DNA酶平台上构建的腺苷适配酶的一级结构和提议的二级结构。(B)腺苷比色检测的图示。
图3DNA连接的金粒子的两种排列(alignment)方式。(A)“头对尾”排列的粒子，其中，只需要一种硫醇修饰的DNA。(B)“尾对尾”排列的粒子。
图4粒子排列和粒子大小对颜色变化速率的影响。
图5一种Pb2+比色生物检测器，其中，粒子的直径为～35nm并且粒子以“尾对尾”的方式排列。
图6一种新的Pb2+检测器系统。(A)35nm的金粒子在不同时间的消光(extinction)光谱。(B)基质浓度对聚集速率的影响。(C)NaCl浓度对聚集速率的影响。(D)17E浓度对聚集速率的影响。(E)粒子在不同pH值缓冲液中的聚集。(F)聚集10分钟后的消光比率。
图7新Pb2+检测器的灵敏度和选择性。(A)在不同Pb2+浓度下的金粒子聚集的动力学。(B)在开始后10分钟的消光比率。
图8一种新设计的基于适配酶的腺苷检测器。反应A不存在腺苷下的蓝色聚集的形成。反应B基质在存在腺苷下的裂解。反应C裂解的基质不能组合金粒子，而产生红色、分开的粒子。
图9(A)粒子的基质浓度依赖性聚集。(B)基质被适配酶裂解的动力学。(C)基于适配酶的检测器对腺苷的灵敏度和选择性。
具体实施例方式
本发明避免了现有DNA酶-和适配酶-金属粒子检测器系统需要的加热，使得这些检测器不仅可在实验室使用，而且可由用户在其家中使用，或者由本领域技术人员使用。本发明利用下面的影响基于粒子的比色生物检测器性能的发现(1)将粒子的排列(alignment)从头对尾改变为尾对尾；(2)利用更大的粒子；以及(3)控制离子强度、适配子浓度和pH。
粒子的聚集受其相互之间的排列的影响。粒子可用两种方式进行排列，即“头对尾”或“尾对尾”(图3)。在早期的基于DNA酶的Pb2+检测器中，例如，粒子以“头对尾”方式排列。如果粒子以“头对尾”方式排列，只需要一种硫醇修饰的DNA将DNA连接至粒子。在这种构型中，粒子很难聚集，可能是由于空间位阻效应。因此需要加热和冷却来促进粒子的组合。但是，现在已发现，当使用“尾对尾”排列时，粒子可在环境温度下聚集(图5)。对于“尾对尾”排列的粒子，3’-和5’-硫醇修饰的多核苷酸都需要。
粒子聚集物的颜色主要由聚集物的大小所控制。因此，聚集速率相等，则利用较大粒子的颜色变化速率增加。如在下面的实施例中所描述的，当使用13nm和35nm直径的粒子的混合物时，颜色变化的速率比仅用13nm直径的粒子的颜色变化速率更快。如果仅用35nm直径的粒子，颜色变化速率进一步增大。
溶液的离子强度也影响系统的性能。较高的盐浓度有利于聚集，可能是由于盐减少带负电的多核苷酸链之间的静电排斥。尽管只需要基质链来连接两个粒子，但是，在没有酶链存在下，基质由于太“松软”而不能组装粒子。因此，酶浓度是很重要的参数。
pH也影响聚集。pH的影响可能是由于多核苷酸碱基的质子化作用，其影响碱基配对并由此影响聚集的速率。
定义“辅因子”是在核酸酶催化反应的催化过程中涉及的离子或分子并且为催化活性所需。
“效应子”是当其结合到具有效应子结合部位的酶时，能够增强或抑制酶催化作用的分子。“效应子结合部位”可以是“特异的”，即，在其他效应子分子存在的情况下，只结合一种效应子分子。效应子结合部位特异性的实例是当许多其他类似分子，如胞苷、鸟苷和尿苷存在时，只结合腺苷分子。可选地，效应子结合部位可以是“部分”特异的(只结合一类分子)、或“非特异的”(具有分子混杂性)。效应子的实例包括环境污染物，如氮肥、农药、二氧芑、酚类、或2，4-二氯苯氧基乙酸；重金属离子，如Pb(II)、Hg(II)、As(III)、UO2(II)、Fe(III)、Zn(II)、Cu(II)、或Co(II)；生物分子，如葡萄糖、胰岛素、hCG-激素、HIV或HIV蛋白质；化学和生物恐怖剂，如炭疽、天花、或神经毒气；爆炸物，如TNT或DNT；药物，如可卡因或抗生素。
“核酸酶”是指主要包含核酸的酶，如核糖核酸酶(RNA酶)、脱氧核糖核酸酶(DNA酶)、以及适配酶。核酸可以是天然的、非天然的或修饰的核酸。也包括肽核酸(PNA)。核酸酶需要“辅因子”用于有效的基质裂解和/或特异性效应子结合。通常的辅因子包括Mg(II)、Ca(II)、Zn(II)、Mn(II)、Co(II)和Pb(II)。
“多核苷酸”指的是具有至少两个或多个核苷酸的核酸序列。多核苷酸可包含天然存在的核苷酸和合成的核苷酸。该术语也包括PNA分子。
“灵敏度”指的是能被检测器检测的辅因子或效应子浓度的最小增加。
“检测限”指的是分析装置的检测限。在本发明基于DNA酶和适配酶的检测器上下文中，检测限指的是检测器能从背景中区分的辅因子或效应子的最低浓度。
“碱基配对”指的是在较低严格性条件下，多核苷酸与核苷酸形成至少一个氢键的能力。该核苷酸可以是第二多核苷酸的部分或在第一多核苷酸内存在的核苷酸。当第一多核苷酸能够与第二多核苷酸形成至少一个氢键时，多核苷酸部分地互补于第二多核苷酸。为了成为部分互补，多核苷酸可具有这样的区其中碱基对不可以被形成环、茎-环、以及其他二级结构的这些区形成环绕。
“适配子”指含有效应子结合部位的多核苷酸。“效应子结合部位”可以是“特异性的”，即，在其他效应子分子存在下，只结合一种效应子分子。效应子结合部位特异性的实例为，当在许多其他类似分子，如胞苷、鸟苷和尿苷存在时，只结合腺苷分子。可选地，效应子结合部位可以是“部分”特异的(只结合一类分子)、或“非特异的”(具有分子混杂性)。
“适配酶”指的是包括结合效应子的适配子区的核酸酶。效应子的结合可增强或抑制催化作用。
具有效应子(或效应物)结合部位的核酸酶发现或开发了大量具有不同催化活性的核酸酶(表1和表2)。对于催化功能，该酶通常依赖于一种或多种辅因子。体外选择可用来“增强”对特殊离子的选择性和灵敏度。催化分子缔合(连接(ligation)、磷酸化作用、以及形成酰胺结合)或分解(裂解或转移)的核酸酶在本发明中尤其有用。
使用在效应子存在下催化核酸裂解的核酸酶。该核酸酶可以是RNA(核糖核酸酶)、DNA(脱氧核糖核酸酶)、DNA/RNA杂化酶、或肽核酸(PNA)酶。PNA包含聚酰胺骨架(主链)和核苷碱基(可从例如Biosearch公司(Bedford，MA)获得)。可使用的核糖核酸酶包括第I组和第II组内含子、细菌核糖核酸酶P的RNA组分、锤头结构、发卡结构、肝炎δ病毒和脉孢菌属VS(Neurospora VS)核糖核酸酶。还包括体外选择的核糖核酸酶，如以前分离出的那些核糖核酸酶(Tang and Breaker 2000)。核糖核酸酶趋于没有脱氧核糖核酸酶稳定，因此，优选脱氧核糖核酸酶。具有扩大的化学官能度的脱氧核糖核酸酶也是理想的(Santoro et al.，2000)。
表1由从体外选择实验分离的核糖核酸酶催化的反应。
a从体外选择实验分离的核糖核酸酶催化的反应。
Kcat/kuncat为对未催化反应的速率提高。
表2通过体外选择分离出的脱氧核糖核酸酶
bKmax是在优化条件下获得的最大速率常数。
制造核糖核酸酶和脱氧核糖核酸酶的方法包括化学寡核苷酸合成、聚合酶链反应(PCR)、DNA克隆和复制。优选地，核酸酶为DNA/RNA杂交体和PNA。还可使用含有修饰的碱基、磷酸酯(盐)、或糖的核苷；在一些实例中，这些修饰的核苷酸更有利于稳定性或提供效应子特异性。修饰的碱基的实例包括次黄嘌呤核苷、水粉蕈素、2-氨基嘌呤核苷、N7-脱氮腺苷、以及O6-甲基鸟苷(Earnshaw and Gait 1998)。修饰的糖和磷酸酯(盐)包括2’-脱氧核苷、脱碱基、丙基、硫代磷酸酯(盐)、以及2’-O-烯丙基核苷(Earnshaw and Gait 1998)。
将核酸链从包括酶的链裂解开的核酸酶为反式作用酶。利用反式作用酶允许多轮(multiple rounds)基质裂解，因为移走了酶催化产物。这样的核酸酶的实例是17E(SEQ ID NO1)；对应的基质是17DS(SEQ ID NO2，r表示单个核糖核苷酸)；两者都表示在表3A中并在图1中描述。包括酶链(17E)和基质链(17DS)的“8-17”DNA酶系统的二级结构在图1a中进行描述。裂解部位用箭头指示。除了在裂解部位(rA)的核糖核苷腺苷外，所有其他核苷为脱氧核糖核苷。在存在Pb(II)的情况下，酶链裂解基质链(图1b)。因此，如图1c所示的，该酶链和基质链可用于DNA酶定向的金粒子的组合和用在作为对诸如Pb(II)的金属离子的生物检测器中。在这个系统中，17DS在3’和5’端都延长了12个碱基，其互补于连接到13nm金粒子的12-merDNA(DNAAu)。还在表3B中给出了其他实例。
表3A DNA酶和基质
c“r”表示单个核糖核苷酸图3B 基于RNA/DNA的适配子和RNA/DNA酶
定向诱发突变可用来改变核酸酶或其基质的一种或多种性质。利用17E和17DS作为实例，可能希望改变杂交酶和基质的两臂的亲合力。“臂”是指图1中显示Watson-Crick碱基配对的那些区域。为了改变亲合力，可以改变臂的长度。增加臂长度就增加了Watson-Crick碱基配对的数量，从而增大亲合力；减小臂长度就降低了亲合力。降低臂的亲合力有利于将基质从酶除去，由此可以进行更快的酶促周转。
另一种降低亲合力的方法包括在酶和基质之间产生错配。可选地，可改变臂的G-C含量。应监控任何定向变化的影响以便确保酶保持希望的活性，包括离子灵敏度和选择性。例如，为了确保突变的酶保持对腺苷的灵敏度和选择性，要进行试验以确定突变的酶在腺苷存在下是否保留反应活性(灵敏度)并在其他效应子存在下是否保持其较低水平的活性(选择性)。
适配子的体外选择结合希望效应子的适配子和适配酶可通过体外选择进行分离。体外选择是通过多次循环的选择和放大从大量序列变异体中分离出具有某些功能的RNA或DNA分子的方法(Chapman and Szostak1994，Joyce 1994)。具有最大化活性或新的催化能力的DNA酶和RNA酶、以及适配子可利用例如通过指数富集配体的系统进化方法(SELEX)获得(Tuerk and Gold 1990)。
体外选择一般用通常含有1013-1016个序列变异体的随机序列的大量收集(池)进行启动。一组利用标准亚磷酰胺化学的退化多核苷酸的化学合成可用来产生这样的随机池。将4种核苷(腺苷、胞嘧啶、鸟嘌呤、胸腺嘧啶)的3’-亚磷酰胺化合物预先混合并用来合成多核苷酸；随机性通过控制这4种亚磷酸酰胺的比率产生。当将亚磷酰胺常数控制在特定点时，还可实现偏向性。其他用于形成随机DNA库的方法包括诱变的聚合酶链反应(PCR)和模板定向的诱变(Cadwell and Joyce 1992，Cadwell and Joyce 1994，Tsang andJoyce 1996)。如果希望进行RNA分子的体外选择，那么首先通过体外转录将随机DNA库转变为RNA库。
然后对随机库进行筛选，选出具有希望的诸如结合靶标效应子功能的分子并分离出来。可利用亲合柱层析(例如，利用靶标效应子)、凝胶电泳、或标记的反应中间体的选择性放大来实现分离。将所选的分子利用例如对DNA的PCR、或对RNA的等温放大反应进行放大。然后将这些所选的、放大的分子利用例如诱变PCR进行突变(重新引入多样性)，以选择具有可能更高活性的分子。重复进行选择、放大和突变这3个步骤，经常增加选择的严格性，直至具有希望活性的序列在池中占优势。
从体外从随机序列分离的新核酸酶具有扩大的RNA和DNA的全部催化性能(表1)。相比于核糖核酸酶，脱氧核糖核酸酶催化较少类型的反应(表2)。大多数脱氧核糖核酸酶的催化速率(Kcat)比得上核糖核酸酶催化相同反应的催化速率。在某些情形下，核酸酶的催化效率(Kcat/Km)甚至超过蛋白酶的催化效率(Santoro andJoyce 1997)。
体外选择可用来改变现有核酸酶的离子特异性或结合亲合力或用来获得对希望基质具有特异性的核酸酶。例如，用于优化锤头状核糖核酸酶活性所需的Mg2+浓度已经利用体外选择降低了，以便在生理条件下提高酶性能(Conaty et al.1999，Zillmann et al.1997)。
通常通过体外选择开发的用于特定辅因子核酸酶在其他分子存在下具有活性。例如，通过体外选择开发的17E脱氧核糖核酸酶具有在Zn2+存在下的活性。但是，该酶在存在Pb2+的情况下比存在Zn2+的情况下表现出更大的活性。尽管是在寻找Zn2+相关活性的过程中产生的，但是17E可用作用于Pb2+的灵敏度和选择性的检测器。为了产生具有更大选择性的核酸酶，可引入阴性(negative)选择步骤(Peter J.Bruesehoff，Jing Li，Anthony J.Augustine III，And Yi Lu，“Improving Metal Ion Specificity During In Vitro Selection of CatalyticDNA”Combinatorial Chemistry and High Throughput Screening 5，327-355(2002))。
其他的多核苷酸序列也是有用的，包括于2000年6月27日提交的系列号为09/605,558的美国专利申请中所述的那些多核甘酸序列，其内容以引用方式结合于此作为参考(Lu and Li)。
腺苷检测器图2A中所示的适配酶对腺苷是特异性的。适配酶的催化核心由“8-17”DNA酶修改而得并优化为在Pb2+存在的情况下具有高活性。DNA酶的3’-端连接到腺苷适配子基序。因此，腺苷的存在可以促进形成活性三级DNA酶结构。在基于适配酶的检测器中，这种复合体促进基质链在单个核糖-腺苷(ribo-adenosine)位置的裂解。在没有腺苷的情况下，即使这三个组分仍能通过Watson-Crick碱基配对聚集在一起，但是裂解活性显著降低。还示出了杂合到适配酶两端的两个DNA功能化的13nm直径的金粒子。
如图2B所图解描述的，基质链(自由基质和杂化有酶以及调节子链的基质)可用作DNA功能化的金粒子的连接子，以形成具有蓝颜色的聚集(反应A)。在腺苷和金属离子存在下，该基质可被裂解(反应B)。裂解的基质可不再用作粒子的连接子并且颜色保持为红色(反应C)。
在这类检测器中，基质、酶和调节子链的存在还不足以在室温下形成聚集。在不加热情况下，很难杂合所有这三种链并用作连接子。为了解决这个问题，引入另一个DNA链(“腺苷-连接子”(Ade-linker))(图8)。腺苷-连接子的作用是高效率地杂合基质链并促进粒子在室温下的聚集。杂合后，腺苷-连接子形成具有10个核苷酸的凸起二级结构。该凸起阻止腺苷-连接子利用裂解的基质作为连接子而组合粒子。具有该凸起，即使部分腺苷-连接子杂合到裂解的基质，但是整个结构仍是松软的，而不能组合粒子。
如果不存在腺苷，那么适配酶的基质杂合腺苷-连接子，并且杂合的产物可组合(assemble)粒子而形成蓝色聚集(反应A)。在腺苷存在下，基质链被裂解(反应B)，而裂解的基质不能组合金粒子，产生红色的、分离的粒子(反应C)。
用互补于核酸酶基质3’和5’端的多核苷酸标记的粒子对于用来记录酶活性的检测器，可检测的变化必须基于在多核苷酸连接的粒子的聚集中发生的变化。另外，粒子的组成必须是不干扰基质裂解。粒子可由例如金属、半导体和磁性材料；ZnS、ZnO、TiO2、AgI、AgBr、HgI2、PbS、PbSe、ZnSe、CdTe、In2S3、In2Se3、Cd3P2、Cd3As2、InAs和GaAs(例如，(Mirkin et al.2002))构成；并且优选由金粒子(可商业获得；例如，Amersham Biosciences；Piscataway，NJ and Nanoprobes，Inc；Yaphank，NY)所构成。还可使用非金属粒子，包括陶瓷和聚合物，如聚苯乙烯胶乳粒子或含有着色剂的胶乳粒子。优选粒子具有至少20nm，更优选至少30nm，甚至更优选至少35nm，包括15-500nm、20-200nm以及35-100nm的平均粒径。
优选具有至少35nm直径的金胶粒。金胶粒对引起其强烈颜色的波段具有高的消光系数。这些颜色随粒子大小、浓度、粒子间间距、聚集程度以及聚集形状而变化。例如，由连接至粒子的多核苷酸的杂合促进的金粒子的聚集导致产生肉眼可见的直接的颜色变化(参见，例如，(Mirkin et al.2002)。
粒子、多核苷酸或这两者衍生(derivatized)用于连接。例如，用烷基硫醇在其3’-或5’-端衍生出来的多核苷酸容易连接到金粒子(Whitesides 1995)。将3’硫醇DNA连接至平整金表面的方法还可用来将多核苷酸连接至粒子(Mucic et al.1996)。烷基硫醇衍生的粒子可用来连接多核苷酸。其他用于将多核苷酸连接至固体表面的功能团包括将多核苷酸连接至金表面的硫代磷酸酯(Beebe andRabke-Clemmer 1995)、用于将多核苷酸连接到硅石和玻璃表面的取代的烷基硅氧烷、氨基烷基硅氧烷以及巯基烷基硅氧烷(Grabar et al.1995)。在5’-硫代核苷或3’-硫代核苷终止的多核苷酸还可用于将多核苷酸连接至固体表面。连接多核苷酸的一些方法在表4中示出。
表4 用于将多核苷酸连接至粒子的系统
粒子排列为了使粒子以“尾对尾”方式进行排列，将粒子以下面的方式进行功能化。在基质5’部位结合到基质的粒子用在其3’端连接至粒子的互补多核苷酸链进行功能化，而在基质3’部位结合到基质的粒子用在其5’端连接至粒子的互补多核苷酸链进行功能化。基质-粒子复合体具有图3B中所示的结构，而不是图3A中所示的结构。
优选地，将基质进行修饰，例如通过用大量用作“粘性末端”的碱基延长3’-和5’-端，以有利于对连接至粒子的互补多核苷酸链进行退火。基质修饰使得无需抑制核酸酶/基质相互作用下形成包括基质连接的粒子的复合体。但是，对含有对与核酸酶的相互作用不重要的区的基质，修饰不是必须的。
粒子还可能直接连接到基质，或可选地，基质一端连接至粒子，而另一端互补于连接粒子的多核苷酸。因此，互补多核苷酸是任选的。
为了检测目标辅因子或效应子，核酸酶、基质以及标记的粒子在怀疑含有酶对其敏感的靶标辅因子或效应子如腺苷的样品存在下进行组合(图3)。在辅因子或效应子存在下，酶裂解基质而阻止聚集形成。
粒子的不同聚集状态导致产生不同颜色。例如，较大程度的金粒子聚集显示出蓝色而较小程度的粒子聚集显示出红色。而且，基质裂解的量和由此聚集的程度依赖于辅因子或效应子的浓度。较低辅因子或效应子的浓度导致只有部分产生单个粒子和聚集体的混合物的基质裂解，使得可以进行半定量或定量化验分析。可将颜色差异放大以提高灵敏度。对于量化检测，分析混合物的光谱是确定的。除了颜色变化，粒子聚集的形成、或聚集粒子的沉淀也可被检测。颜色变化可用肉眼或光谱法进行观察。聚集的形成可通过电子显微镜或通过比浊法进行观察；聚集粒子的沉淀可用肉眼或显微镜进行观察。
为了方便颜色变化的观察，可在对比色背景下观察颜色。当使用金粒子时，通过将杂合溶液的样品点在固体白色表面(如硅或铝TLC平板、滤纸、硝酸纤维素膜、以及尼龙膜)上并使斑点干燥有利于颜色变化的观察。最初，斑点保持杂化体溶液的颜色(其范围为在没有聚集存在下的粉红色/红色；至有金粒子聚集时的紫红色/紫色)。通过干燥，如果在打点之前存在聚集，则显现出蓝色斑点；如果发生分散，则显现出粉红色斑点。蓝色和粉红色斑点稳定并且在随后的冷却或加热或经过一段时间也不会变化。这提供了方便的、永久的试验记录。观察颜色变化无需其他步骤。
可选地，可对通过将使用35nm的金粒子的样品在玻璃纤维过滤器上打点而将分析结果直观化。在用水冲洗后，观察到包括聚集的斑点。用于直观化分析结果的其他方法也是可以利用的(Mirkin etal.2002)。
靶标辅因子或效应子可在各种样品，包括生物样品中进行检测。含有已知量的辅因子或效应子的标准物可与未知样品一起进行分析，并将颜色变化进行对比。可选地，类似于使用pH试纸的那些方法，可提供标准比色图表。
试剂盒本发明还提供用于检测如辅因子或效应子的分析物的试剂盒。在一个实施例中，试剂盒包括至少一个容器，容器装有至少两类具有连接至其的多核苷酸的粒子；基质，其具有至少三个部分，第一部分为第二部分的5’端，第二部分在分析物存在下由核酸酶所裂解，和第三部分为第二部分的3’端；以及核酸酶。连接至第一粒子的多核苷酸具有互补于至少基质第一部分的序列的序列并在其5’端连接至粒子。连接第二粒子的多核苷酸具有互补于至少基质第三部分的序列的序列并在其3’端连接至粒子。
当提供试剂盒后，组合物的不同组分可在分开的容器中进行包装并在使用之前直接进行混合。这种组分分别包装使得活性组分可长期保存。例如，多种具有连接至其上的多核苷酸的粒子的一种、基质、以及核酸酶用独立的容器提供。
包括在试剂盒中的试剂可以用任何类型的容器提供，该容器可以保持不同组分的有效期并且不会被容器的材料所吸收或改变。例如，密封的玻璃安瓿瓶可容纳多种试剂中的一种、或封装在中性、非反应性气体如氮气下的缓冲剂。安瓿瓶可由任何合适的材料如玻璃；诸如聚碳酸酯、聚苯乙烯等的有机聚合物；陶瓷、金属或任何其他通常用来盛装类似试剂的材料所构成。合适容器的其他实例包括可用与安瓿瓶类似的物质制成的简易瓶；和可包含金属薄片状内部结构，如铝或合金的包装物。其他容器包括试管、小瓶、烧瓶、瓶、注射器等等。容器可具有消毒通道口，如具有能用皮下注射器针头刺穿的塞子的小瓶。其他容器可具有用可易于移走的隔膜分隔开并通过移走该隔膜而将组分进行混合的两个隔间。可移走的隔膜可以是玻璃、塑料、橡胶等。
试剂盒还可包含其他试剂和对检测靶标标辅因子或效应子有用的物品。试剂可包括含有已知量辅因子或效应子的标准溶液、稀释剂和其他缓冲剂、预处理试剂等。可作为部件提供的其他物品包括垫片(backing)(用于直观化聚集坍塌(break down))，如TLC硅石板；微孔材料，注射器、吸液管、比色杯以及容器。可提供指示各种聚集态的粒子出现的标准图表，其对应所检测的不同量的辅因子或效应子的存在。
提供的试剂盒还可具有说明材料。说明书可以是印刷在纸或其他基材上，和/或可以以电子可读介质，如软盘、CD-ROM、DVD-ROM、Zip盘、录像带、录音磁带等。详细说明可以不与试剂盒实体结合；替代地，用户可从试剂盒的生产商或销售商指定的因特网站得到指导或以电子邮件提供。
实施例实施例1 比色Pb2+生物检测器多核苷酸和试剂所有多核苷酸从联合(Integrated)DNA技术公司(Coralville，IA)购买。腺苷和其他核苷从Sigma-Aldrich(St.Louis，MO)公司购买。制备35nm直径的金粒子并连接3’-和5’-硫醇修饰的12-merDNA(Storhoff et al.1998)。基质和酶用HPLC进行提纯。
金粒子的制备和功能化35nm直径的金粒子通过用柠檬酸钠还原HAuCl4而制备。制备过程使用的玻璃器皿浸泡在王水中并用微孔过滤水彻底冲洗。在250mL的两颈烧瓶中，在搅拌下将200mL 0.3mM的HAuCl4加热至回流。然后加入2mL 38.8mM的柠檬酸钠。在几分钟内，颜色从浅黄色变为深红色。在颜色变化后，使系统再回流半个小时以使还原反应完成。接着将系统缓慢冷却至室温，并用派热克斯玻璃漏斗(Pyrex funnel)过滤粒子。将粒子利用透射电子显微镜法(TEM)在JEOL 2010电子显微镜上进行表征，并确定大小为35±6nm。大多数粒子呈球形，少部分粒子呈纵横比小于2的棒状。金胶体在532nm具有～1的消光峰(extinction peak)，并且在假设所有粒子为具有35nm半径的球体、所有HAuCl4都发生反应以及粒子的密度与块状金的密度一样下，计算的浓度为约0.23nM。这给出在532nm处的消光系数为4.4×109M-1cm-1。
具有3’-和5’-硫醇修饰的DNA的粒子的功能化硫醇修饰的DNA通过与50mM二硫苏糖醇(DTT)孵育而活化。通常，60μL的1mM DNA与60μL的100mM DTT在室温(20-22℃)下孵育2小时。然后将混合物置于Sep-Pak C18柱上以除去DTT。用10mL 95％的CH3CN；10mL的CH3CN、甲醇和水以1∶1∶1体积比的混合物；20mL的水和10mL的2M NH4OAc处理该柱。然后将DNA和DTT的混合物装入柱中。用20mL的去离子水冲走DTT，而用1mL 95％的CH3CN；10mL的CH3CN、甲醇和水以1∶1∶1体积的混合物洗提DNA。将洗提后的DNA加入到12mL的金粒子(0.23nM)中。在孵育1天后，加入1.4mL含有1M NaCl和0.1MTris-乙酸酯(TA)的缓冲溶液。再次培养2天后，通过在8000rpm下离心10分钟收集粒子。除去上清液，并将DNA-功能化的粒子再分散到25mM的TA缓冲液，pH值7.2，100mM的NaCl中。该过程重复三次，以确保除去游离DNA；最后，将粒子分散在同样的缓冲液中并将532nm处的消光系数调整为～2.2(对应于～0.5nM的浓度)。
粒子通过DNA酶的聚集在典型的实验中，将浓度都在～0.5nM的20μL的3’-硫醇修饰的和20μL的5’-硫醇修饰的DNA功能化的金粒子进行混合。加入NaCl、酶(17E)和Pb2+，并加入基质后将最终体积调整为100μL。通过加入基质链引发聚集，并在Hewlett-Packard 8453分光光度计上检测消光。除了pH依赖性研究外，缓冲液对所有的实验为pH值7.2的TA。对所有样品，控制在基质加入至第一光谱检测之间的时间为15秒钟。
在图4所示的实验中，将消光率标准化以便更好地进行比较。这些实验使用2μM的酶，基质浓度对13nm的粒子为160nM、对13nm-35nm的混合粒子为120nM以及对35nm-35nm的粒子为3nM。缓冲液为pH7.2、25mM的TA。
新Pb2+检测系统的优化(f)聚集10分钟后的消光率。
35nm的金粒子聚集后可观察到明显的红色到蓝色的颜色变化，因此，聚集过程可方便地通过紫外-可见光谱进行检测。图6A示出了具有3nM的连接基质、250mM的NaCl、以及1μM的酶(17E)的新检测系统在加入基质链后的不同时间点的几个光谱。在加入基质链之前，该系统显示出在532nm处具有消光峰的红色，相比于13nm直径的粒子，其有10nm的红色移动。在开始的3分钟内，颜色变化非常小。在这期间，认为基质链与酶链进行碱基配对，并且杂合的DNA酶连接到金粒子。在接下来的几分钟内，颜色变化的速率非常块，表明粒子发生交联而形成较大的聚集。随着聚集的形成，在532nm处的消光峰降低，同时在700nm区内增加，形成红色到蓝色的颜色过渡。经过10分钟后，聚集开始沉淀，导致在所有波长观察到的消光降低。为了使样品制备和粒子的浓度之间差异的影响减到最小，利用532nm和700nm处的消光率来检测颜色变化的速率，具有与红色有关的比率更高，而与蓝色有关的比率更低。
图6B示出了在存在不同浓度的基质下颜色变化的速率。基质浓度越高产生的颜色变化速率越高。因此，基质浓度降低导致在设定时间的“更少的蓝色”或“更多的红色”。不同Pb2+浓度以不同速率裂解基质，因此，通过观察由检测器显示的颜色，就可以检测Pb2+并进行量化。利用3nM的基质、250mM的NaCl和1μM的17E进行实验。
影响聚集的其他因素如上所述，可找到影响粒子聚集速率的其他因素，如酶浓度、盐浓度以及pH值。图6C中所示的实验都是用3nM的基质浓度和1μM的17E酶浓度以及变化的NaCl浓度进行的。越高的NaCl浓度有利于聚集，可能因为NaCl降低带负电的DNA的负电荷之间的静电排斥作用。
酶浓度也对粒子聚集有显著的影响。图6D中所示的实验都是用0.3nM的基质浓度和250mM的NaCl浓度以及变化的17E酶浓度进行的。越高的酶链浓度产生更快的聚集速率。在没有酶存在或当酶浓度非常低的情形下(图6D，最上端的曲线)，聚集被抑制。尽管实体地只有基质链用作连接子以组合粒子，但是酶链的存在表现出是任意的。根据这些观察，假设聚集的第一步是基质链杂合到酶链。接着杂合的DNA酶可组合金粒子。在不存在酶链的情形下，基质通过其本身可能是太松软而不能组合金粒子。
不同pH值也影响聚集。如图6E所示，从pH 5.2到pH 10.2(pH5.2的乙酸酯(盐)缓冲液，pH 6.2的MES缓冲液，pH 7.2-10.2的TA缓冲液)，所有样品得到S形曲线，其为室温(20-22℃)下金粒子的DNA酶定向组合的特性。对于pH 5.2的样品，粒子的聚集表现为被抑制。聚集10分钟后对消光率进行绘图并表示在图6F中。从pH 7.2到9.2，观察到了类似的消光性，表明了聚集的相似速率，但聚集速率对越高和越低的pH值都降低。因此检测器可在从约6.2到约10.2的pH值范围内使用，在从约pH7.2到约9.2的pH值范围内具有最佳性能。粒子聚集速率的变化可能是由于DNA碱基在较低或较高pH值处的质子化和去质子化作用，这影响碱基配对，因此导致聚集速率的变化。
室温下的聚集对具有不同Pb2+浓度的新检测器在室温(20-22℃)下的聚集动力学用紫外-可见光谱法进行检测。假设在存在Pb2+下，在基质杂合到酶链之后，基质链可以由酶链裂解或者成为组合粒子的连接子。两个过程的相对速率依赖于Pb2+的浓度。如图7A所示，当Pb2+浓度增大时，聚集的速率被抑制。对于没有加入Pb2+的样品，聚集在10分钟后几乎完成。将在10分钟的消光率用来量化Pb2+的浓度(图7B)。
实施例2 比色腺苷生物检测器粒子通过适配酶的聚集为了确定基质链对基于适配酶的检测器的最佳浓度，将20μL的每种粒子溶液(E532＝2.2)进行混合，并加入腺苷-连接子直至最终浓度为5μM、最终浓度为250mM的NaCl，并在加入基质后将体积调整为100μL。溶液在25mM、pH7.2的TA缓冲液中。
使用该溶液制备第二溶液，其具有最终浓度为0.15μM的基质链、3μM的酶和调节子链、5mM的腺苷、250mM的NaCl以及25mMpH7.2的TA缓冲液。将98μL的第二溶液转移到反应管中并将此时设为O点。将2μL的金属离子储备溶液加入到反应管中，以引发裂解反应，并且在不同时间点将2μL的等分溶液转入检测管。一旦每个等分溶液从反应管转移到检测管，则通过在检测管中加入EDTA淬灭裂解反应。取自反应管的2μL的等分溶液含有0.3pmol基质，并且如果不发生裂解，则将在检测管中给出3nM的基质浓度。在反应管中的每个样品的消光光谱在将等分溶液从反应管转移后20分钟进行检测。
为了检测检测器的灵敏度和选择性，预备具有不同腺苷或其他核苷浓度的不同反应管。在孵育30分钟后，将2μL的等分溶液转移到检测管，并在孵育20分钟后测量检测管的消光光谱。
图9A示出了基质浓度依赖性的粒子聚集，其通过聚集20分钟后消光光谱进行检测。图9B示出了基质被适配酶裂解的动力学。图9C示出了用于腺苷的新设计的基于适配酶的检测器的灵敏度和选择性。粉红、红色以及蓝色圆点分别为5mM胞苷、鸟苷和尿苷的消光率。
参考文献(表3B的参考文献独立地在下面列出)Allara D，Nuzzo R.(1985)Spontaneously organized molecular assemblies.1.Formation，dynamics and physical properties of n-alkanoic acids adsorbedfrom solution on an oxidized aluminum surface.Langmuir 145-52.
Beebe T，Rabke-Clemmer C，(1995)Thiol labeling of DNA for attachment to goldsurfaces.Patent No.5,472,881 USA.
Biroccio A，Hamm J，Incitti I，De Francesco R，Tomei L.(2002)Selection of RNAaptamers that are specific and high-affinity ligands of the hepatitis C virusRNA-dependent RNA polymerase.J Virol 763688-3696.
Breaker RR，Joyce GF，Breaker RR，Joyce GF.(1995)A DNA enzyme withMg(2+)-dependent RNA phosphoesterase activity.；A DNA enzyme thatcleaves RNA.Chem Biol；Chem Biol 2；1223-229.
Breaker RR，Joyce GF.(1994)A DNA enzyme that cleaves RNA.Chem Biol 1223-229.
Breaker RR.(2002)Engineered allosteric ribozymes as biosensor components.Curr Opin Biotechnol 1331-39.
Brody EN，Gold L.(2000)Aptamers as therapeutic and diagnostic agents.JBiotechnol 745-13.
Brown A，Pavot C，Li J，Lu Y.A lead-dependent DNAzyme with a two-stepmechanism.submitted.
Bruno JG，Kiel JL.(1999)In vitro selection of DNA aptamers to anthrax sporeswith electrochemilumirescence detection.Biosens Bioelectron 14457-464.
Bruno JG，Kiel JL.(2002)Use of magnetic beads in selection and detection ofbiotoxin aptamers by electrochemiluminescence and enzymatic methods.Biotechniques 32178-80，182-3.
Cadwell RC，Joyce GF.(1992)Randomization of genes by PCR mutagenesis.PCR Methods Appl 228-33.
Cadwell RC，Joyce GF.(1994)Mutagenic PCR.PCR Methods Appl 3S136-40.Cao Y，Jin R，Mirkin CA.(2001)DNA-modified core-shell Ag/Au particles.J AmChem Soc 1237961-7962.
Carmi N，Shultz LA，Breaker RR.(1996)In vitro selection of self-cleaving DNAs.Chem Biol31039-1046.
Chaloin L，Lehmann MJ，Sczakiel G，Restle T.(2002)Endogenous expression ofa high-affinity pseudoknot RNA aptamer suppresses replication of HIV-1.Nucleic Acids Res304001-4008.
Chapman KB，Szostak JW.(1994)In vitro selection of catalytic RNAs.Curr OpinStruct Biol 4618-622.
Ciesiolka J，Gorski J，Yarus M.(1995)Selection of an RNA domain that bindsZn2+.RNA 1538-550.
Conaty J，Hendry P，Lockett T.(1999)Selected classes of minimisedhammerhead ribozyme have very high cleavage rates at low Mg2+concentration.Nucleic Acids Res272400-2407.
Conn M，Prudent J，Schultz P.(1996)Porphyrin Metallation Catalyzed by a SmallRNA Molecule.J Am Chem Soc 1187012-7013.
Cuenoud B，Szostak JW.(1995)A DNA metalloenzyme with DNA ligase activity.Nature 375611-614.
Dai X，De Mesmaeker A，Joyce G F.(1995)Cleavage of an amide bond by aribozyme.Science 267237-240.
Earnshaw，Gait.(1998)Modified oligoribonucleotides as site-specific probes ofRNA structure and function.Biopolymers 4839-55.
Ekland EH，Bartel DP.(1996)RNA-catalysed RNA polymerization usingnucleoside triphosphates.Nature 382373-376.
Ekland EH，Szostak JW，Bartel DP.(1995)Structurally complex and highly activeRNA ligases derived from random RNA sequences.Science 269364-370.
Ellington AD，Szostak JW.(1990)In vitro selection of RNA molecules that bindspecific ligands.Nature 346818-822.
Faulhammer D，Famulok M.(1997)Angew Chem Int Ed Engl 352837-2841.
Geyer CR，Sen D.(1997)Evidence for the metal-cofactor independence of anRNA phosphodiester-cleaving DNA enzyme.Chem Biol 4579-593.
Grabar K，Freeman R，Hommer M，Natan M.(1995)Preparation andcharacterization of Au colloid Monolayers.Anal.Chem.67735-743.
Hesselberth J，Robertson MP，Jhaveri S，Ellington AD.(2000)In vitro selection ofnucleic acids for diagnostic applications.J Biotechnol 7415-25.
Hofmann HP，Limmer S，Hornung V，Sprinzl M.(1997)Ni2+-binding RNA motifswith an asymmetric purine-rich internal loop and a G-A base pair.RNA 31289-1300.
Huizenga DE，Szostak JW.(1995)A DNA aptamer that binds adenosine andATP.Biochemistry 34656-665.
Iler R.(1979)Chapter 6.Inanonymous(eds)The chemistry of silica.Wiley，NewYork.
Illangasekare M，Yarus M.(1997)Small-molecule-substrate interactions with aself-aminoacylating ribozyme.J Mol Biol 268631-639.
Jayasena SD.(1999)Aptamersan emerging class of molecules that rivalantibodies in diagnostics.Clin Chem 451628-1650.
Jhave ri S，Kirby R，Conrad R，Maglott E，Bowser M，Kennedy R，Glick G，Ellington A.(2000)Designed signaling aptamers that transduce molecularrecognition to changes in fluorescence intensity.J.Am.Chem.Soc.1222469-2473.
Jhaveri S，Rajendran M，Ellington AD.(2000)In vitro selection of signalingaptamers.Nat Biotechnol 181293-1297.
Joyce GF.(1994)In vitro evolution of nucleic acids.Curr Opin Struct Biol 4331-336.
Kiga D，Futamura Y，Sakamoto K，Yokoyama S.(1998)An RNA aptamer to thexanthine/guanine base with a distinctive mode of purine recognition.NucleicAcids Res 261755-1760.
Lauhon CT，Szostak JW.(1995)RNA aptamers that bind flavin and nicotinamideredox cofactors.J Am Chem Soc 1171246-1257.
Li J，Lu Y.(2000)A highly sensitive and selective catalytic DNA biosensor forlead ions.J Am Chem Soc 12210466-10467.
Li J，Zheng W，Kwon AH，Lu Y.(2000)In vitro selection and characterization of ahighly efficient Zn(II)-dependent RNA-cleaving deoxyribozyme.NucleicAcids Res 28481-488.
Li Y，Breaker RR.(1999)Phosphorylating DNA with DNA.Proc Natl Acad Sci US A 962746-2751.
Li Y，Sen D.(1996)A catalytic DNA for porphyrin metallation.Nat Struct Biol 3743-7.
Link S，Wang Z，EI-Sayed M.(1999)Alloy formation of gold-silver particles andthe dependence of the plasmon absorption on their compositions.J PhysChem B 1033529-3533.
Lohse PA，Szostak JW.(1996)Ribozyme-catalysed amino-acid transferreactions.Nature 381442-444.
Lorsch JR，Szostak JW.(1994)In vitro evolution of new ribozymes withpolynucleotide kinase activity.Nature 37131-36.
Lu Y.(2002)New transition-metal-dependent DNAzymes as efficientendonucleases and as selectiye metal biosensors.Chemistry 84589-4596
Lu Y，Liu J，SIMPLECATALYTICDNABIOSENSORS FOR IONS BASED ONCOLOR CHANGES，Application Serial No.09/605,558，USA.
Maoz R，Sagiv J.(1987)Penetration-controlled reactions in organized monolayerassemblies.1.Aqueous permanganate interaction with monolayer andmultilayer films of long-chain surfactants.Langmuir 31034-1044.
Mirkin CA，Letsinger RL，Mucic RC，Storhoff JJ.(1996)A DNA-based method forrationally assembling particles into macroscopic materials.Nature 382607-609.
Mirkin，C.A.，Letsinger，L.R，Mucic，C.R，Storhoff，J.J，Elghanian R，(2002)Particles having polynucleotides attached thereto and uses therefor.PatentNo.6,361,944 USA.
Mucic R，Herrlein M，Mirkin，C.A.，Letsinger R.(1996)Synthesis andcharacterization of DNA with ferrocenyl groups attached to their 5’-terminiElectrochemical characterization of a redox-active nucleotide monolayer.Chem.Commun.555.
Nuzzo R，Fusco F，Allara D.(1987)Spontaneously organized molecularassemblies，3.Preparation and properties of solution adsorbed monolayersof organic disulfides on gold surfaces.J Am Chem Soc 1092358.
Piccirilli JA，McConnell TS，Zaug AJ，Noller HF，Cech TR.(1992)Aminoacylesterase activity of the Tetrahymena ribozyme.Science 2561420-1424.
Prudent JR，Uno T，Schultz PG.(1994)Expanding the scope of RNA catalysis.Science 2641924-1927.
Rakow NA，Suslick KS.(2000)A colorimetric sensor array for odour visualization.Nature 406710-713.
Robertson MP，Ellington AD.(1999)In vitro selection of an allosteric ribozymethat transduces analytes to amplicons.Nat Biotechnol 1762-66.
Roth A，Breaker RR.(1998)An amino acid as a cofactor for a catalyticpolynucleotide.Proc Natl Acad Sci USA 956027-6031.
Rusconi CP，Scardino E，Layzer J，Pitoc GA，Ortel TL，Monroe D，Sullenger BA.(2002)RNA aptamers as reversible antagonists of coagulation factor IXa.Nature 41990-94.
Santoro SW，Joyce GF.(1997)A general purpose RNA-cleaving DNA enzyme.Proc Natl Acad Sci U S A 944262-4266.
Seetharaman S，Zivarts M，Sudarsan N，Breaker RR.(2001)Immobilized RNAswitches for the analysis of complex chemical and biological mixtures.NatBiotechnol 19336-341.
Shaiu WL，Larson DD，Vesenka J，Henderson E.(1993)Atomic force microscopyof oriented linear DNA molecules labeled with 5nm gold spheres.NucleicAcids Res 2199-103.
Sillén LG，(1964)Stability constants of metal-ion complexes.Edition2d ed.Smith J，Olson D，Armitage B.(1999)Molecular recognition of PNA-containinghybridsSpontaneous assembly of helical cyanine dye aggregates on PNAtemplates.J.Am.Cham.Soc.1212686-2695.
Soriaga M，Hubbard A.(1982)Determination of the orientation of aromaticmolecules adsorbed on platinum electrodesThe influence of soluteconcentration.J Am Chem Soc 104.
Soukup GA，Breaker RR.(2000)Allosteric nucleic acid catalysts.Curr OpinStruct Biol 10318-325.
Stojanovic MN，Landry DW.(2002)Aptamer-based colorimetric probe forcocaine.J Am Chem Soc 1249678-9679.
Storhoff J，Elghanian R，Mucic R，Mirkin C，Letsinger RL.(1998)One-potcolorimetric differentiation of polynucleotides with single base imperfectionsusing gold particle probes.J Am Chem Soc 1201959-1964.
Tang J，Breaker RR.(1997)Rational design of allosteric ribozymes.Chem Biol 4453-459.
Tang J，Breaker RR.(2000)Structural diversity of self-cleaving ribozymes.ProcNatl Acad Sci U S A 975784-5789.
Tarasow TM，Tarasow SL，Eaton BE.(1g97)RNA-catalysed carbon-carbon bondformation.Nature 38954-57.
Timmons，Zisman.(1965)J.Phys.Chem.69984-990.
Tompkins H，Allara D.(1974)The study of the gas-solid interaction of acetic acidwith a cuprous oxide surface using reflection-absorption spectroscopy.J.Colloid and Interface Sci.49410.
Tsang J，Joyce GF.(1996)In vitro evolution of randomized ribozymes.MethodsEnzymol 267410-426.
Tuerk C，Gold L.(1990)Systematic evolution of ligands by exponentialenrichmentRNA ligands to bacteriophage T4 DNA polymerase.Science249505-510.
Vaish NK，Heaton PA，Fedorova O，Eckstein F.(1998)In vitro selection of apurine nucleotide-specific hammerheadlike ribozyme.Proc Natl Acad Sci US A 952158-2162.
Wallace ST，Schroeder R.(1998)In vitro selection and characterization ofstreptomycin-binding RNAsrecognition discrimination between antibiotics.RNA 4112-123.
Wallis MG，Streicher B，Wank H，von Ahsen U，Clodi E，Wallace ST，Famulok M，Schroeder R.(1997)In vitro selection of a viomycin-binding RNApseudoknot.Chem Biol 4357-366.
Wang DY，Lai BH，Sen D.(2002)A general strategy for effector-mediated controlof RNA-cleaving ribozymes and DNA enzymes.J Mol Biol 31833-43.
Wecker M，Smith D，Gold L.(1996)In vitro selection of a novel catalytic RNAcharacterization of a sulfur alkylation reaction and interaction with a smallpeptide.RNA 2982-994.
Whitesides，(1995)Proceedings of the Robert A.Welch Foundation 39thConference On Chemical Research Nanophase Chemistry.，Houston，TX.
Wiegand TW，Janssen RC，Eaton BE.(1997)Selection of RNA amide synthases.Chem Biol 4675-683.
Wilson C，Szostak JW.(1995)In vitro evolution of a self-alkylating ribozyme.Nature 374777-782.
Wilson DS，Szostak JW.(1999)In vitro selection of functional nucleic acids.Annu Rev Biochem 68611-647.
Zhang B，Cech TR.(1997)Peptide bond formation by in vitro selectedribozymes.Nature 39096-100.
Zillmann M，Limauro SE，Goodchild J.(1997)In vitro optimization of truncatedstem-loop II variants of the hammerhead ribozyme for cleavage in lowconcentrations of magnesium under non-turnover conditions.RNA 3734-747.
表3B的参考文献1.Ellington，A.D.& Conrad，R.(1995).Aptamers as potential nucleicacid pharmaceuticals.Biotechnol.Annu.Rev.1185-214.
2.Jayasena，S.D.(1999).Aptamers；an emerging class of moleculesthat rival antibodies in diagnostics.Clin.Chem.(Washington，D.C.)451628-50.
3.Sun，L.Q.，Cairns，M.J.，Saravolac，E.G.，Baker，A.& Gerlach，W.L.(2000).Catalytic nucleic acidsFrom lab to applications.Pharmacol.Rev.52325-47.
4.Hesselberth，J.，Robertson，M.P.，Jhaveri，S.& Ellington，A.D.(2000).In vitro selection of nucleic acids for diagnostic applications.Rev.Mol.Biotechnol.7415-25.
5.Joyce，G.F.(1999).Reactions Catalyzed by RNA and DNAEnzymes.In The RNA World，vol.37(Gesteland，R.F.，Cech，T.R.&Atkins，J.F.，ed.)，pp.687-9，Cold Spring Harbor Laboratory Press，ColdSpring Harbor，New York.
6.Breaker，R.R.(1997).DNA enzymes.Nat.Biotechnol.15427-31.
7.Sen，D.& Geyer，C.R.(1998).DNA enzymes.Curr.Opin.Chem.Biol.2680-7.
8.Breaker，R.R.(1999).Catalytic DNAin training and seekingemployment.Nat.Biotechnol.17422-3.
9.Breaker，R.R.(2000).Making catalytic DNAs.Science(Washington，D.C.)2902095-6.
10.Derose，V.J.(2002).Two Decades of RNA Catalysis.Chemisty &Biology 9961-9.
11.Ellington，A.D.& Szostak，J.W.(1990).In vitro selection of RNAmolecules that bind specific ligands.Nature(London)346818-22.
12.Ellington，A.D.& Szostak，J.W.(1992).Selection in vitro of single-stranded DNA molecules that fold into specific ligand-binding structures.Nature(London)355850-2.
13.Santoro，S.W.& Joyce，G.F.(1997).A general purpose RNA-cleaving DNA enzyme.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.944262-6.
14.Faulhammer，D.& Famulok，M.(1996).The Ca2+ion as a cofactorfor a novel RNA-cleaving deoxyribozyme.Angew.Chem.，Int.Ed.Engl.352837-41.
15.Li，J.，Zheng，W.，Kwon，A.H.& Lu，Y.(2000).In vitro selection andcharacterization of a highly efficient Zn(II)-dependent RNA-cleavingdeoxyribozyme.Nucleic Acids Res.28481-8.
16.Jenison，R.D.，Gill，S.C.，Pardi，A.& Polisky，B.(1994).High-resolution molecular discrimination by RNA.Science(Washington，DC，United States)2631425-9.
17.Santoro，S.W.& Joyce，G.F.(1998).Mechanism and utility of anRNA-cleaving DNA enzyme.Biochemistry 3713330-42.
18.Mannironi，C.，Di Nardo，A.，Fruscoloni，P.& Tocchini-Valentini，G.P.(1997).In vitro selection of dopamine RNA ligands.Biochemistry 369726-34.
19.Sigurdsson，S.T.，Thomson，J.B.& Eckstein，F.(1998).Smallribozymes.Cold Spring Harbor Monogr.Ser.35339-76.
20.Stage-Zimmermann，T.K.& Uhlenbeck，O.C.(1998).Hammerheadribozyme kinetics.RNA 4875-89.
21.Werstuck，G.& Green，M.R.(1998).Controlling gene expression inliving cells through small molecule-RNA interactions.Science(Washington，D.C.)282296-8.
22.Walter，N.G.& Burke，J.M.(1998).The hairpin ribozymestructure，assembly and catalysis.Curr.Opin.Chem.Biol.224-30.
23.Holeman，L.A.，Robinson，S.L.，Szostak，J.W.& Wilson，C.(1998).Isolation and characterization of fluorophore-binding RNA aptamers.Folding Des.3423-31.
24.Wilson，C.& Szostak，J.W.(1998).Isolation of a fluorophore-specific DNA aptamer with weak redox activity.Chem.Biol.5609-17.
25.Pan，T.& Uhlenbeck，O.C.(1992).A small metalloribozyme with atwo-step mechanism.Nature 358560-3.
26.Yang，Q.，Goldstein，I.J.，Mei，H.-Y.& Engelke，D.R.(1998).DNAligands that bind tightly and selectively to cellobiose.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.955462-7.
27.Been，M.D.& Wickham，G.S.(1997).Self-cleaving ribozymes ofhepatitis delta virus RNA.Eur.J.Biochem.247741-53.
28.Tanner，N.K.(1998).Biochemistry of hepatitis delta virus catalyticRNAs.Ribozymes Gene Ther.Cancer.23-38.
29.Famulok，M.& Szostak，J.W.(1992).Stereospecific recognition oftryptophan agarose by in vitro selected RNA.J.Am.Chem.Soc.1143990-1.
30.Cech，T.R.(1993).Structure and mechanism of the large catalyticRNAsgroup I and group II introns and ribonuclease P.In The RNA World(Gesteland，R.F.& Atkins，J.F.，ed.)，pp.239-70，Cold Spring HarborLaboratory Press，Cold Spring Harbor，New York.
31.Cech，T.R.& Herschlag，D.(1996).Group I ribozymessubstraterecognition，catalytic strategies，and comparative mechanistic analysis.Nucleic Acids Mol.Biol.101-17.
32.Famulok，M.(1994).Molecular Recognition of Amino Acids byRNA-AptamersAn L-Citrulline Binding RNA Motif and Its Evolution into anL-Arginine Binder.J.Am.Chem.Soc.1161698-706.
33.Geiger，A.，Burgstaller，P.，Von Der Eltz，H.，Roeder，A.& Famulok，M.(1996).RNA aptamers that bind L-arginine with sub-micromolardissociation constants and high enantioselectivity.Nucleic Acids Res.241029-36.
34.Tao，J.& Frankel，A.D.(1996).Arginine-Binding RNAs ResemblingTAR Identified by in Vitro Selection.Biochemistry 352229-38.
35.Connell，G.J.，Illangesekare，M.& Yarus，M.(1993).Three smallribooligonucleotides with specific arginine sites.Biochemistry 325497-502.
36.Burgstaller，P.，Kochoyan，M.& Famulok，M.(1995).Structuralprobing and damage selection of citrulline-and arginine-specific RNAaptamers identify base positions required for binding.Nucleic Acids Res.234769-76.
37.Nolte，A.，Klussmann，S.，Bald，R.，Erdmann，V.A.& Fuerste，J.P.(1996).Mirror-design of L-oligonucleotide ligands binding to L-arginine.Nature Biotechnology 141116-9.
38.Valadkhan，S.& Manley，J.L.(2001).Splicing-related catalysis byprotein-free snRNAs.Nature(London，United Kingdom)413701-7.
39.Nissen，P.，Hansen，J.，Ban，N.，Moore，P.B.& Steitz，T.A.(2000).The structural basis of ribosome activity in peptide bond synthesis.Science(Washington，D.C.)289920-30.
40.Harada，K.& Frankel，A.D.(1995).Identification of two novelarginine binding DNAs.EMBO J.145798-811.
41.Carmi，N.，Balkhi，H.R.& Breaker，R.R.(1998).Cleaving DNA withDNA.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.952233-7.
42.Majerfeld，I.& Yarus，M.(1994).An RNA pocket for an aliphatichydrophobe.Nat.Struct.Biol.1287-g2.
43.Cuenoud，B.& Szostak，J.W.(1995).A DNA metalloenzyme withDNA ligase activity.Nature 375611-4.
44.Majerfeld，I.& Yarus，M.(1998).IsoleucineRNA sites withassociated coding sequences.Rna 4471-8.
45.Li，Y.& Breaker，R.R.(1999).Phosphorylating DNA with DNA.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.962746-51.
46.Sassanfar，M.& Szostak，J.W.(1993).An RNA motif that bindsATP.Narure(London)364550-3.
47.Burgstaller，P.& Famulok，M.(1994).Isolation of RNA aptamers forbiological cofactors by in vitro selection.Angew.Chem.1061163-6(Seealso Angew.Chem.，Int.Ed.Engl.，994，33(10)，084-7).
48.Burke，D.H.& Gold，L.(1997).RNA aptamers to the adenosinemoiety of S-adenosyl methioninestructural inferences from variations ona theme and the reproducibility of SELEX.Nucleic Acids Res.252020-4.
49.Huizenga，D.E.& Szostak，J.W.(1995).A DNA Aptamer That BindsAdenosine and ATP.Biochemistry 34656-65.
50.Klussmann，S.，Nolte，A.，Bald，R.，Erdmann，V.A.& Fuerste，J.P.(1996).Mirror-image RNA that binds D-adenosine.Nat.Biotechnol.141112-5.
51.Burmeister，J.，Von Kiedrowski，G.& Ellington，A.D.(1997).Cofactor-assisted self-cleavage in DNA libraries with a 3’-’5’-phosphoramidate bond.Angew.Chem.，Int.Ed.Engl.361321-4.
52.Connell，G.J.& Yarus，M.(1994).RNAs with dual specificity anddual RNAs with similar specificity.Science(Washington，D.C.)2641137-41.
53.Li，Y.& Sen，D.(1996).A catalytic DNA for porphyrin metallation.Nat.Struct.Biol.3743-7.
54.Lauhon，C.T.& Szostak，J.W.(1995).RNA aptamers that bindflavin and nicotinamide redox cofactors.J.Am.Chem.Soc.1171246-57.
55.Travascio，P.，Bennet，A.J.，Wang，D.Y.& Sen，D.(1999).Aribozyme and a catalytic DNA with peroxidase activityactive sites versuscofactor-binding sites.Chemistry & Biology 6779-87.
56.Lorsch，J.R.& Szostak，J.W.(1994).In vitro selection of RNAaptamers specific for cyanocobalamin.Biochemistry 33973-82.
57.Rink，S.M.，Shen，J.-C.& Loeb，L.A.(1998).Creation of RNAmolecules that recognize the oxidative lesion 7，8-dihydro-8-hydroxy-2’-deoxyguanosine(8-oxodG)in DNA.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.9511619-24.
58.Haller，A.A.& Sarnow，P.(1997).In vitro selection of a 7-methyl-guanosine binding RNA that inhibits translation of capped mRNAmolecules.Proc.Natl.Acad Sci.U.S.A.948521-6.
59.Kiga，D.，Futamura，Y.，Sakamoto，K.& Yokoyama，S.(1998).AnRNA aptamer to the xanthine/guanine base with a distinctive mode ofpurine recognition.Nucleic Acids Res.261755-60.
60.Lato，S.M.，Boles，A.R.& Ellington，A.D.(1995).In vitro selection ofRNA lectinsUsing combinatorial chemistry to interpret ribozymeevolution.Chem.Biol.2291-303.
61.Wang，Y.，Killian，J.，Hamasa ki，K.& Rando，R.R.(1996).RNAMolecules That Specifically and Stoichiometrically Bind AminoglycosideAntibiotics with High Affinities.Biochemistry 3512338-46.
62.Wallis，M.G.，Von Ahsen，U.，Schroeder，R.& Famulok，M.(1995).A novel RNA motif for neomycin recognition.Chem.Biol.2543-52.
63.Famulok，M.& Huettenhofer，A.(1996).In Vitro Selection Analysisof Neomycin Binding RNAs with a Mutagenized Pool of Variants of the16S rRNA Decoding Region.Biochemistry 354265-70.
64.Wallis，M.G.，Streicher，B.，Wank，H.，Von Ahsen，U.，Clodi，E.，Wallace，S.T.，Famulok，M.& Schroeder，R.(1997).In vitro selection of aviomycin-binding RNA pseudoknot.Chem.Biol.4357-66.
65.Burke，D.H.，Hoffman，D.C.，Brown，A.，Hansen，M.，Pardi，A.&Gold，L.(1997).RNA aptamers to the peptidyl transferase inhibitorchloramphenicol.Chem.Biol.4833-43.
66.Wallace，S.T.& Schroeder，R.(1998).In vitro selection andcharacterization of streptomycin-binding RNAsrecognition discriminationbetween antibiotics.Rna 4112-23.
67.Giver，L.，Bartel，D.P.，Zapp，M.L.，Green，M.R.& Ellington，A.D.(1993).Selection and design of high-affinity RNA ligands for HIV-1 Rev.Gene 13719-24.
68.Giver，L.，Bartel，D.，Zapp，M.，Pawul，A.，Green，M.& Ellington，A.D.(1993).Selective optimization of the Rev-binding element of HIV-1.Nucleic Acids Res.215509-16.
69.Williams，K.P.，Liu，X.-H.，Schumacher，T.N.M.，Lin，H.Y.，Ausiello，D.A.，Kim，P.S.& Bartel，D.P.(1997).Bioactive and nuclease-resistant L-DNA ligand of vasopressin.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.9411285-90.
70.Zimmerman，J.M.& Maher，L.J.，lii(2002).In vivo selection ofspectinomycin-binding RNAs.Nucleic Acids Res.305425-35.
71.Vianini，E.，Palumbo，M.& Gatto，B.(2001).In vitro selection ofDNA aptamers that bind L-tyrosinamide.Bioorganic & MedicinalChemistry 92543-8.
72.Andreola，M.-L.，Pileur，F.，Calmels，C.，Ventura，M.，Tarrago-Litvak，L.，Toulme，J.-J.& Litvak，S.(2001).DNA aptamers selectedagainst the HIV-1 RNase H display in vitro antiviral activity.Biochemistry4010087-94.
73.Fukusaki，E.-I.，Kato，T.，Maeda，H.，Kawazoe，N.，Ito，Y.，Okazawa，A.，Kajiyama，S.-I.& Kobayashi，A.(2000).DNA aptamers thatbind to chitin.Bioorg.Med.Chem.Lett.10423-5.
74.Bock，L.C.，Griffin，L.C.，Latham，J.A.，Vermaas，E.H.& Toole，J.J.(1992).Selection of single-stranded DNA molecules that bind and inhibithuman thrombin.Nature(London)355564-6.
75.Koizumi，M.& Breaker，R.R.(2000).Molecular Recognition ofcAMP by an RNA Aptamer.Biochemistry 398983-92.
76.Kato，T.，Takemura，T.，Yano，K.，Ikebukuro，K.& Karube，I.(2000).In vitro selection of DNA aptamers Which bind to cholic acid.Biochim.Biophys.Acta 149312-8.
77.Okazawa，A.，Maeda，H.，Fukusaki，E.，Katakura，Y.& Kobayashi，A.(2000).In vitro selection of hematoporphyrin binding DNA aptamers.Bioorg.Med.Chem.Lett.102653-6.
78.Kawakami，J.，Imanaka，H.，Yokota，Y.& Sugimoto，N.(2000).Invitro selection of aptamers that act with Zn2+.J.Inorg.Biochem.82197-206.
79.Bruno，J.G.& Kiel，J.L.(1999).In vitro selection of DNA aptamersto anthrax spores with electrochemiluminescence detection.Biosensors &Bioelectronics 14457-64.
序列表<110>LU，YILIU，JUEWEN<120>BIOSENSORS BASED ON DIRECTED ASSEMBLY OF PARTICLES<130>ILL05-041-US<140>10/756,825<141>2004-01-13<160>16<170>patentIn Ver.3.2<210>1<211>33<212>DNA<213>Artificial Sequence<220>
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<220>
<223>Description of Artificial sequencesyntheticoligonucleotide<400>6gagctggagg aaaaagtgag tc 22<210>7<211>43<212>DNA<213>Artificial Sequence<220>
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权利要求
1.一种用于检测效应子或辅因子的检测器系统，包括(a)核酸酶，包括辅因子结合部位和可选的效应子结合部位；(b)用于核酸酶的基质，包括第一多核苷酸；(c)第一组粒子，包括第二多核苷酸，其中所述多核苷酸在3’端连接到所述粒子；以及(d)第二组粒子，包括第三多核苷酸，其中所述多核苷酸在5’端连接到所述粒子；其中，所述第一多核苷酸包括或为至少部分互补于所述第二多核苷酸，并且所述第一多核苷酸包括或为至少部分互补于所述第三多核苷酸。
2.根据权利要求1所述的检测器系统，其中，所述核酸酶包括DNA。
3.根据权利要求2所述的检测器系统，其中，所述第一组粒子和所述第二组粒子包括金。
4.根据权利要求2所述的检测器，其中，所述第一组粒子和所述第二组粒子包括选自由金属、半导体和胶乳组成的组的材料。
5.根据权利要求2所述的检测器，其中，所述效应子或辅因子选自如下的组氮肥、农药、二氧芑、酚类、2，4-二氯苯氧基乙酸、Pb(II)、Hg(II)、As(III)、UO2(II)、Fe(III)、Zn(II)、Cu(II)、Co(II)、葡萄糖、胰岛素、hCG-激素、HIV、HIV蛋白质、炭疽、天花、神经毒气、TNT、DNT、可卡因和抗生素。
6.根据权利要求2所述的检测器，其中所述酶包括具有SEQ ID NO1序列的多核苷酸；以及所述基质包括具有SEQ ID NO2序列的多核苷酸。
7.根据权利要求2所述的检测器，其中所述核酸酶包括具有SEQ ID NO5序列的多核苷酸和具有SEQ ID NO6序列的多核苷酸；以及所述基质包括具有SEQ ID NO4序列的多核苷酸。
8.根据权利要求2所述的检测器，其中所述核酸酶包括具有SEQ ID NO8序列的多核苷酸和具有SEQ ID NO9序列的多核苷酸；以及所述基质包括具有SEQ ID NO7序列的多核苷酸。
9.一种检测效应子或辅因子的方法，包括将权利要求1中所述的检测器与样品进行混合。
10.根据权利要求9所述的方法，进一步包括对所述样品颜色变化进行分析。
11.根据权利要求10所述的方法，其中，所述颜色变化在混合后10分钟至少完成95％。
12.根据权利要求9所述的方法，其中，所述混合在10-45℃的温度下进行。
13.根据权利要求9所述的方法，其中，在所述样品中的分析物的量与聚集的粒子的形成或沉淀成反比例。
14.根据权利要求13所述的方法，其中，所述聚集粒子的形成或沉淀在混合后10分钟完成至少95％。
15.根据权利要求9所述的方法，进一步包括加入选自由Mg(II)、Ca(II)、Zn(II)、Mn(II)、Co(II)和Pb(II)组成的组的离子。
16.根据权利要求9所述的方法，其中，所述样品包括生物样品。
17.一种用于检测效应子或辅因子的检测系统，包括(a)核酸酶，包括辅因子结合部位和可选的效应子结合部位；(b)用于核酸酶的基质，包括第一多核苷酸；(c)第一组粒子，包括第二多核苷酸；以及(d)第二组粒子，包括第三多核苷酸；其中，所述第一多核苷酸包括或为至少部分互补于所述第二多核苷酸，所述第一多核苷酸包括或为至少部分互补于所述第三多核苷酸，以及所述第二组粒子具有至少20nm的直径。
18.根据权利要求17所述的检测系统，其中，所述第二组粒子具有至少30nm的直径。
19.根据权利要求18所述的检测系统，其中，所述核酸酶包括DNA。
20.根据权利要求18所述的检测系统，其中，所述第一组粒子和所述第二组粒子包括金。
21.根据权利要求18所述的检测系统，其中，所述第一组粒子和所述第二组粒子包括选自由金属、半导体和胶乳组成的组的材料。
22.根据权利要求18所述的检测系统，其中，所述效应子或辅因子选自如下的组氮肥、农药、二氧芑、酚类、2，4-二氯苯氧基乙酸、Pb(II)、Hg(II)、As(III)、UO2(II)、Fe(III)、Zn(II)、Cu(II)、Co(II)、葡萄糖、胰岛素、hCG-激素、HIV、HIV蛋白质、炭疽、天花、神经毒气、TNT、DNT、可卡因和抗生素。
23.根据权利要求18所述的检测器，其中所述酶包括具有SEQ ID NO1序列的多核苷酸；以及所述基质包括具有SEQ ID NO2序列的多核苷酸。
24.根据权利要求18所述的检测器，其中所述核酸酶包括具有SEQ ID NO5序列的多核苷酸和具有SEQ ID NO6序列的多核苷酸；以及所述基质包括具有SEQ ID NO4序列的多核苷酸。
25.根据权利要求18所述的检测器，其中所述核酸酶包括具有SEQ ID NO8序列的多核苷酸和具有SEQ ID NO9序列的多核苷酸；以及所述基质包括具有SEQ ID NO7序列的多核苷酸。
26.一种检测效应子或辅因子的方法，包括将权利要求17中所述的检测器与样品进行混合。
27.根据权利要求26所述的方法，进一步包括对所述样品颜色变化进行分析。
28.根据权利要求27所述的方法，其中，所述颜色变化在混合后10分钟为至少完成95％。
29.根据权利要求26所述的方法，其中，所述混合在10-45℃的温度下进行。
30.根据权利要求26所述的方法，其中，在所述样品中的分析物的量与聚集的粒子的形成或沉淀成反比例。
31.根据权利要求26所述的方法，其中，所述聚集粒子的形成或沉淀在混合后10分钟完成95％。
32.根据权利要求30所述的方法，进一步包括加入选自由Mg(II)、Ca(II)、Zn(II)、Mn(II)、Co(II)和Pb(II)组成的组的离子。
33.根据权利要求26所述的方法，其中，所述样品包括生物样品。
34.一种检测样品中效应子或辅因子的方法，包括将至少如下物质混合在一起(a)核酸酶，包括辅因子结合部位和可选的效应子结合部位；(b)用于核酸酶的基质，包括第一多核苷酸；(c)第一组粒子，包括第二多核苷酸；以及(d)第二组粒子，包括第三多核苷酸；以及(e)所述样品；以形成混合物，其中，所述第一多核苷酸包括或为至少部分互补于所述第二多核苷酸，所述第一多核苷酸包括或为至少部分互补于所述第三多核苷酸，以及所述混合物在形成所述混合物10分钟内产生显示所述样品中存在所述效应子或辅因子的颜色变化而无需加热。
35.根据权利要求34所述的方法，其中，所述核酸酶包括DNA。
36.根据权利要求34所述的方法，其中，所述第一组粒子和所述第二组粒子包括金。
37.根据权利要求34所述的方法，其中，所述第一组粒子和所述第二组粒子包括选自由金属、半导体和胶乳组成的组的材料。
38.根据权利要求34所述的方法，其中，所述效应子或辅因子选自如下的组氮肥、农药、二氧芑、酚类、2，4-二氯苯氧基乙酸、Pb(II)、Hg(II)、As(III)、UO2(II)、Fe(III)、Zn(II)、Cu(II)、Co(II)、葡萄糖、胰岛素、hCG-激素、HIV、IIIV蛋白质、炭疽、天花、神经毒气、TNT、DNT、可卡因和抗生素。
39.根据权利要求34所述的方法，其中所述酶包括具有SEQ ID NO1序列的多核苷酸；以及所述基质包括具有SEQ ID NO2序列的多核苷酸。
40.根据权利要求34所述的方法，其中所述核酸酶包括具有SEQ ID NO5序列的多核苷酸和具有SEQ ID NO6序列的多核苷酸；以及所述基质包括具有SEQ ID NO4序列的多核苷酸。
41.根据权利要求34所述的方法，其中所述核酸酶包括具有SEQ ID NO8序列的多核苷酸和具有SEQ ID NO9序列的多核苷酸；以及所述基质包括具有SEQ ID NO7序列的多核苷酸。
全文摘要
本发明涉及一种用于检测效应子和辅因子的检测系统，包括(a)核酸酶；(b)用于核酸酶的基质，包括第一多核苷酸；(c)第一组粒子，包括至少部分互补于该基质的第二多核苷酸，其中该多核苷酸连接于粒子；以及(d)第二组粒子，包括至少部分互补于该基质的第三多核苷酸，其中该多核苷酸在其5’端连接于粒子。
文档编号C12Q1/68GK1910282SQ200580002358
公开日2007年2月7日 申请日期2005年1月12日 优先权日2004年1月13日
发明者陆艺, 刘珏文 申请人:伊利诺斯大学理事会